Glicosidi monoterpenici iridoidi e aciclici, kankanosides L, M, N, O e P da Cistanche Tubulosa
Mar 06, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Cistanche tubulose(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) è una pianta parassitaria perenne che cresce su radici di specie Salvadora o Calotropis, distribuita in Nord Africa, Arabia e paesi asiatici.1) Gli steli di questa pianta (Kanka-nikujuyou in giapponese) sono stati tradizionalmente utilizzato per il trattamento dell'impotenza, della sterilità, della lombalgia e della debolezza corporea, nonché come agente promotore della circolazione sanguigna.1,2) Nel corso dei nostri studi sui costituenti bioattivi degli steli di Cistanche tubulosa,3—6) abbiamo precedentemente riportato ventiquattro aminoglicosidi feniletanoidi inclusi i kancanosidi H1, H2, I, J1, J2, K1 e K2 e due oligozuccheri acilati da steli freschi di Cistanchetubulosa.5,6) Inoltre, principaleglicosidi feniletanoidi,echinacoside, acteoside,e isoacteoside, è stato scoperto che inibisce l'aumento dei livelli sierici di aspartato aminotransferasi (sAST) e alanina aminotransferasi (sALT) nel fegato danneggiato dei topi indotto da D-galattosamina (D-GalN)/lipopolisaccaride a dosi di 25-100 mg/kg per os ( po). Sono stati anche chiariti i requisiti strutturali dei glicosidi feniletanoidi per l'attività epatoprotettiva.5) In questo studio continuo sui costituenti negli steli freschi di Cistanchetubulosa, abbiamo ulteriormente isolato undici glicosidi iridoidi inclusi i kancanosidi L (1), M (2), e N (3), sette glicosidi monoterpenici aciclici inclusi kancanosides O (4) e P (5), tre fenilpropanoidi e quattro lignani. Questo articolo si occupa dell'isolamento e della delucidazione della struttura di cinque nuovi composti (1-5).
Gli steli freschi di C. tubulosa (coltivati a Urumuqi, nella provincia dello Xin jiang, Cina) sono stati estratti con metanolo a riflusso per produrre un estratto metanolico (8,36% dagli steli freschi). Dall'estratto metanolico, le frazioni eluite con H2O e MeOH (rispettivamente 5,63 percento e 2,73 percento) sono state ottenute mediante cromatografia su colonna Diaion HP-20 (H2O→MeOH) come descritto in precedenza.5) La frazione eluita con MeOH è stata sottoposto a cromatografie su colonna di SiO2 e ODS e infine HPLC per fornire i kancanosidi L (1, 0.0026 percento), M (2, 0.{{ 27}}001 percento ), N (3, 0.00{{60}}7 percento) , O (4, 0.0{{90}}2{{105}} percento) e P (5, {{118} }.0002 percento ), 6-deossicatalpol3,7) (6, 0.197 percento ), bartsioside3,7) (7, 0.0583 percento), gluroside3,7) (8, 0,0443 percento), kankanoiside A3) (9, 22,3 mg, 0,0010 percento), acido mussaenosidico3,7) (10, 0,0056 percento), 8- acido epiloganico3,8) (11, 0,0023 percento), 8-acido epideossiloganico3,7) (12, 0,0004 percento), acido geniposidico3,7) (13, 0,0040 percento), kankanoside E3) (14, 0,0026 percento), (2E,6Z)-8-b D-glucopiranosilossi-2,6-dimetil-2,6-acido ottadienoico3,9) (15, 31,0 mg, 0,0014 percento), (2E,6E){{95 }},7-dimetil-8-idrossiottadiene-1-il-ObD-glu copyranoside10) (16, 0,0082 percento), 8-idrossigeraniolo 8-Ob-D-glucopiranoside11 ) (17, 0,0044 percento ), betulalbuside A12) (18, 0,0004 percento ), coniferina13) (19, 0,0002 percento ), siringina13) (20, 0,0015 percento ), aldeide sinapica 4- ObD-glucopiranoside14) (21, 0,0001 percento), ( )-pinoresinolo ObD-glucopiranoside4,8,15) (22, 0,0010 percento), eucommin A16) (23, 0,0002 percento), isoeucommin A17) (24, 0,0010 percento) e ( )-siringaresinolo ObD- glucopyra noside4,8,18) (25, 0,0044 percento).
