Induzione dell'immunità della mucosa mediante somministrazione polmonare di una nanoparticella mirata alle cellule

ASTRATTO

In precedenza abbiamo scoperto che una nanoparticella costruita con un antigene, benzalconio cloruro (BK) e acido c-poliglutammico (c-PGA) mostrava un'elevata induzione immunitaria di tipo Th1 e Th2- dopo somministrazione sottocutanea. Per la profilassi delle infezioni respiratorie, tuttavia, dovrebbe essere indotta l'immunità della mucosa. In questo studio, abbiamo studiato l'effetto della somministrazione polmonare di una nanoparticella comprendente ovoalbumina (OVA) come antigene modello, BK e c-PGA sull'induzione dell'immunità della mucosa nei polmoni e nel siero.

Il complesso è stato fortemente occupato dalle celle RAW264.7 e DC2.4. Dopo la somministrazione polmonare, la ritenzione polmonare era più lunga per il complesso OVA/BK/c-PGA rispetto al solo OVA. L'immunoglobulina sierica specifica per OVA (Ig) G è stata altamente indotta dal complesso. Livelli elevati di IgG e IgA sono stati indotti anche nel fluido di lavaggio broncoalveolare e in vivo non sono state osservate tossicità. In conclusione, abbiamo indotto in modo efficace e sicuro l'immunità della mucosa mediante somministrazione polmonare di un complesso OVA/BK/c-PGA.

Negli ultimi anni, sempre più studi hanno dimostrato che l'immunità della mucosa svolge un ruolo importante nel sistema immunitario del corpo. L'immunità delle mucose si riferisce al sistema immunitario basato sulla membrana mucosa nel corpo umano e le sue capacità di difesa sono principalmente mirate all'invasione di agenti patogeni nelle mucose umane come il tratto respiratorio, il tratto digestivo e il tratto riproduttivo.

L'immunità mucosa di per sé non rende il corpo più immune, ma può aiutare il nostro corpo ad affrontare l'invasione di agenti patogeni estranei in modo più efficace. Stimolando continuamente l'immunità della mucosa, il nostro corpo produce più anticorpi, il che aumenta la nostra immunità.

Quindi, come può essere stimolata l'immunità della mucosa? Ecco alcuni suggerimenti:

1. Prendi abbastanza vitamina C. La vitamina C è un antiossidante naturale che aumenta la funzione delle cellule immunitarie, che aiuta a combattere le infezioni. Frutta e verdure a foglia verde come limoni, arance e fragole sono ricche di vitamina C.

2. Aumentare l'assunzione di batteri lattici. I batteri dell'acido lattico possono favorire l'equilibrio della flora intestinale e inibire la crescita di batteri nocivi. I comuni alimenti a base di batteri lattici includono yogurt, crauti, kimchi, ecc.

3. Esercitati a respirare Respiri profondi. La respirazione profonda aumenta l'apporto di ossigeno e la ventilazione ai polmoni, il che può aiutare a rimuovere i patogeni accumulati dai polmoni.

In breve, stimolare l'immunità della mucosa è un mezzo importante per migliorare l'immunità. Dovremmo fare del nostro meglio per migliorare la nostra immunità delle mucose attraverso la dieta e le abitudini di vita, per proteggere la nostra salute. Da questo punto di vista, dobbiamo migliorare l'immunità. Cistanche può migliorare significativamente l'immunità perché la cenere di carne contiene una varietà di componenti biologicamente attivi, come polisaccaridi, due funghi e Huang Li, che possono stimolare il sistema immunitario. Vari tipi di cellule, aumentano la loro attività immunitaria.

