La somministrazione in vivo di consorzi batterici intestinali replica i metabotipi A e B dell'urolitina in un modello di ratto non produttore di urolitinaⅠ

Per decenni, il consumo di ellagotannini (ET) e acido andellagico (EA) è stato associato a numerosi effetti biologici, tra cui attività antiossidanti, antitumorali, antinfiammatorie, antibatteriche e di replicazione anti-HIV.1 Tuttavia, l'assorbimento e la biodisponibilità degli ET e degli EA sono molto scarsi. Precedenti studi sull'uomo hanno rilevato che l'escrezione urinaria di EA e di un EA-O-glucuronide è inferiore all'1% dell'assunzione.2,3 Tuttavia, sebbene l'assorbimento di ET ed EA sia basso, vengono ulteriormente metabolizzati dal microbiota del colon in urolitine (Uros), che sono responsabili, almeno in parte, degli effetti benefici degli alimenti ricchi di ET e (o) EA.1,4

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Innanzitutto, l'EA viene rilasciato attraverso l'idrolisi dei legami esterei dell'ET da parte dell'enzima noto come ellagitannasi.5 L'EA subisce un'ulteriore degradazione, producendo 6H-dibenzo[b,d]piran-6-un derivato chiamato Uros. Questa cascata di reazioni inizia con la scissione dell'anello lattonico da parte di un enzima lattonasi, risultando in acido luteico, che viene quindi decarbossilato in pentaidrossi-Uro (Uro-M5). La deidrossilazione consecutiva lo converte in tetraidrossi-Uros (Uro-D, Uro-E e Uro-M6) e triidrossi-Uros (Uro-C, UroM7 e Uro-G), per produrre infine diidrossi-Uros (Uro-A e isoUro-A) e monoidrossi-Uro (Uro-B), quest'ultimo generalmente rilevato quando viene prodotto anche isoUro-A.1

L'ampia variazione dei profili metabolici degli Uro rilevati negli esseri umani dopo il consumo di alimenti ricchi di ET indica differenze interindividuali nel microbiota del colon responsabile della degradazione degli ET.6–8 Le numerose possibili interazioni tra i batteri del colon e l'organismo ospitante potrebbero spiegare i diversi destini metabolici della dieta (poli )fenoli.6,9 Questa interazione bidirezionale tra microbiota intestinale e (poli)fenoli ha spinto la comunità scientifica a raggruppare la popolazione in base alla lorofenotipo metabolico (tipo metallico) per spiegare le differenze negli effetti dei polifenoli.10,11 Più specificamente, secondo il metabolismo ET ed EA, gli individui possono essere stratificati in Urometabotipi (UM) associati alla composizione e alla funzionalità del microbioma intestinale.7,8,12

Tre UM umani (UM-A, UM-B e UM-0) correlati a tre diversi profili di produzione di Uro sono stati descritti nelle popolazioni occidentali e orientali.13-15 A questo proposito, gli individui con metabotipo A (UM-A) producono diversi Uro intermedi ma solo urolitina A (Uro-A), il principale Uro assorbito in questo UM, alla fine della via catabolica microbica. Gli individui con metabotipo B (UM-B) producono alcuni Uros intermedi e tre Uros finali, cioè urolitina B (Uro-B), urolitina A (IsoUro-A) e Uro-A, che sono i principali Uros assorbiti nell'UM-B. Pertanto, gli Uros intermedi potrebbero agire principalmente nell'intestino, mentre quelli finali potrebbero avere effetti locali e sistemici.6 Al contrario, gli individui con il tipo di metallo 0 (UM-0) non possono produrre questi Uros finali (solo gli Uros Finora è stato rilevato il precursore Urolitina-M5, che non viene assorbito nell'intestino).