Cistanche tubulosemigliorare la funzione sessuale
Strutture dei Kancanosides L (1), M (2) e N (3)
Kankanoside L (1) è stato ottenuto come polvere bianca con rotazione ottica negativa ([a]D 26 45,7 in MeOH). Il suo spettro IR ha mostrato una forte banda di assorbimento a 3433 e 1{{20}}80 cm 1 indicativi di una frazione glicosidica. Il bombardamento atomico veloce (FAB)-MS di 1 corsa nelle modalità con ioni positivi e negativi ha mostrato picchi di ioni quasimolecolari a m/z 371 [M Na] e 347 [MH], rispettivamente, e la formula molecolare è stata determinata come C15H24O9 mediante misurazione FAB-MS ad alta risoluzione. L'idrolisi acida di 1 con acido cloridrico 1,0 M (HCl) ha liberato D-glucosio, che è stato identificato mediante analisi HPLC utilizzando un rivelatore di rotazione ottico.3—6) Gli spettri 1 H- e 13C-NMR di 1 (CD3OD, tabelle 1, 2), che sono stati assegnati da vari esperimenti NMR,19) hanno mostrato segnali come segnalabili a quattro metileni [d 1,43 (1H, br dd, J ca. 5, 13 Hz, 4a-H), 1,73 (1H, br dd, J circa 12, 14 Hz, 6a-H), 1,85 (1H, m, 4b-H), 1,93 (1H, br dd, J= ca. 8, 14 Hz, 6b-H), 3,50 ( 1H, ddd, J 2,4, 12,5, 13,0 Hz, 3a-H), 3,83 (1H, br dd, J=ca. 5, 13 Hz, 3b-H), 3,78, 4,12 (1H ciascuno, entrambi d, J 13,1 Hz, 10-H2)], due metine [d 2,15 (1H, dd, J 7,2, 8,9 Hz, 9-H) e 2,23 (1H, m, 5- H)] e un gruppo acetale [d 4,81 (1H, d, J 8,9 Hz, 1-H)] insieme a una frazione b-glucopiranosile [d 4,70 (d, J 7,9 Hz, 1 - H)]. Come mostrato in Fig. 1, l'esperimento di spettroscopia di correlazione 1 H–1H (1 H–1 H COSY) su 1 ha indicato la presenza di strutture parziali scritte in grassetto. Nell'esperimento di correlazione eteronucleare a legami multipli (HMBC) su 1, sono state osservate correlazioni a lungo raggio tra i seguenti protoni e atomi di carbonio (1-H e 3-C, 8-C; {{ 124}}H e 1-C; 7-H e 8-C, 10-C; 9-H e 8-C; {{131 }}H2 e 7-C, 8-C; 1 -H e 1-C) come mostrato in Fig. 1. Successivamente, la relativa stereostruttura di 1 era caratterizzata da un nucleo sensibile alla fase Esperimento di spettroscopia di potenziamento Overhauser (NOESY sensibile alla fase), che ha mostrato correlazioni NOE tra le seguenti coppie di protoni (1-H e 3a H; 3a-H e 4a-H; 3b-H e 4b-H; 4b-H e 5-H, 9-H; 5- H e 6b-H, 9-H; 6a-H e 7-H; 7-H e 10-H2), come mostrato in Fig. 1. Gli spettri 1 H- e 13C-NMR di 1 erano sovrapponibili a quelli del costituente iridoide principale 6-deossicatalpol (6), ad eccezione dei segnali dovuti alla parte satura del d-lattolo. Infine, l'idrogenazione di 6 ha dato 1, così che la stereostruttura del kankanoside L è stata chiarita come 3,4- diidro-6-desossicatalpolo (1).
