Studiando il meccanismo attraverso il quale Cistanche Deserticola tratta la malattia di Alzheimer usando la farmacologia di rete e la validazione sperimentale

[Astratto]

 

Obiettivo: esplorare ilPotenziale meccanismo di cistanche deserticola sulla malattia di Alzheimer (AD)AttraversoFarmacologia di retee esperimenti sugli animali.

Metodi:PrevedereObiettivi legati alla malattia di Cistanche e Alzheimer usando la farmacologia di rete; 40 I topi SAMP8 maschili 7- sono stati divisi casualmente in un gruppo di controllo del modello (modello), un gruppo di trattamento a basso dosaggio (L-GC), un gruppo di trattamento a dose elevata (H-GCS) e 10 topi SAMR1 antimannati maschili della stessa età come gruppo di controllo SAMR1. Dopo 30 d di somministrazione intragastrica di GCS, gli esperimenti di labirinto d'acqua Morris e il labirinto Y sono stati usati per testare le capacità di apprendimento e memoria di ciascun gruppo di topi. La colorazione NissL è stata utilizzata per osservare il numero e la morfologia dei neuroni nella regione dell'ippocampo CA1 dei topi. La colorazione immunoistochimica e gli esperimenti Western blot sono stati usati per rilevare l'espressione di PI3K, P-AKT e P-TAU nell'ippocampo dei topi. Risultati: 8 componenti efficaci tra cui la verbascoside sono stati sottoposti a screening da cistanche deserticola e i geni fondamentali coinvolti nel trattamento AD erano AKT1, TNF, CASP3, ecc. Le vie di segnalazione relative al trattamento AD da parte di Cistanche Deserticola includevano PI3K-AKT, percorsi TNF e percorsi di rabbia per età. Gli esperimenti sugli animali hanno mostrato che rispetto al gruppo modello, la latenza di fuga e la distanza totale nel test di navigazione del labirinto di acqua Morris sono significativamente diminuiti (P<0.05), and the number of platform crossings significantly increased (P<0.05) in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments, the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group significantly increased (P<0.05), while the expression of P-Tau/Tau significantly decreased (P<0.05). Conclusion: GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.

[Parole chiave]Farmacologia di rete;La malattia di Alzheimer; Cistanche deserticola; Topi SAMP8; Apoptosi

 

 

 

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1 Materiali e metodi

1.1 Materiali

1.1.1 Database e piattaforme di analisi

I database principali e le piattaforme di analisi utilizzate in questo studio (Tabella 1).

 

Tab 1 piattaforme analitiche pertinenti e database utilizzati in questo studio

Nome	Sito web	Versione
Database tradizionale di farmacologia dei sistemi di medicina cinese (TCMSP)	https://www.tcmsp-e.com/	2.3
Uniprot	https://www.uniprot.org/
PUBCHEM	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Venny	https://bioinfo.cis.cornell.edu/tools/venn/
Genecarde	https://www.genecards.org/
Database NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Omim	https://omim.org/
Database String	https://cytoscape.org/	11
Software Cytoscape	https://cytoscape.org/	3.8.0 - 3.9.1
Metascape	https://metascape.org/

 

1.1.2 Animali sperimentali

Gli animali sperimentali utilizzati in questo esperimento erano topi topo a accelerazione della senescenza SPF maschile 8 (SAMP8), che sono stati raccolti dai 2 mesi a 7 mesi e inclusi nell'esperimento. Tutti gli animali sono stati allevati nella stanza degli animali di livello SPF del Centro di esperimento animale del Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology [Syxk (Meng) 2018-0001], con una temperatura di (24. 0 ± 1. {{11}) grado e umidità controllata al 62%± 3%. Sono stati forniti sufficienti mangimi e acqua potabile e i topi erano liberi di mangiare e bere. Il ciclo di luce/buio era di 12 ore/12 ore per garantire il normale ritmo circadiano dei topi. Tutte le operazioni animali e i protocolli sperimentali coinvolti in questo esperimento sono stati condotti in conformità con il protocollo approvato dal Comitato sperimentale di etica degli animali del Baotou Medical College (Baoyi Ethics 2018 n. 011).