Sono state osservate differenze nei profili urologici tra gli UM e lungo l'intestino crasso, mostrando una produzione predominante di uro nella regione del colon distale.16-19 Sorprendentemente, la percentuale di UM-0 nei volontari sani spagnoli e cinesi è di circa il 10% e potrebbe essere ancora più alta nei volontari sani spagnoli e cinesi. nella popolazione statunitense.13-15 I generi batterici Gordonibacter ed Ellagibacter sono stati identificati come capaci di metabolizzare l'EA in alcuni Uros.20-23Tuttavia, è stato riscontrato che alcuni intermedi (ad esempio Uro-D, Uro-E, Uro- M7 e Uro-G) e gli Uros finali (Uro-A e Uro-B) non sono prodotti in colture pure di questi batteri, il che implica la necessità di altri batteri per completare la serie di Uros che configurano sia UM-A che UM-B . Recentemente sono stati identificati i consorzi intestinali coinvolti nel metabolismo dell'EA per produrre i metabotipi uroproduttori (UM-A e UM-B) in vitro.24

I consorzi batterici contenenti i generi Gordonibacter più Enterocloster ed Ellagibacter più Enterocloster hanno prodotto in vitro le urolitine associate rispettivamente a UM-A e UM-B.25 Tuttavia, la capacità di questi consorzi batterici di replicare i profili Uro umani associati a UM-A e UM-B in vivo è ancora sconosciuto. Inoltre, la sicurezza del consumo di questi batteri produttori di uro come nuovi probiotici è ancora incerta, poiché non è stata precedentemente testata su animali o esseri umani. Nel presente studio, i suddetti consorzi batterici sono stati valutati per la loro capacità di colonizzare l'intestino di ratti non produttori di uro (simili a UM-0-) ​​e di convertirli in uroproduttori che imitano rispettivamente UM-A e UM-B. È stata valutata anche la sicurezza di questi consorzi batterici. Inoltre, sono state sviluppate due nuove procedure basate sulla PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) per rilevare e quantificare Ellagibacter ed Enterocloster in campioni fecali.

Materiali e metodi

Prodotti chimici e reagenti

Gli Uros sono stati sintetizzati chimicamente e purificati da VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Spagna). EA è stata acquistata da Sigma-Aldrich (St Louis, MO,USA). Il tampone fosfato salino (PBS) è stato ottenuto da FisherScientific (USA), mentre metanolo, etanolo e acido formico provenivano da Panreac Química (Barcellona, ​​Spagna). I solventi di grado cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) sono stati acquistati da JT Baker (Deventer, Paesi Bassi). Durante lo studio è stata utilizzata acqua ultrapura Millipore (Bedford, MA, USA). Tutti i prodotti chimici e i reagenti erano di grado analitico.

Preparazione di consorzi batterici

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T e Enterocloster imbullonato CEBASS4A9, tutti isolati e identificati nel nostro laboratorio (CEBAS-CSIC, Spagna), sono stati coltivati ​​in anaerobiosi in 5 mlWilkins -Provette Chalgren con terreno anaerobico (WAM, Oxoid) a 37 gradi per 48 ore nella camera anaerobica Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Galles del Sud, Regno Unito) e risospese in PBS integrato con 10% di glicerolo e 0,05% di L-cisteina cloridrato (PanReac Química, Barcellona,Spagna). Dopo l'incubazione anaerobica, sono stati preparati i consorzi.24,25 In breve, il "consorzio batterico A" conteneva G. ceppi di urolithinfaciens ed E. Bolteae; il "consorzio batterico B" conteneva colture di E. isourolithinifaciens ed E. Bolteae; e il "cocktail di controllo" conteneva PBS sterile con il 10% di glicerolo e lo 0,05% di L-cisteina cloridrato. Prima della somministrazione, tutti i cocktail sono stati distribuiti in aliquote da 3,5 ml e mantenuti a -80 gradi.