Kankanoside M (2) è stato ottenuto come polvere bianca con rotazione ottica negativa ([a]D 26 18,7 in MeOH). Lo spettro IR di 2 mostrava bande di assorbimento a 3433, 1736, 1655 e 1076 cm 1 attribuibili alle frazioni idrossile, d-lattone, olefina ed etere. Lo spettro FAB-MS di 2 ioni positivi ha mostrato un picco di ioni quasimolecolare a m/z 353 [M Na] e la formula molecolare è stata determinata come C15H22O8 mediante misurazione FAB-MS di ioni positivi ad alta risoluzione. Idrolisi acida di 2 con D-glucosio liberato da HCl 1,0 M. Gli spettri NMR 1 H- e 13C di 2 (CD3OD, Tabelle 1, 2) hanno mostrato segnali assegnabili a quattro metileni [d 1,66, 2,11 (1H ciascuno, entrambi m, 4-H2), 2,15, 2,75 (1H ciascuno , entrambi m, 6-H2), 4,29 (1H, ddd, J 2,8, 8,4, 14,3 Hz, 3b-H), 4,32, 4,51 (1H ciascuno, entrambi d, J 13,1 Hz, 10- H2), 4,35 (1H, ddd, J 3,1, 6,7, 14,3 Hz, 3a-H)], due metine [d 2,97 (1H, m, 5-H), 3,82 (1H, br s, {{ 84}}H)], un'olefina [d 5,94 (1H, m, 7-H)] e un gruppo lattone saturo (d C 174,9) insieme a una frazione bD-glucopiranosile [d 4,32 (1H, d , J 7,9 Hz, 1 -H)]. Come mostrato in Fig. 1, l'esperimento 1 H–1H COZY su 2 ha indicato la presenza di strutture parziali scritte in grassetto e, nell'esperimento HMBC, sono state osservate correlazioni a lungo raggio tra le seguenti coppie di protoni e carbonio ({{105 }}H e 1-C; 7-H e 9-C; 9-H e 1-C, 8-C; {{112} }H2 e 7-C, 8-C, 9-C; 1 -H e 10-C). La relativa stereostruttura di 2 è stata caratterizzata da un esperimento NOESY sensibile alla fase, che ha mostrato correlazioni NOE tra le seguenti coppie di protoni (3a-H e 4a-H; 3b-H e 4b-H; 4b-H e 5- H; 5-H e 6b-H, 9-H) come mostrato in Fig. 1. Pertanto, la stereostruttura di 2 è stata chiarita come mostrato.
Kankanoside N (3) è stato isolato come polvere bianca con rotazione ottica negativa ([a]D 25 24,6 in MeOH). Nello ione positivo FAB-MS di 3, è stato osservato un picco di ioni quasimolecolare a m/z 371 [M Na] . La formula molecolare C16H28O8 è stata determinata mediante misurazione FAB-MS ad alta risoluzione. L'idrolisi acida di 3 con 1.0 M HCl ha liberato D-glucosio. I dati 1 H- e 13C-NMR (CD3OD, Tabelle 1, 2) hanno mostrato segnali assegnabili a un metile [d 1.07 (3H, d, J 7,2 Hz, 10-H3)] , quattro metilene {d 1,37, 1,87 (1H ciascuno, entrambi m, 7-H2), 1,65, 1,81 (1H ciascuno, entrambi m, 6-H2), [3,65 (1H, dd, J 9,1 , 9,8 Hz), 3,90 (1H, gg, J 5,9, 9,8 Hz), 11-H2] e [3,70 (1H, gg, J 3,3, 12,0 Hz), 3,88 (1H, m), {{ 71}}H2]}, quattro metine [d 1,69 (1H, m, 4-H), 1,75 (1H, m, 9-H), 2,06 (1H, m, 8- H), 2,16 (1H, m, 5-H)] e un gruppo emiacetale [d 4,67 (1H, d, J 7,4 Hz, 1-H)] insieme a una parte bD-glucopiranosile [ d 4,26 (1H, d, J 7,9 Hz, 1 -H)]. La struttura iridoide di 3 è stata chiarita dagli esperimenti 1 H-1 H COZY e HMBC e la relativa stereostruttura è stata caratterizzata da un esperimento NOESY sensibile alla fase come mostrato in Fig. 1. Di conseguenza, la sterostruttura di 3 è stata chiarita come mostrato.