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1. Introduzione

Le infezioni respiratorie acute sono quasi certamente la principale causa di morte tra i bambini < 5 anni nei paesi in via di sviluppo (Williams et al., 2002). Diversi vaccini, come quelli per influenza, pertosse e pneumococco, sono stati sviluppati per le infezioni respiratorie (White, 1988; Pittman, 1991; Chen et al., 2020). La maggior parte di questi vaccini viene somministrata per via intramuscolare e sottocutanea, che potrebbe effettivamente indurre l'immunoglobulina sierica (Ig) G. Tuttavia, altre vie sono più utili per stimolare l'immunità della mucosa per prevenire le infezioni respiratorie acute. È stato riportato che le somministrazioni mucose, come quelle intranasali e polmonari, inducono efficacemente le IgA della mucosa e prevengono le infezioni respiratorie (Giri et al., 2005; Ainai et al., 2017).

D'altra parte, i vaccini per somministrazione intranasale e polmonare non dovrebbero contenere adiuvanti che sono stati segnalati come causa di reazioni infiammatorie e ulcerazioni nel sito di somministrazione (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). Un altro approccio per migliorare l'efficacia dei vaccini senza adiuvanti è quello di sviluppare un sistema in grado di fornire efficacemente i vaccini nelle cellule presentanti l'antigene della mucosa (APC).

In uno studio precedente, abbiamo sviluppato un nuovo vettore di somministrazione del vaccino costruito con un antigene, benzalconio cloruro (BK) e acido c-poliglutammico (c-PGA). Un complesso comprendente ovoalbumina (OVA) come antigene modello, BK e c-PGA (complesso OVA/BK/c-PGA) ha effettivamente consegnato OVA nelle cellule dendritiche e migliorato l'induzione di IgG sieriche specifiche per OVA dopo somministrazione sottocutanea nei topi (Kurosaki et al. ., 2012). Il presente studio mirava a indagare l'effetto della somministrazione polmonare di un complesso OVA/BK/c-PGA sull'induzione dell'immunità della mucosa nei polmoni e nel siero.

2. Materiali e metodi

2.1. Sostanze chimiche

OVA è stato acquistato da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). BK è stato ottenuto da Nacalai Tesque, Inc. (Kyoto, Giappone). Il c-PGA è stato fornito da Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Giappone). L'OVA marcato con isotiocianato di fluoresceina (FITC-OVA) e l'OVA marcato con Alexa Fluor 647- (Alexa647- OVA) sono stati ottenuti da Invitrogen (Carls, CA, USA). Il siero bovino fetale (FBS) è stato acquistato da Biological Industries Ltd. (Kibbutz Beit Haemek, Israele). OPTI-MEM I è stato ottenuto da GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA) e una soluzione antibiotica premiscelata contenente penicillina, streptomicina e L-glutammina è stata ottenuta da Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Giappone). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) e il mezzo RPMI1640 sono stati ottenuti da Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokyo, Giappone).

2.2. Preparazione complessa

In precedenza, abbiamo costruito un complesso OVA/BK/c-PGA con un rapporto di peso di 1:0.2:0.2 (Kurosaki et al., 2012). Per preparare il complesso OVA/BK, una quantità appropriata di soluzione BK (pH 5.0) sciolta in glucosio al 5% è stata miscelata con una soluzione OVA (pH 7.0) sciolta in glucosio al 5% e lasciato per 15 minuti a 4°C. Per rivestire il complesso OVA/BK con c-PGA, una soluzione di c-PGA (pH 7,0) sciolta in glucosio al 5% è stata aggiunta al complesso OVA/BK e lasciata per altri 15 minuti a 4 C. La dimensione delle particelle e il potenziale f di ciascun complesso sono stati misurati utilizzando uno Zetasiser Nano ZS (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, Regno Unito).

2.3. Cellule

Sono state utilizzate la linea cellulare di macrofagi di topo RAW264.7 e la linea cellulare dendritica DC2.4. Le cellule RAW264.7 sono state coltivate in DMEM integrato con il 10% di FBS e antibiotici. Le cellule DC2.4 sono state coltivate in terreno RPMI1640 integrato con il 10% di FBS, antibiotici, 1 mM di amminoacidi non essenziali e 1 nM di 2-mercaptoetanolo. Queste cellule sono state valutate in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 in aria a 37°C.