1.1.3 Reagenti e strumenti principali

Tampone di lisi RIPA ad alta efficienza (R0010), soluzione luminescente Ultra sensibile (PE0010), tampone di elettroforesi (T1070), tampone di trasferimento (D1060), tampone di carico proteico (P1015), ecc. Sono stati tutti acquistati da Beijing Solebao; Il kit immunohistochimiche (Pv -9000) è stato acquistato da Pechino Zhongshan Jinqiao; Il kit di rilevamento delle proteine ​​BCA (23227) è stato acquistato da Thermo Scientific, USA. Fosfoinositide 3- chinasi (PI3K) anticorpo, la proteina B chinasi B (Akt) anticorpo della proteina chinasi B (Akt) (AF0016), l'anticorpo P -AKT (AF6261) sono stati acquistati da Wuhan Qinke Biological Research Center Co., Ltd., -Actin (52901) da SAB, USA; L'anticorpo secondario anti-coniglio di capra (sa 00001-2) è stato acquistato da Proteintech, USA.
Paraffin Slicer (Leica, Germania), Microscopio ottico (Leica, Germania), Camera di prova del campo aperto (Shanghai Xinruan), Morris Water Maze -80 grado di frigorifero a temperatura-bassa (Thermo Fisher, USA), Electroforesi Apparatus (Beijing Biotechnology Co.) (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.), sistema di analisi di imaging in gel proteico (Shanghai Tanon Technology) e lettore di micropiastre (Thermo Fisher, USA).

 

1.2 Metodi

1.2.1 Analisi della farmacologia di rete

1.2.1.1 Screening di ingredienti attivi e punti bersaglio di cistanche deserticola

Screening dei punti target di Cistanche Deserticola: tutti gli ingredienti attivi chimici sono stati cercati nel database TCMSP (https://www.tcmsp-e.com) con cistanche deserticola come parola chiave, e biodisponibilità orale (ob) maggiore o uguale a 3 0 condizioni per proiettare i composti raccolti; La piattaforma Swiss Adme è stata utilizzata per integrare gli ingredienti chimici non trovati nella piattaforma TCMSP con un punteggio di assorbimento gastrointestinale (assorbimento GI) di "alta" e somiglianza di droga di almeno 2 "sì" come standard e insieme ai comuni ingredienti attivi di cistanche riscuote
(https://www.uniprot.org) [10].

 

1.2.1.2 Acquisizione di obiettivi di malattia AD

Usando "Alzheimer's Malatts" come termine di ricerca, cerca obiettivi di malattia in database OMIM, Genecard e NCBI.

 

1.2.1.3 Creazione del diagramma di Venn e costruzione della rete di interazione proteina-proteina (PPI)

Inserisci obiettivi di droga e obiettivi di malattia sul sito Web del diagramma Venny, crea un diagramma di Venn e ottieni l'intersezione di obiettivi. Importa il database delle stringhe per costruire una rete di interazione proteica, impostare le specie biologiche su "homo sapiens" e ottenere un diagramma della rete di interazione proteica. Utilizzare il software Cytoscape per filtrare gli obiettivi fondamentali in base al grado, alla vicinanza e ai valori tra gli obiettivi e utilizzare il plug-in analizza per disegnare il grafico.

1.2.1.4 Analisi GO e KEGG

Utilizzare la piattaforma di David online e la piattaforma online MetaScape per eseguire l'analisi di arricchimento GO e KEGG sugli obiettivi core correlati sopra menzionati e selezionare gli elementi con p meno o uguali a 0. 05. I diagrammi a bolle di Go e Kegg Arricchment sono stati disegnati utilizzando la microinformazione della piattaforma di disegno online.

 

1.2.2 Raggruppamento degli animali sperimentali e preparazione del modello

40 topi SAMP8 sono stati divisi casualmente nel gruppo modello, il gruppo Deserticola a basso dosaggio (L-GC), il gruppo Deserticola cistanche a media dosi (M-GC) e il gruppo Deserticola a dose ad alto dosaggio (H-GC), con 10 topi in ciascun gruppo; 10 topi SAMR1 dello stesso sesso e peso sono stati usati come gruppo di controllo SAMR1. Il gruppo L-GCS, il gruppo M-GCS e il gruppo H-GCS sono stati gavati con GCS alla dose di 25 mg/(kg · d), 50 mg/
(kg · d) e 100 mg/(kg · d), rispettivamente. Il gruppo SAMR1 e il gruppo modello sono stati somministrati la stessa dose di soluzione salina normale e tutti i gruppi sono stati gavaggiati per 30 giorni consecutivi.

 

1.2.3 Esperimento comportamentale

1.2.3.1 Morris Water Maze Experiment

Esperimento di navigazione della posizione: dal 24 al 30 ° giorno di amministrazione GCS, l'esperimento di navigazione della posizione è stato condotto nei primi 1-5 giorni. Il labirinto d'acqua è stato diviso in quattro quadranti e la piattaforma è stata collocata nel terzo quadrante, leggermente più alto della superficie dell'acqua di 2 cm. Il topo è stato posto nell'acqua con la testa di fronte al muro della piscina, ed è stato osservato se poteva trovare la piattaforma all'interno dei 60 secondi specificati e rimanere sulla piattaforma per 2-3 secondi. La frequenza di allenamento per ciascun topo era quattro volte al giorno e il punto di partenza di ogni volta era un quadrante diverso. L'intervallo di tempo tra ciascun due allenamenti non dovrebbe essere inferiore a 15 minuti. Se il mouse non ha trovato la piattaforma entro 60 secondi, è stato guidato per rimanere sulla piattaforma per 3-5 secondi. Durante l'esperimento sono state registrate la latenza di fuga e la lunghezza del percorso di ciascun gruppo di topi; Dopo 6-7 giorni, è stato utilizzato un esperimento di esplorazione spaziale: la piattaforma nel terzo quadrante è stata rimossa e i topi hanno iniziato l'esperimento di esplorazione dal primo quadrante. Il tempo di esplorazione è stato di 60 s e sono stati registrati il ​​numero di attraversamenti della piattaforma e la percentuale di tempo nel quadrante target di ciascun gruppo di topi.