Strutture dei Kancanosides O (4) e P (5)
Anche i kancanosides O (4) e P (5), C16H26O8, sono stati ottenuti come polveri bianche con rotazioni ottiche negative (4: [a]D 23 26,1; 5: [a]D 21 32,7 entrambi in MeOH). Gli spettri IR di 4 e 5 hanno mostrato bande di assorbimento a 3433, 1696, 1647 e 1076 cm 1 per 4 e a 3434, 1701, 1647 e 1{{96} }76 cm 1 per 5, ascrivibili alle funzioni glicosidica, carbossilica e olefinica. I loro spettri UV hanno mostrato un massimo di assorbimento comune a 217 nm indicando la presenza di una parte di acido carbossilico b-insaturo in entrambi. L'idrolisi acida di 4 e 5 ha liberato D-glucosio, mentre mediante l'idrolisi enzimatica con b glucosidasi, 4 e 5 hanno dato (2E,6E)-8-idrossi-2,6-dimetil{{39 }},{{40}}acido ottadecenoico20) (4a) e (2E,6E)-8-idrossi-3,7- dimetil{{ 48}},6-acido ottadecenoico21) (5a), rispettivamente. 1 dati H- e 13C-NMR di 4 (CD3OD, tabelle 2, 3) hanno mostrato segnali assegnabili a due metils [d 1,71 (3H, br s, 10-H3), 1,81 (3H, d, J 1,0 Hz , 9-H3)], tre metileni {d 2,19 (2H, br t, J ca. 7 Hz, 5-H2), 2,36 (2H, m, 4-H2), [ 4,24 (1H, dd, J 7,6, 12,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J 6,2, 12,0 Hz), 8-H2]} e due olefine trisostituite [d 5,41 (1H, ddd, J 1,2, 6,2, 7,6 Hz, 7- H), 6,75 (1H, tq, J 7,2, 1,0 Hz, 3-H)] insieme a una parte di glucopiranosile bD [d 4,34 (d, J 7,8 Hz, 1 -H)]. Confrontando i segnali di carbonio nello spettro 13C-NMR di 4 con quelli di 4a, è stato osservato uno spostamento della glicosilazione nella posizione 8- (d C 4: 65,5; 4a: 59,4). La posizione del legame glucoside è stata confermata anche da esperimenti HMBC come mostrato in Fig. 2. Di conseguenza, la stereostruttura di 4 è stata chiarita come (2E,6E)-8-bD-glucopiranosilossi-2,{{ acido 143}}dimetil-2,{145}}ottadecenoico. D'altra parte, i dati 1H- e 13C-NMR di 5 (CD3OD, tabelle 2, 3) indicavano la presenza di un (2E,6E)-8-idrossi-3,{{158} }dimetil-2,6-parte dell'acido ottadecenoico [d 1,70 (3H, br s, 10- H3), 2,14 (3H, br s, 9- H3), 2,24 ( 2H, m, 4-H2), 2,27 (2H, m, 5-H2), 4,05, 4,20 (1H ciascuno, entrambi br d, J circa 12 Hz, 8-H2) , 5,47 (1H, tq, J 7,1, 0,9 Hz, 6-H), 5,67 (1H, br s, 1-H)] insieme a una parte di bD-glucopiranosile [d 4,23 (d, J 7,7 Hz, 1 -H)]. La connettività della parte bD-glucopiranosile in 5 è stata chiarita sulla base di esperimenti HMBC come mostrato in Fig. 2. Inoltre, è stato osservato un tipico spostamento della glicosilazione per i segnali in posizione 8- (d C 5: 75,6; 5a: 68.8). Sulla base delle suddette prove, la stereostruttura di 5 è stata determinata essere (2E,6E)-8-bD-glucopiranosilossi-3,7-dimetil-2,{ {230}}acido octadienoico.