2.4. Esperimento di captazione cellulare in vitro

Le cellule RAW264.7 e le cellule DC2.4 sono state piastrate su 24-pozzetti (Corning, NY, USA) a una densità di 2.0 104 cellule/pozzetto e coltivate in 50{ {21}} ml di terreno di coltura. Dopo 24- ore di preincubazione, il terreno è stato sostituito con terreno OPTI-MEM I e le cellule sono state incubate con 5 mg di FITC-OVA e il complesso contenente 5 mg di FITC-OVA per 2 ore. Dopo l'incubazione, queste cellule sono state lavate con PBS e osservate al microscopio a fluorescenza (BIOREVO BZ-9000; Keyence Co., Osaka, Giappone). Dopo l'osservazione, quelle cellule sono state lisate in 300 lL di tampone di lisi (tampone Tris/HCl a pH 7,8 e 0,1 M contenente Triton X-100 allo 0,05% e EDTA 2 mM). I lisati sono stati collocati in 96-pozzetti e la fluorescenza di FITC-OVA è stata misurata a una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm con una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm, utilizzando un lettore di micropiastre fluorometrico (Infinite-200Pro M-Plex, Tecan Japan Co., Ltd., Kanagawa, Giappone). Il contenuto proteico del lisato è stato determinato mediante un saggio Bradford utilizzando BSA come standard. L'assorbanza è stata misurata utilizzando il lettore di micropiastre a 570 nm. L'assorbimento di FITC-OVA è stato indicato come mg per mg di proteina.

2.5. Animali

La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state eseguite dalle Linee guida per la sperimentazione animale dell'Università di Nagasaki con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Topi maschi C57BL/6N (5 settimane) sono stati acquistati da Japan SLC (Shizuoka, Giappone). Dopo essere stati trasportati, ai topi è stato permesso di acclimatarsi al loro nuovo ambiente per 1 giorno prima degli esperimenti. La somministrazione polmonare (40 mL) è stata eseguita utilizzando un abbassalingua con luce per respirazione spontanea in topi anestetizzati per inalazione di isoflurano (Horiguchi et al., 2015).

2.6. Accumulo polmonare di complesso

Per esaminare l'accumulo di OVA, l'OVA di Alexa647- da 40 mg e il complesso contenente OVA di Alexa647- da 40 mg a un volume di 40 ml per topo sono stati somministrati ai topi per via polmonare. Sei giorni dopo la somministrazione, i topi sono stati sacrificati ei polmoni sono stati sezionati. L'intensità fluorescente di Alexa647-OVA nel polmone del topo è stata osservata con un sistema Xenogen IVIS Lumina abbinato al software Living Image per l'acquisizione dei dati (Xenogen, Co, Almeda, CA, USA). Dopo l'osservazione, quei polmoni sono stati omogeneizzati con tampone di lisi e gli omogenati sono stati centrifugati a 15,000 rpm (Kubota-3500, Kubota Corporation, Tokyo, Giappone) per 5 minuti e la fluorescenza di Alexa647 in quei surnatanti è stato determinato con il leader della micropiastra a una lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione di 640 e 670 nm, rispettivamente.

2.7. Immunizzazione

I topi sono stati immunizzati con una soluzione di glucosio al 5%, 40 mg di OVA, un complesso vuoto di 8 mg BK e 8 mg di c-PGA (veicolo) e un complesso OVA/BK/c-PGA contenente 40 mg di OVA mediante somministrazione polmonare, 4 volte settimanalmente. Due settimane dopo l'ultima immunizzazione, sono stati ottenuti liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF) e siero. Il BALF e il siero sono stati utilizzati per i test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