Animali, diete e disegno sperimentale

Il protocollo sperimentale (riferimento 624/2020) è stato approvato dal governo locale, dal Comitato di Bioetica del Consiglio Nazionale delle Ricerche spagnolo (Madrid, Spagna) e dal Comitato Etico per la Sperimentazione sugli Animali dell'Università di Murcia (Spagna). Gli esperimenti hanno seguito le raccomandazioni dell'Unione Europea in merito alla sperimentazione animale (Direttiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo e del Consiglio sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici). Ratti Wistar (n=18; 9 femmine e 9 maschi) del peso di 240 ± 31 g sono stati ottenuti da Envigo (Barcellona, ​​Spagna). Questo modello di ratto è stato selezionato in base alla sua incapacità di produrre Uros osservata nei nostri studi preliminari in cui sono stati testati campioni fecali di diversi modelli di ratto. Tre gruppi (A, B e C) sono stati formati assegnando in modo casuale 6 animali ciascuno (3 ratti femmine e 3 ratti maschi ) per gruppo (Fig. 1).

Ciascun gruppo di ratti è stato alloggiato in due gabbie diverse, divise per sesso, in una stanza con ambiente a temperatura controllata (22±2 gradi) con umidità relativa del 55±10% e ciclo luce-buio controllato (12 h). I ratti hanno ricevuto una dieta standard (Teklad, Barcellona, ​​Spagna) contenente (%/100 g di peso fresco) 14,3% di proteine ​​(farina di glutine di mais), 48% di carboidrati (farina di grano, grano macinato, mais macinato) e 4% di grassi (olio di soia). ), densità energetica 2,9 kcal g−1 e 4,1% di fibra grezza, integrata con polvere di EA Purezza superiore o uguale al 95% (3,6 mg per 100 g di cibo). L'EA è stato miscelato in modo omogeneo con mangime standard macinato, ri-pellettato e liofilizzato. La dieta arricchita con EA è stata conservata lontano dall'umidità e dalla luce. La dose di EA somministrata alratti nella dieta era di circa 0,72 mg per ratto al giorno (dieta EA1×), una dose equivalente per l'uomo di 41 mg al giorno − 1,26 Tutti i gruppi sono stati nutriti con la dieta EA 1× e acqua di rubinetto ad libitum durante l'esperimento ( 5 settimane). Poiché l'EA rilevato nei campioni fecali era basso durante la prima settimana, nei giorni successivi è stato aggiunto dell'EA extra. Alla settimana 3, una dose extra di 1,5 mg di EA al giorno per ratto disciolta in acqua è stata somministrata per via orale mediante sonda gastrica agli animali (totale=EA 3× dieta), somministrata solo per 1 settimana. Infine, alla settimana 4, ≈5 g di noci per ratto al giorno (un'altra fonte di EA) sono stati aggiunti alla dieta EA 1× e sono stati mantenuti fino alla fine dello studio per valutare l'impatto dell'EA contenente la matrice alimentare sulla capacità dei batteri per produrre gli Uros. Il peso, il cibo e l'assunzione di acqua venivano misurati ogni giorno. I consorzi batterici intestinali venivano somministrati per via orale mediante sonda gastrica. Il gruppo A ha ricevuto 500 µl di cocktail batterico A, il gruppo B ha ricevuto 500 µl di cocktail batterico B e il gruppo C (controllo) ha ricevuto 500 µl di PBS. La sonda orale è stata eseguita ogni 2 giorni durante le prime due settimane e ogni giorno durante le 2 settimane successive. Nell'ultima settimana (giorni dal 28 al 32), gli animali hanno continuato con la stessa dieta integrata con EA e noci ma senza somministrazione di batteri per via orale. Alla fine dello studio, gli animali sono stati sacrificati utilizzando una camera a CO2.