Effetti dei costituenti sulla citotossicità indotta dal fattore di necrosi tumorale-a (TNF-a) nelle cellule L929
Il TNF-a è noto per mediare una varietà di lesioni d'organo attraverso la sua induzione dell'apoptosi cellulare. Nel caso del fegato, gli effetti biologici del TNF-a sono stati implicati nel danno epatico indotto da tossine epatiche, ischemia/riperfusione, epatite virale e alcol.22-24) Pertanto, il TNF-a è considerato un importante obiettivo di scoprire agenti antinfiammatori ed epatoprotettivi. Sulla base del concetto sopra menzionato, abbiamo studiato i costituenti protettivi dei prodotti naturali sulla morte cellulare indotta dal TNF-a nelle cellule L929, una linea cellulare sensibile al TNF-a.25) In precedenza, abbiamo riportato che diversi costituenti da Piper Chaba, 26—29) Boesenbergia rotunda, 30,31) Punica granatum, 32) Helichrysum arenarium, 33—35) e Sapindus rarak, 36—38) sono stati trovati per mostrare effetti inibitori del TNF-a -citotossicità indotta nelle cellule L929. Poiché anche i costituenti feniletanoidi di C. tubulosa (ad es. echinacoside, acteoside e isoacteoside, ecc.) 5) hanno inibito questa citotossicità, abbiamo ulteriormente esaminato i costituenti iridoide, fenilpropanoide e lignan come mostrato nella Tabella 4. Di conseguenza, il kankanoside A (9, inibizione: 16,3 2,{42}} percento a 100 mM), acido mussaenosidico (10, 44,7 8,7 percento), 8-acido epiloganico (11, 10,7 0,4 percento), 8- idrossigeraniolo 8-ObD-glucopiranoside (17, 21,3 2,4 per cento) e ( )-pinoresinolo ObD-glucopiranoside (22, 22,3 1,6 per cento), sono risultati mostrare un'attività significativa. Sebbene le loro attività fossero più deboli di quelle di echinacoside (IC50 31,1 mM), acteoside (17,8 mM) e isoaceteoside (22,7 mM), i principali costituenti feniletanoidi.5)
Sperimentale
Per ottenere dati spettrali e fisici sono stati utilizzati i seguenti strumenti: rotazioni specifiche, polarimetro digitale Horiba SEPA-300 (l 5 cm); Spettri UV, spettrometro Shimadzu UV-1600; spettri IR, spettrometro Shimadzu FTIR-8100; 1 spettri H- e 13C-NMR, spettrometri JEOL JNM-ECA600 (600, 150 MHz) e JEOL JNM-ECS400 (400, 100 HMz) con tetrametilsilano come standard interno; spettrometro di massa FAB-MS e FAB-MS ad alta risoluzione, JEOL JMS-SX 102A; Rilevatore HPLC, Shimadzu RID-10A indice di rifrazione, Shimadzu SPD-10A UV-VIS e Shodex OR{23}} rilevatori di rotazione ottica. Le colonne HPLC, Cosmosil 5C18-MS-II e pNAP (Nacalai Tesque Inc., 250 4,6 mm id) e (250 20 mm id) sono state utilizzate rispettivamente per scopi analitici e preparativi.
Per la cromatografia sono state utilizzate le seguenti condizioni sperimentali: cromatografia su colonna di gel di silice in fase normale (CC), gel di silice 60N (Kanto Chemical Co., Ltd., 63—210 mesh, sferico, neutro); gel di silice a fase inversa CC, Diaion HP-20 (Nippon Rensui) e Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd., 100—200 mesh); TLC in fase normale, piastre TLC prerivestite con gel di silice 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC a fase inversa, piastre TLC prerivestite con gel di silice RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC a fase inversa, piastre TLC prerivestite con gel di silice RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), il rilevamento è stato ottenuto spruzzando con 1% di Ce(SO4)2– 10% di H2SO4 acquoso, seguito da riscaldamento .
Materiale vegetale
Questo elemento è stato descritto in un precedente rapporto.