2.8. Determinazione dell'induzione di anticorpi specifici per OVA

Per il rivestimento OVA, 100 mL di soluzione OVA (10 mg/mL, in 1 M di idrogenocarbonato di sodio) è stato aggiunto a ciascun pozzetto delle piastre ELISA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) e incubate per una notte a 4°C. Le piastre sono state lavate tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,05% di Tween-20 (PBST), 200 mL di reagente bloccante N 102 (Nichiyu, Co., Ltd., Tokyo, Giappone ) aggiunto per bloccare il legame non specifico e quindi incubato per 6 ore a 4 C. Le piastre sono state lavate due volte con PBST. Quindi, a ciascun pozzetto sono state aggiunte aliquote di 100 mL di campioni di 1000- volte siero diluito e BALF non diluito e incubate per una notte a 4°C. Dopo cinque lavaggi con PBST, 100 mL ciascuno di perossidasi di rafano (HRP) – anti di capra coniugato -mouse IgG, IgA, IgM, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 (1:10,000) (Abcam, Cambridge, UK) – sono state aggiunte a ciascun pozzetto e incubate a temperatura ambiente per 1 ora e quindi lavato cinque volte con PBST. La soluzione TMB One (Promega, WI, USA) è stata utilizzata e preparata secondo le istruzioni del produttore. La reazione è stata quindi fermata a 15 min mediante l'aggiunta di acido cloridrico 1 N. L'assorbanza è stata letta a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

2.9. Tossicità in vivo del complesso OVA/BK/c-PGA

I complessi OVA e OVA/BK/c-PGA sono stati somministrati ai topi per via polmonare. BALF è stato ottenuto 3 e 24 ore dopo la somministrazione dai topi. Ventiquattro ore dopo la somministrazione, anche il polmone è stato sezionato. L'attività della lattato deidrogenasi (LDH) nel BALF è stata misurata utilizzando il kit QuantiChromTM lattato deidrogenasi (BioAssay Systems, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. I campioni polmonari sono stati fissati in una soluzione tampone di paraformaldeide fosfato al 4%. Il sezionamento e la colorazione con ematossilina-eosina (HE) sono stati affidati a GenoStaff (Tokyo, Giappone). Le sezioni del polmone colorate con HE sono state osservate al microscopio a 20 ingrandimenti.

2.10. analisi statistica

La significatività statistica delle differenze tra i due gruppi è stata valutata eseguendo il test t di Student. Confronti multipli tra i gruppi sono stati eseguiti eseguendo il test di Tukey. p-Values ​​<.05 è stato considerato indicativo di significatività statistica.

3. Risultati

3.1. Proprietà fisico-chimiche del complesso

Abbiamo costruito un complesso anionico OVA/BK/c-PGA con un rapporto di peso di 1:0.2:0.2. Il complesso rivestito con c-PGA aveva una dimensione delle particelle di circa 105,4 nm e un potenziale f di circa 35,5 mV.

3.2. Captazione cellulare del complesso

Le cellule RAW264.7 e le cellule DC2.4 sono state trattate con il complesso FITC-OVA e FITC-OVA/BK/c-PGA e l'assorbimento cellulare di FITC-OVA è stato visualizzato, come mostrato nella Figura 1. FITC-OVA/BK/ Il complesso c-PGA è stato altamente assorbito dalle cellule RAW264.7 e dalle cellule DC2.4 ed è stata osservata una forte fluorescenza verde di FITC-OVA (Figura 1 (A, B), rispettivamente). Allo stesso tempo, sono state osservate piccole quantità di FITC-OVA in entrambe le cellule trattate con FITC-OVA.

Gli assorbimenti cellulari di FITC-OVA sono stati quantificati nelle cellule RAW264.7 e nelle cellule DC2.4 (Figura 1 (C)). Il complesso FITC-OVA/BK/c-PGA ha mostrato un assorbimento significativamente più alto rispetto a FITC-OVA in entrambe le cellule (p < .01).