 

1.2.3.2 Esperimento di labirinto Y.

Il labirinto Y è costituito da tre braccia delle stesse dimensioni e forma: il braccio iniziale, il braccio nuovo e le altre braccia. Prima dell'esperimento, l'ingresso del nuovo braccio era bloccato, permettendo ai topi di esplorare liberamente i restanti due braccia per 10 minuti. 1 h dopo l'esplorazione, l'ingresso al nuovo braccio fu aperto e il topo fu posto all'inizio del braccio iniziale. È stato registrato il tempo in cui il mouse ha esplorato il nuovo braccio entro 5 minuti e è stato calcolato il numero di volte in cui il mouse è entrato ed uscito dal braccio nuovo. La velocità di alternanza spontanea del mouse è stata calcolata [tasso di alternanza (%)=Numero di alternazioni riuscite/(numero totale di voci ARM -2) × 100%] [14].

 

1.2.4 colorazione Nissl

Dopo 30 giorni di somministrazione di droga, i topi sono stati anestetizzati e perfusi con soluzione salina nel cuore. Dopo che il sangue è stato drenato, i topi sono stati uccisi e il tessuto cerebrale è stato preso. Il tessuto cerebrale dei topi è stato fissato per immersione in paraformaldeide al 4% per 24-48 H, disidratato con alcool a gradiente ascendente, trasparente con xilene e incorporato nella paraffina. Lo spessore della fetta era di 5 μm. Dewax di routine in acqua, colorazione blu di metilene, differenziazione, disidratazione dell'etanolo, trasparente di xilene e sigillatura di resina. La morfologia e il numero di neuroni nella regione CA1 dell'ippocampo di topo sono stati osservati al microscopio a 200 volte.

1.2.5 colorazione immunoistochimica

Le sezioni del tessuto cerebrale sono state abitualmente dewax in acqua, posizionate in soluzione di riparazione dell'antigene citrato di sodio e riscaldate da microonde ad alta pressione, sciacquate con tampone PBS per 5 minuti × 3 volte, aggiunto bloccante perossidasi endogeno, sciacquato con PBS per 5 minuti × 3 volte, incubato con anticorpi primari e incubati a 4 gradi durante la notte. The next day, rinsed with PBS buffer for 5 min×3 times, then added reaction enhancement solution, washed again with PBS for 5 min×3 times, incubated with secondary antibody at 37 degree for 20 min, rinsed with PBS for 5 min×3 times, then DAB staining solution was used for color development, hematoxylin counterstained the nucleus, dehydrated with ascending gradient ethanol, and transparentized with xilene.

 

1.2.6 Western blot

Parte del tessuto dell'ippocampo di topo è stata aggiunta al tampone di lisi RIPA proteica, completamente macinata con una bordo di macinazione, omogeneizzata da ultrasuoni in un bagno di ghiaccio e lasciato sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi utilizzare un'ultracentrifuga a bassa temperatura per centrifuga a 12, 000 R/min per 15 minuti, prendi il surnatante e usa il metodo BCA per determinarne la concentrazione proteica. Prendi 20 ug di proteina e aggiungilo al tampone di carico delle proteine, denatura a 100 gradi per 5 minuti, installa il gel concentrato preconfigurato e il gel di separazione nel serbatoio di elettroforesi ed esegui l'elettroforesi a tensione costante 80 V per 60 minuti dopo il carico e quindi regolare su 120 V Elettroforesi a tensione costante per 80 min. Quindi utilizzare la corrente costante da 300 mA e trasferire la membrana per 130 min. Blocco con latte scremato a temperatura ambiente per 2 ore, diluire l'anticorpo primario a 1: 1 500 volte, incubarlo in frigorifero a 4 gradi durante la notte, lavare la membrana e incubare l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo aver sviluppato con un sistema di analisi di imaging, analizzare il valore grigio di ciascun gruppo di bande.

 

1.2.7 Analisi statistica

Tutti i dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (x  s) e SPSS 25. 0} e il software GraphPad Prism9.5 sono stati utilizzati per l'analisi dei dati e la grafica. Il test SNK-Q è stato utilizzato per il confronto a coppie e l'anona a senso unico è stato utilizzato per un confronto più campione. P<0.05 indicated statistically significant differences.