Estrazione e isolamento
Gambi freschi di C. tubulosa (2,98 kg) sono stati tagliati finemente ed estratti tre volte con metanolo a riflusso per 3 ore. L'evaporazione del solvente a pressione ridotta ha fornito un estratto metanolico (249,1 g, 8,36 percento). L'estratto metanolico è stato sottoposto a Diaion HP-20 CC (5,0 kg, H2O→MeOH) per ottenere frazioni eluite con H2O e MeOH (167,84 g, 5,63 percento e 81,21 g, 2,73 percento, rispettivamente). La frazione eluita con MeOH (61.00 g) è stata sottoposta a gel di silice in fase normale CC [1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15 : 3 : 0.4→1{{ 36}} : 3 : 0.5→6 : 4 : 1, v/v/v)→MeOH] per dare sette frazioni [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 ({76}},89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) e 7 (4,6{{1{113}}4}} g)], come descritto in precedenza.5) La frazione 1 (1,12 g) è stata separata mediante gel di silice a fase inversa CC [55 g, MeOH–H2O (4 0 : 60, v/v)→MeOH] per dare cinque frazioni [Fr. 1-1 (132,8 mg), 1-2 (267,0 mg), 1-3 (182,8 mg), {{80}} (31{{ 156}},9 mg) e 1-5 (91,4 mg)]. La frazione 1-1 (132,8 mg) è stata ulteriormente purificata mediante HPLC [Cosmosil 5C{{9{{160}}}}MS-II, CH3CN–1% AcOH acquoso (1{{166} } : 90, v/v)] per somministrare il kankanoside M (2, 2,8 mg, 0.{{203}}{{22{{24{{248 }}}}}}01 percento ), bartsioside (7, 5,2 mg, 0.0002 percento ), aldeide sinapica {{1{{295 }}6}}O-bD-glucopiranoside (21, 1,4 mg, {{3{{3{{3{{310}}9}}5}}{{320} }}}.0001 percento ). La frazione 1-2 (267.{{350}} mg) è stata ulteriormente purificata mediante HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% AcOH acquoso (7 : 93, v/v)] per dare (2E,6E)-3,7-dimetil-8-idrossiottadiene{{13{{360}}}}il-O-bD -glucopiranoside (16, 15,8 mg, {{370}}.{{406}}007 percento), 8-idrossigeraniolo 8-ObD glucopiranoside (17, 5,2 mg, 0,0002 percento), ( )-pinoresinolo ObD-glucopira noside (22, 22,0 mg, 0,0010 percento), eucommin A (23, 5,0 mg, 0,0002 percento), isoeu commin A (24, 21,3 mg, 0,0010 percento) e ()-siringaresinolo ObD-glucopia ranoside (25, 98,0 mg, 0,0044 percento). La frazione 2 (9,56 g) è stata separata mediante gel di silice a fase inversa CC [400 g, MeOH–H2O (10 : 90, v/v)→MeOH→ acetone] per dare cinque frazioni [Fr. 2-1 (55,9 mg), 2-2 (4,48 g), 2-3 (3,42 g), 2-4 (1,16 g) e 2-5 (31,9 mg) ], come descritto in precedenza.5) La frazione 2-2 (500,0 mg) è stata sottoposta a HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% AcOH acquoso (5 : 95, v/v )] per somministrare kankanoside L (1, 6,6 mg, 0,0026 percento) e 6-desossicatalpol (6, 455,5 mg, 0,182 percento). La frazione 2-3 (1,00 g) è stata sottoposta a HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% AcOH acquoso (7 : 93, v/v)] per ottenere sette frazioni [Fr . 