3.3. Accumulo polmonare di Alexa647-OVA dopo la somministrazione polmonare

Alexa647-OVA e il complesso Alexa647-OVA/BK/c-PGA sono stati somministrati ai topi per via polmonare per determinare l'accumulo nei polmoni di Alexa647-OVA come antigene. A 6 giorni dalla somministrazione, i polmoni sono stati sezionati e la loro intensità di fluorescenza è stata visualizzata utilizzando un sistema Xenogen IVIS Lumina. Un'immagine fluorescente ex vivo è mostrata nella Figura 2 (A). Un'elevata intensità di fluorescenza è stata osservata in tutto il polmone 6 giorni dopo la somministrazione polmonare, sebbene non vi fosse alcuna intensità di fluorescenza nella milza, nel cuore, nei reni e nel fegato (dati non mostrati). L'accumulo polmonare era più alto per il complesso Alexa647-OVA/BK/c-PGA che per Alexa647-OVA il giorno 6. Come mostrato nella Figura 2(B), l'accumulo polmonare era significativamente più alto per Alexa 647-complesso OVA/BK/c-PGA rispetto ad Alexa647- OVA (p < .05).

3.4. Anticorpo specifico per OVA nel siero dopo somministrazione polmonare del complesso

Una soluzione di glucosio al 5 percento, complesso BK/c-PGA (veicolo), OVA e complesso OVA/BK/c-PGA sono stati somministrati per via polmonare nei topi quattro volte, e quindi IgG, IgA, IgM sieriche specifiche per OVA e le IgE sono state determinate mediante ELISA come mostrato nella Figura 3. La somministrazione polmonare di OVA e del complesso OVA/BK/c-PGA ha aumentato i livelli di IgG nei topi, sebbene le IgG specifiche per OVA non siano state rilevate nei topi a cui è stato somministrato glucosio al 5% e veicolo. Inoltre, la produzione di IgG e IgA era significativamente più alta dopo la somministrazione del complesso OVA/BK/c-PGA che dopo la somministrazione di OVA (p < .05 o .01). D'altra parte, IgM e IgE specifiche per OVA non sono state indotte da OVA o dal complesso OVA/BK/c-PGA.

3.5. Anticorpo specifico per OVA in BALF dopo somministrazione polmonare del complesso

Sono state determinate anche IgG, IgA, IgM e IgE specifiche per OVA nel BALF, come mostrato nella Figura 4. Il livello di IgG è stato significativamente aumentato da OVA rispetto ai livelli dopo la somministrazione del controllo e del veicolo (p < 0,05 o .01). Tuttavia, il complesso OVA/BK/c-PGA ha aumentato significativamente non solo le IgG ma anche le IgA nel BALF (p <.01). Tuttavia, IgM e IgE specifiche per OVA non sono state indotte da OVA o dal complesso OVA/BK/c-PGA.

3.6. Sottotipi di IgG nel siero dopo somministrazione polmonare del complesso

Gli effetti di induzione dei sottotipi di IgG specifici per OVA, come IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 nel siero sono stati determinati come mostrato nella Figura 5. Rispetto al controllo e al veicolo, OVA ha aumentato significativamente solo IgG1 (p <.01). I livelli anticorpali di tutti i sottotipi indotti dal complesso OVA/BK/c-PGA erano significativamente superiori ai livelli indotti dal controllo e dal veicolo (p < .05 o .01).

3.7. Sottotipi di IgG in BALF dopo somministrazione polmonare del complesso

Sono stati determinati anche sottotipi di IgG specifici per OVA, come IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 nel BALF, come mostrato nella Figura 6. OVA ha aumentato significativamente solo i livelli di IgG1 rispetto a quelli indotti dal controllo e dal veicolo (p <.01) . Rispetto al controllo, al veicolo e all'OVA, il complesso OVA/BK/c-PGA ha indotto livelli anticorpali significativamente più elevati di tutti i sottotipi (p < 0,05 o 0,01).