Procedure di campionamento

Durante lo studio sono stati raccolti campioni fecali per l'analisi dell'Uro mediante UPLC-ESI-QTOF-MS/MS e del microbiota intestinale mediante sequenziamento del gene 16S rRNA e qPCR. Il sangue è stato estratto in momenti diversi (baseline, giorno 28 e fine dello studio) per analisi ematologiche e biochimiche sieriche. Campioni di sangue sono stati ottenuti dalla vena della coda (≈500 µL) e raccolti in provette contenenti eparina al basale e nei giorni 28 e 32 (Fig. 1). La separazione del plasma è stata eseguita immediatamente mediante centrifugazione a 3000 g per 10 minuti a 4 gradi e congelata a - 80 gradi fino all'ulteriore determinazione delle variabili sierobiochimiche. Il fegato, i reni e la milza furono raccolti, pesati ed esaminati per rilevare eventuali differenze morfologiche al momento del sacrificio.

Progettazione e ottimizzazione dei primer e della sonda per la quantificazione di Ellagibacter ed Enterocloster mediante qPCR

Le sequenze dei geni 16S rRNA di Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T ed E. imbullonato CEBAS S4A9 sono state ottenute dal database GenBank (database EMBL). Le sequenze sono state allineate con i generi batterici filogeneticamente vicini utilizzando il software di analisi genetica evolutiva molecolare (MEGA 11) e ispezionate per regioni di sequenze conservate e variabili per progettare i primer e la sonda per rilevare e quantificare Ellagibacter ed Enterocloster (Tabella 1). I primer e la sonda sono stati progettati e convalidati rispettivamente con gli strumenti Primer Questa e Oligo Analyser (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgio). La sonda TaqMan è stata etichettata alle estremità 5' e 3' con un gruppo 6-carbossi-fluoresceina (6FAM) e un dissetante alle more (BBQ), rispettivamente. La qPCR è stata eseguita utilizzando un sistema di rilevamento della sequenza ABI 7500. Le concentrazioni finali di ciascun primer e sonda erano 300 e 375 nM per Ellagibacter e 200 e 500 nM per Enterocloster. È stato effettuato un protocollo qPCR convenzionale per l'amplificazione del DNA di Ellagibacter eEnterocloster, rispettivamente. Il profilo di rampa per l'amplificazione dell'Ellagibacter era di 1 ciclo a 95 gradi per 5 minuti, seguito da 45 cicli a 95 gradi per 15 s, 50 gradi per 40 s e 72 gradi per 31 s. Infine, è stato aggiunto 1 ciclo a 72 gradi per 5 minuti . Il profilo di rampa per l'amplificazione di Enterocloster era di 1 ciclo a 95 gradi per 5 minuti, seguito da 40 cicli a 95 gradi per 15 s, 65 gradi per 40 s e 72 gradi per 31 s. Infine è stato aggiunto 1 ciclo a 72 gradi per 5 minuti.

Estrazione del DNA fecale e analisi microbica intestinale

L'estrazione del DNA da campioni fecali è stata eseguita con il kit di purificazione del DNA tissutale NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Germania), secondo le istruzioni del produttore con alcune modifiche. Il DNA è stato quantificato mediante fluorimetria (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, Regno Unito) e la purezza è stata misurata dal rapporto di assorbanza a una lunghezza d'onda di 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, Regno Unito ). La composizione del microbiota intestinale è stata determinata sequenziando le regioni variabili V3 e V4 del gene 16S rRNA seguendo i protocolli Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) con una lunghezza di lettura di 2 × 300 bp coppia-end (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Il sequenziamento metagenomico è stato eseguito su una piattaforma MiSeq-Illumina (servizio di sequenziamento FISABIO, Spagna). L'elaborazione dei dati, la rimozione della sequenza chimerica, l'allineamento della sequenza e il clustering della sequenza del gene 16S rRNA sono stati eseguiti come descritto altrove per ottenere la classificazione tassonomica.8,27 L'amplificazione del DNA di Gordonibacter è stata ottenuta in un sistema qPCR ABI 7500 come descritto in precedenza.19,28 Enterocloster ed Ellagibacter- primer e sonde specifici progettati nel presente studio sono stati utilizzati seguendo il protocollo qPCR descritto sopra. Per la quantificazione sono state utilizzate le curve standard del DNA genomico di Gordonibacter, Enterocloster ed Ellagibacter. Tutti i campioni fecali sono stati analizzati in triplicato.