2-3-1 (66,5 mg), 2-3-2 (20,4 mg), 2-3-3 (26,0 mg), 2-3-4 (136,6 mg), 2-3-5 [ 7 (380,6 mg) , 0,0581 percento )], 2-3-6 [ gluroside (8, 285,1 mg, 0,0435 percento )] e 2-3-7 (84,9 mg)]. La frazione 2-3-4 (106,6 mg) è stata ulteriormente purificata mediante HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 percento AcOH acquoso (5: 95, v/v)] per dare 6 (68,4 mg, 0,0134 percento) insieme a salidroside5) (13,7 mg, 0,0027 percento). La frazione 2-4 (1,16 g) è stata sottoposta a HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1% AcOH acquoso (15 : 85, v/v) e Cosmosil pNAP, CH3CN–1% AcOH acquoso (10: 90 o 15: 85, v/v)] per dare kancanosides N (3, 15,6 mg, 0,0007 percento), O (4, 44,1 mg, 0,0020 percento) e P (5, 4,2 mg, 0,0002 percento), 6 (24,0 mg, 0,0011 percento), 8 (17,7 mg, 0,0008 percento), kankanoiside A (9, 22,3 mg, 0,0010 percento), 8-acido epiossiloganico (12, 8,1 mg, 0,0004 percento), kankanoside E (14, 58,1 mg, 0,0026 percento), (2E,6Z)-8-bD-glucopia ranosilossi-2,6-dimetil-2,6-ottadienoico acido (15, 31,0 mg, 0,0014 percento), 16 (168,6 mg, 0,0075 percento), 17 (94,3 mg, 0,0042 percento), betulalbuside A (18, 8,1 mg, 0,0004 percento), coniferina (19, 3,8 mg, 0,0002 percento ) e siringina (20, 33,9 mg, 0,0015 percento). La frazione 4 (10,69 g) è stata separata mediante gel di silice a fase inversa CC [500 g, MeOH–H2O (30 : 70, v/v)→MeOH→acetone] per dare quattro frazioni [Fr. 4-1 (878,2 mg), 4-2 (7,06 g), 4-3 (1,57 g) e 4-4 (792,8 mg)], come descritto in precedenza.5) Il la frazione 4-1 (500,0 mg) è stata purificata mediante HPLC [Cosmosil 5C{397}}MS-II, CH3CN–1% AcOH acquoso (10 : 90, v/v)] per dare acido mussaenosidico (10, 39,1 mg, 0,0031 percento) e acido geniposidico (13, 51,2 mg, 0,0040 percento). La frazione 5 (8,84 g) è stata separata mediante gel di silice a fase inversa CC [400 g, MeOH–H2O (20: 80→30:70, v/v)→MeOH→acetone] per dare sette frazioni [Fr. 5-1 (870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) e 5-7 (130,1 mg)], come descritto in precedenza.5) La frazione 5-1 (870,2 mg) è stata ulteriormente purificata mediante HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN –1 percento di AcOH acquoso (5 : 95, v/v)] per dare 10 (55,3 mg, 0,0025 percento) e 8-acido epiloganico (11, 51,5 mg, 0,0023 percento).
Kankanoside L (1): una polvere bianca, [a]D 26 45,7 (c 0.48, MeOH). FAB-MS a ioni positivi ad alta risoluzione: Calcd per C15H24O9Na [M Na] 371.1318; Trovato 371.1309. IR (KBr, cm 1 ): 3433, 2928, 1080. 1 H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dato in Tabella 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dato in Tabella 2. Positivo- ione FAB-MS m/z: 371 [M Na] . FAB-MS a ioni negativi m/z: 347 [MH] .
Kankanoside M (2): una polvere bianca, [a]D 26 18,7 (c 0.11, MeOH). FAB-MS a ioni positivi ad alta risoluzione: Calcd per C15H22O8Na [M Na] 353.1212; Trovato 353.1208. IR (KBr, cm 1 ): 3433, 2924, 1736, 1655, 1076. 1 H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dato in Tabella 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dato in Tabella 2. FAB-MS a ioni positivi m/z: 353 [M Na] .
Kankanoside N (3): una polvere bianca, [a]D 25 24,6 (c 1.00, MeOH). FAB-MS a ioni positivi ad alta risoluzione: Calcd per C16H28O8Na [M Na] 371.1682; Trovato 371.1686. IR (KBr, cm 1 ): 3415, 2874, 1076, 1028. 1 H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dato nella tabella 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dato nella tabella 2. Ioni positivi FAB-MS m/z: 371 [M Na] .