3.8. Tossicità in vivo del complesso OVA/BK/c-PGA

Ai topi è stata somministrata una soluzione di glucosio al 5%, OVA e il complesso OVA/BK/c-PGA. L'attività LDH nel BALF è stata determinata 3 o 24 ore dopo la somministrazione (Figura 7). La somministrazione del complesso OVA e OVA/BK/c-PGA ha avuto scarso effetto sui livelli di LDH nel BALF.

Ventiquattro ore dopo la somministrazione, i polmoni sono stati sezionati da quei topi per l'analisi istologica. Le sezioni polmonari colorate con HE sono mostrate nella Figura 8. Non sono state osservate anomalie istologiche nei topi trattati con OVA e il complesso OVA/BK/c-PGA.

4. Discussione

Il polmone controlla la respirazione ed è esposto a molti agenti patogeni, come virus e batteri che causano infezioni respiratorie. Questi agenti patogeni infettano attraverso la membrana della mucosa polmonare, quindi l'immunità della mucosa deve essere indotta per proteggere dalle infezioni respiratorie. Prevenire le infezioni respiratorie, l'immunità della mucosa ha un ruolo importante; tuttavia, la somministrazione intradermica e intramuscolare del vaccino non può stimolare fortemente l'immunità della mucosa (Ito et al., 2003; Amorij et al., 2007). Il sistema immunitario della mucosa che induce le IgA secretorie si sviluppa sulla superficie della mucosa. È stato riportato che diverse APC, come cellule dendritiche e macrofagi, si trovano sulla superficie della mucosa (Kopf et al., 2015). Inoltre, il tessuto linfoide associato ai bronchi (BALT) si trova nella mucosa bronchiolare ed è un follicolo linfoide che ha un ruolo centrale nell'immunità della mucosa del tratto respiratorio (Bienenstock, 1980). Si prevede che la somministrazione polmonare del vaccino stimoli efficacemente il sistema immunitario della mucosa. Pertanto, abbiamo costruito il complesso OVA/BK/c-PGA per valutarne l'utilità come vaccino somministrato per via polmonare.

La Figura 4 mostra la concentrazione BALF di anticorpi specifici per OVA dopo la somministrazione polmonare di OVA e il complesso OVA/BK/c-PGA. La somministrazione polmonare di OVA ha aumentato le IgG ma ha avuto scarso effetto sulle IgA nel BALF. D'altra parte, il complesso OVA/BK/c-PGA ha indotto in modo significativo la secrezione di IgA nel BALF. Inoltre, l'induzione sierica di IgG era significativamente più alta dopo la somministrazione del complesso OVA/BK/c-PGA che dopo la somministrazione di OVA (Figura 3). Le IgG sieriche sono importanti per prevenire l'aggravarsi di eventuali infezioni che si verificano (Huber et al., 2006; Schroeder & Cavacini, 2010). I risultati indicano che il complesso OVA/BK/c-PGA potrebbe prevenire le infezioni respiratorie mediante un'elevata induzione di IgA della mucosa e l'aggravamento dell'infezione respiratoria mediante un'elevata induzione di IgG nel siero. Inoltre, non è stata osservata l'induzione di IgE da parte del complesso OVA/BK/c-PGA e questo risultato indicava un rischio minimo di reazione allergica da parte del complesso OVA/BK/c-PGA.

Il complesso OVA/BK/c-PGA potrebbe anche indurre non solo IgG1 e IgG2b ma anche IgG2a e IgG3 (Figura 5). IgG1 e IgG2b sono note come immunoglobuline di tipo Th2- che mediano la risposta immunitaria umorale, mentre IgG2a e IgG3 sono note come immunoglobuline di tipo Th1- che mediano la risposta immunitaria cellulare (Firacative et al., 2018) . Pertanto, il complesso OVA/BK/c-PGA potrebbe indurre risposte immunitarie sia umorali che cellulari. Questi risultati suggeriscono che questo sistema potrebbe essere utile per i vaccini contro le infezioni e contro i tumori. L'effetto preventivo, le risposte delle citochine di tipo Th1- e Th2-indotte dall'antigene nell'induzione di BALT inducibile, popolazione di Treg e IL-10 dovrebbero essere valutate utilizzando antigeni reali da infezioni o tumori in futuro studi.