Estrazione, rilevamento e quantificazione delle urolitine nei campioni fecali

I campioni fecali ({{0}},2–0,5 g) sono stati estratti, in proporzione 1: 10, con una soluzione di MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), acidificato con 0,1% HCl e omogeneizzato mediante vortex per 2 minuti e agitazione a 1500 giri/min a temperatura ambiente per 10 minuti in un riscaldatore monoblocco. La sospensione è stata centrifugata a 14 000g a 4 gradi per 10 minuti e il surnatante è stato filtrato attraverso un filtro a membrana in PVDF da 0,22 µm (Millipore Corp., Bedford, MA) e diluito 3 volte con MeOH (acido formico allo 0,1% ) prima dell'iniezione in un sistema UPLC-ESI-QTOF-MS. Un sistema UPLC (Agilent 1290Infinity) accoppiato a un sistema LC/MS quadrupolo a tempo di volo (QTOF) (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania) è stato utilizzato per analizzare i metaboliti fecali utilizzando un metodo di eluizione tramite gradiente come descritto in precedenza .29,30 In breve, la separazione è stata effettuata in una colonna a fase inversa Poroshell 120 EC-C18, utilizzando acqua e acetotonitrile, entrambi acidificati con acido formico allo 0,1%, come fasi mobili. La portata era di 0,4 mL min−1 e il volume di iniezione era di 5 µL. Per l'elaborazione dei dati è stato utilizzato il software MassHunter Qualitative Analysis (versione B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Germania). Tutti i metaboliti sono stati identificati mediante confronto diretto con gli standard e confermati dalla loro massa molecolare. Sono state ottenute curve di calibrazione per EA e i diversi Uros con buona linearità (R2 > 0,99).

Ematologia e chimica clinica

Le variabili ematologiche sono state determinate nel sangue eparinizzato utilizzando un analizzatore ematologico automatizzato con software specifico per campioni di sangue di ratto (AVDIA 120, Siemens, Monaco, Germania). Le variabili analizzate erano volume corpuscolare medio (MCV), emoglobina corpuscolare media (MCH), concentrazione media di emoglobina corpuscolare (MCHC), distribuzione eritrocitaria (RDW), volume piastrinico medio (MPV), crito piastrinico (PCT), ampiezza della distribuzione piastrinica (PDW). , componente piastrinica media (MPC), massa piastrinica media (MPM), conta piastrinica (PLT), contenuto di emoglobina reticolocitaria (CHr) e volume corpuscolare reticolocitario medio (MCVr). Le variabili biochimiche del plasma, calcio (Ca) e fosforo (P) sono state analizzate utilizzando un analizzatore chimico e tossicologico Olympus AU400 (Beckman Coulter, California, USA). Le variabili biochimiche erano proteine ​​totali (PROT), albumina (ALBU), globulina (GLOB), creatinina (CREA), glucosio (GLUC), colesterolo (CHOL), trigliceridi (TRIGL), fosfatasi alcalina (ALP), gamma-glutamil transpeptidasi ( GGT), aspartato aminotransferasi (AST) e alanina aminotransferasi (ALT). Infine, i livelli di tiroxina (T4) sono stati analizzati utilizzando un sistema di dosaggio immunologico IMMULITE® 1000 (Siemens).