Kankanoside O (4): una polvere bianca, [a]D 23 26,1 (c 2,30, MeOH). FAB-MS a ioni positivi ad alta risoluzione: Calcd per C16H26O8Na [M Na] 369.1525; Trovato 369.1528. UV [l max (log e), MeOH, nm]: 217 (4,04). IR (KBr, cm 1 ): 3433, 2926, 1696, 1647, 1076. 1 H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dato nella tabella 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dato nella tabella 2. FAB-MS a ioni positivi m/z: 369 [M Na] .
Kankanoside P (5): una polvere bianca, [a]D 21 32,7 (c 0.18, MeOH). FAB-MS a ioni positivi ad alta risoluzione: Calcd per C16H26O8Na [M Na] 369.1525; Trovato 369.1520. UV [l max (log e), MeOH, nm]: 217 (4,08). IR (KBr, cm 1 ): 3434, 2926, 1701, 1647, 1076. 1 H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: dato nella tabella 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: dato nella tabella 2. FAB-MS a ioni positivi m/z: 369 [M Na] .
Idrolisi acida dei kankanosides L—P (1—5): soluzioni di 1—5 (ciascuno 1.0 mg) in 1.{7}} M HCl (1.0 ml) erano riscaldato a 80 gradi per 3 h. Dopo essere stata raffreddata, la miscela di reazione è stata neutralizzata con Amberlite IRA-400 (forma OH) e le resine sono state rimosse mediante filtrazione. Dopo la rimozione del solvente a pressione ridotta, il residuo è stato separato dalla colonna a cartuccia Sep-Pak C18 (H2O→MeOH). La frazione eluita con H2O è stata sottoposta ad analisi HPLC nelle seguenti condizioni: colonna HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd., Tokyo, Giappone); rilevamento, rotazione ottica [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tokyo, Giappone); fase mobile, CH3CN–H2O (85: 15, v/v); tasso di compagni 0,8 ml/min]. L'identificazione del D-glucosio presente nelle frazioni H2O-eluite di 1-5 è stata effettuata confrontando i loro tempi di ritenzione e rotazione ottica con quelli di un campione autentico [tR 17,9 min (positivo)].
Idrogenazione di {{0}}Deoxycatalpol (6) Una sospensione di 6 (12.{7}} mg) e 10 percento di carbonio di palladio (5.0 mg) in MeOH (2,0 ml) è stato agitato a temperatura ambiente in atmosfera di H2 per 2 ore. Il catalizzatore è stato filtrato via e il filtrato è stato condensato a pressione ridotta a dare 1 (12,0 mg, quant.).
Idrolisi enzimatica di Kankanosides O (4) e P (5) con b-glucosidasi Ad una soluzione di 4 (8.{5}} mg) in H2O (1,5 ml) è stata aggiunta b-glucosidasi (4,7 mg, da mandorla, Oriental Yeast Co., Tokyo, Giappone) e la soluzione è stata agitata a 37 gradi per 24 ore. La reazione è stata spenta mediante l'aggiunta di EtOH (5.0 ml), la miscela è stata condensata a pressione ridotta. Il residuo è stato estratto con EtOAc e l'evaporazione del solvente ha dato (2E,6E)-8-idrossi-2,{{20}}dimetil-2,{{22} }acido ottadecenoico20) (4a, 3,9 mg, 92 percento). Attraverso una procedura simile, (2E,6E)-8-idrossi-3,7-dimetil-2,6-acido ottadecenoico21) (5a, 0,9 mg, 94 percento ) è stato ottenuto dal kankanoside P (5, 1,8 mg).
Metodo di saggio biologico L'effetto inibitorio sulla citotossicità indotta da TNF-a nelle cellule L929 è stato saggiato con il metodo descritto in un precedente articolo.5)
Statistica I valori sono espressi come mezzi SEM L'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal test di Dunnett è stata utilizzata per l'analisi statistica. I valori di probabilità (p) inferiori a 0.05 sono stati considerati significativi.
erba cistancia