La forte induzione da parte del complesso OVA/BK/c-PGA della risposta immunitaria deve essere dovuta all'elevata ritenzione del complesso nel polmone e all'effettivo rilascio di OVA nelle APC nella mucosa polmonare. I nostri risultati lo hanno confermato mostrando che 6 giorni dopo la somministrazione, il complesso Alexa647-OVA/BK/c-PGA è rimasto nel polmone e ha mostrato una fluorescenza significativamente più elevata rispetto a Alexa647- OVA (Figura 2). La formazione complessa potrebbe impedire la diffusione di OVA e proteggere OVA dalla degradazione da parte delle proteasi nella mucosa polmonare. Inoltre, il complesso OVA/BK/c-PGA è stato in grado di fornire efficacemente OVA nelle cellule macrofagiche RAW264.7 e nelle cellule dendritiche DC2.4 (Figura 1). Questi risultati hanno indicato che il complesso OVA/BK/c-PGA verrebbe assorbito dalle APC alveolari e indurrebbe un'elevata risposta immunitaria dopo la somministrazione polmonare. È stato riportato che le nanoparticelle rivestite di c-PGA sono state assorbite dalla via endocitotica mediata dalla gamma-glutamil transpeptidasi (Du et al., 2015). Abbiamo anche confermato che le nanoparticelle rivestite di c-PGA sono state assorbite dal percorso endocitotico specifico di c-PGA (Kurosaki et al., 2009). Il complesso OVA/BK/c-PGA potrebbe essere assorbito dalle APC nel polmone attraverso gli stessi meccanismi. Tuttavia, non è ancora chiaro quali cellule siano responsabili dell'assorbimento degli OVA e della successiva presentazione dell'antigene nell'induzione dell'immunità specifica. Ulteriori studi sui meccanismi dettagliati di induzione immunitaria dovrebbero essere eseguiti in futuro.

Sono stati sviluppati molti adiuvanti per migliorare l'efficacia dei vaccini; tuttavia, è stato riportato che gli adiuvanti causano reazioni infiammatorie nel sito di iniezione (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). Pertanto, la somministrazione di adiuvanti al polmone potrebbe causare gravi effetti collaterali, come la polmonite. Dopo la somministrazione polmonare del complesso OVA/BK/c-PGA, i livelli di LDH nel BALF non sono stati aumentati (Figura 7) e non sono state osservate anomalie istologiche nella sezione macchiata di HE (Figura 8). Secondo quanto riferito, c-PGA è un polimero biocompatibile e biodegradabile che non mostra reazioni immuno-infiammatorie (Prodhomme et al., 2003; Ye et al., 2006). BK è un composto di ammonio quaternario sicuro che è stato ampiamente utilizzato clinicamente come additivo antimicrobico (Marple et al., 2004). Questi rapporti supportano anche la sicurezza del complesso OVA/BK/c-PGA. D'altra parte, livelli più elevati di LDH sono stati osservati a 3 ore dopo la somministrazione polmonare rispetto a 24 ore, anche nel gruppo di controllo. Questi risultati indicano che una leggera irritazione è stata causata dalla somministrazione polmonare. Sono necessari ulteriori studi sulla sicurezza prima dell'applicazione clinica del complesso OVA/BK/c-PGA.

Nel presente studio, abbiamo dimostrato un'elevata induzione del sistema immunitario della mucosa da parte di un nuovo vettore di somministrazione del vaccino costruito con una proteina dell'antigene, BK e c-PGA dopo la somministrazione polmonare. Il sistema può essere utilizzato per i vaccini contro varie infezioni respiratorie.

Dichiarazione di divulgazione

Nessun potenziale conflitto di interessi è stato segnalato dagli autori.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società giapponese per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI con sovvenzioni [JP20K12649 e JP20K07156].

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