analisi statistica

I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD). L'analisi statistica è stata eseguita con la versione 27 del software SPSS.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) e le differenze con p < 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi. La normalità dei dati è stata valutata con il test di Shapiro-Wilk. I confronti tra i diversi gruppi di trattamento sono stati effettuati utilizzando l'analisi della varianza misurata ripetuta (RM ANOVA) con il test post hoc T3 di Tukey o Dunnett, a seconda che i dati seguissero rispettivamente una distribuzione normale o non normale. Le differenze tra maschi e femmine sono state esplorate utilizzando il test t di Student per dati appaiati o il test dei ranghi con segno di Wilcoxon quando i dati erano distribuiti normalmente o non normalmente, rispettivamente. L'analisi discriminante lineare chi-quadrato (LEfSe) è stata utilizzata per rilevare caratteristiche batteriche differenziali tra i gruppi. La correlazione di Pearson è stata utilizzata per analizzare le possibili associazioni tra variabili nei dati con distribuzione normale, mentre la correlazione di Spearman è stata applicata nei dati con distribuzione non normale. I grafici dei dati sono stati eseguiti utilizzando Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA).

Medicina naturale a base di erbe per alleviare la stitichezza-cistanche

Cistanche è un genere di piante parassite che appartiene alla famiglia delle Orobanchaceae. Queste piante sono note per le loro proprietà medicinali e vengono utilizzate da secoli nella medicina tradizionale cinese (MTC). Le specie Cistanche si trovano prevalentemente nelle regioni aride e desertiche della Cina, della Mongolia e di altre parti dell'Asia centrale. Le piante di Cistanche sono caratterizzate dai loro steli carnosi e giallastri e sono molto apprezzate per i loro potenziali benefici per la salute. Nella MTC, si ritiene che la Cistanche abbia proprietà toniche ed è comunemente usata per nutrire i reni, aumentare la vitalità e supportare la funzione sessuale. Viene anche utilizzato per affrontare i problemi di invecchiamento, affaticamento e benessere generale. Sebbene la Cistanche abbia una lunga storia di utilizzo nella medicina tradizionale, la ricerca scientifica sulla sua efficacia e sicurezza è continua e limitata. Tuttavia, contiene vari composti bioattivi come glicosidi feniletanoidi, iridoidi, lignani e polisaccaridi, che possono contribuire ai suoi effetti medicinali.

Wecistanche'spolvere di cistanza, compresse di cistanza, capsule di cistanza,e altri prodotti vengono sviluppati utilizzandodesertocistanocome materie prime, che hanno tutte un buon effetto sull'alleviare la stitichezza. Il meccanismo specifico è il seguente: si ritiene che la Cistanche abbia potenziali benefici per alleviare la stitichezza in base al suo uso tradizionale e ad alcuni composti che contiene. Sebbene la ricerca scientifica specifica sugli effetti della Cistanche sulla stitichezza sia limitata, si ritiene che abbia molteplici meccanismi che potrebbero contribuire al suo potenziale per alleviare la stitichezza. Effetto lassativo:Cistancheè stato a lungo utilizzato nella medicina tradizionale cinese come rimedio contro la stitichezza. Si ritiene che abbia un lieve effetto lassativo, che può aiutare a favorire i movimenti intestinali e indurre la stitichezza. Questo effetto può essere attribuito a vari composti presenti nelle Cistanche, come i glicosidi feniletanoidi e i polisaccaridi. Inumidire l'intestino: in base all'uso tradizionale, si ritiene che la Cistanche abbia proprietà idratanti, mirate specificamente all'intestino. Promuovere l'idratazione e la lubrificazione dell'intestino può aiutare ad ammorbidire gli organi e facilitare il passaggio, alleviando così la stitichezza. Effetto antinfiammatorio: la stitichezza può talvolta essere associata ad un'infiammazione del tratto digestivo. Cistanche contiene alcuni composti, tra cui glicosidi feniletanoidi e lignani, che si ritiene abbiano proprietà antinfiammatorie. Riducendo l’infiammazione nell’intestino, può aiutare a migliorare la regolarità del movimento intestinale e ad alleviare la stitichezza.