L'attivazione dipendente dall'ISG15-del sensore MDA5 è antagonizzata dalla proteasi simile alla papaina del SARS-CoV-2 per eludere l'immunità innata dell'ospite

L'attivazione dei recettori RIG-I-like, del gene I inducibile dall'acido retinoico (RIG-I) e della proteina 5 associata alla differenziazione del melanoma (MDA5) stabilisce uno stato antivirale sovraregolando i geni stimolati dall'interferone (IFN) (ISG). Tra questi c’è l’ISG15, il cui ruolo meccanicistico nell’immunità innata rimane ancora enigmatico. Nel presente studio, riportiamo che la coniugazione ISG15 è essenziale per le risposte IFN antivirali mediate dal sensore di RNA virale MDA5. L'ISGilazione dei domini di attivazione e reclutamento della caspasi di MDA5 promuove la sua oligomerizzazione e quindi innesca l'attivazione dell'immunità innata contro una serie di virus, inclusi coronavirus, flavivirus e picornavirus. L'attivazione dipendente dall'ISG15-di MDA5 viene antagonizzata attraverso la de-ISGilazione diretta mediata dalla proteasi simile alla papaina di SARS-CoV-2, un coronavirus emerso di recente che ha causato la pandemia di COVID-19 . Il nostro lavoro dimostra un ruolo cruciale per ISG15 nella risposta antivirale mediata da MDA5-e identifica anche un meccanismo chiave di evasione immunitaria del SARS-CoV-2, che potrebbe essere preso di mira per lo sviluppo di nuovi antivirali e vaccini per combattere il COVID-19.

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La perturbazione virale dell’omeostasi immunitaria dell’ospite è monitorata dal sistema immunitario innato, che si basa su recettori che rilevano modelli molecolari associati al pericolo o al patogeno (PAMP)1-3. I recettori RIG-I-like (RLR) RIG-I e MDA5 sono fondamentali per il rilevamento del virus esaminando il citoplasma alla ricerca di RNA immunostimolanti virali o derivati ​​dall'ospite4. Il legame dell'RNA al dominio C-terminale (CTD) e all'elicasi di RIG-I e MDA5 porta alla loro conformazione innescata dal segnale che consente il reclutamento di diversi enzimi5. Questi enzimi modificano le RLR in più domini e siti e le modifiche post-traduzionali (PTM) sono particolarmente ben studiate per i domini di attivazione e reclutamento della caspasi (CARD), i moduli di segnalazione. La proteina fosfatasi 1 (PP1) / defosforila le CARD RIG-I e MDA56 . Nel caso di RIG-I, la defosforilazione promuove la poliubiquitinazione delle CARD legata alla Lys63- da parte di TRIM25 (motivo tripartito contenente 25) e altre ligasi E37,8, che stabilizza la forma oligomerica di RIG-I, consentendo così l'attività antivirale mitocondriale -legame con la proteina di segnalazione (MAVS). Rispetto a quelli del RIG-I, i singoli passaggi dell'attivazione di MDA5 e i PTM critici coinvolti sono meno ben compresi. L'attivazione di RLR induce la produzione di IFN di tipo I e III che, a loro volta, propagano la segnalazione antivirale sovraregolando gli ISG9,10. Tra questi c'è ISG15, una proteina simile all'ubiquitina che può essere coniugata covalentemente ai residui di lisina delle proteine ​​​​bersaglio, un processo PTM chiamato ISGylation11. Sebbene sia stato ampiamente riconosciuto che la coniugazione ISG15 agisce in modo antivirale12, i meccanismi di ISGylazione della proteina ospite che potrebbero spiegare l'ampia attività di restrizione antivirale di ISG15 sono attualmente sconosciuti. L'agente eziologico della pandemia di COVID-19 in corso, la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SCoV2), appartiene alla famiglia dei Coronaviridae che contiene numerosi altri agenti patogeni umani. I coronavirus hanno un'eccezionale capacità di sopprimere le risposte antivirali mediate dall'IFN e una bassa produzione di IFN nei pazienti infetti da SCoV2-è correlata a una malattia grave13. Tra gli antagonisti dell'IFN coronavirale c'è la proteasi simile alla papaina (PLpro) che ha attività deubiquitinanti e de-ISGilanti14,15. Nel presente studio, identifichiamo un ruolo essenziale per ISGylation nell'attivazione di MDA5. Mostriamo inoltre che SCoV2 PLpro interagisce con MDA5 e antagonizza l'attivazione di MDA5 dipendente da ISG15- tramite de-ISGylazione attiva, rivelando che SCoV2 si è già evoluto per sfuggire alla sorveglianza immunitaria da parte di MDA5.

Risultati

MDA5, ma non RIG-I, la segnalazione richiede ISG15.

Per identificare i PTM delle CARD MDA5 che possono regolare l'attivazione di MDA5, abbiamo sottoposto MDA5–2CARD purificato per affinità fuso con glutatione-S-transferasi (GST–MDA5–2CARD), o GST da solo, a cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC –MS/MS) e hanno scoperto che, in particolare, GST–MDA5–2CARD è stato co-purificato con ISG15, che appariva come due bande che migravano più lentamente (di ~15 e 30 kDa) rispetto a GST–MDA5–2CARD non modificato (Extended Data Figura 1a). L'immunoblotting (IB) ha confermato che GST-MDA5-2CARD è modificato da ISG15 (dati estesi Fig. 1b). Successivamente abbiamo determinato la rilevanza di ISG15 per la segnalazione indotta da MDA5-. Mentre l’espressione di FLAG-MDA5 nei fibroblasti embrionali (MEF) di topo wild-type (WT) ha indotto RNA e proteine ​​messaggero dell’IFN nonché trascritti di Ccl5 in modo dose-dipendente, l’espressione di FLAG-MDA5 nei MEF Isg15−/− ha portato all’ablazione espressione di geni e proteine ​​antivirali (Fig. 1a e Dati estesi Fig. 1c). Allo stesso modo, l'induzione del gene antivirale è fortemente diminuita nelle cellule HeLa (umane) ISG15 knockout (KO) rispetto alle cellule di controllo WT (Fig. 1b e Dati estesi Fig. 1d), escludendo un effetto specie-specifico. Al contrario, FLAG-RIG-I ha indotto quantità comparabili di proteina IFN- secreta così come trascrizioni Ifnb1 e Ccl5 in Isg15−/− e MEF WT (Fig. 1a e Dati estesi Fig. 1c). Le trascrizioni IFNB1 e CCL5 così come la produzione di proteine ​​IFN da parte di FLAG-RIG-I erano simili o leggermente migliorate nelle cellule HeLa ISG15 KO rispetto alle cellule WT (Fig. 1b e Dati estesi Fig. 1d), in linea con precedenti rapporti secondo cui ISGylation negativamente influisce sulla segnalazione RIG-I16,17

Figura 1|ISGylation è richiesto per la segnalazione MDA5, ma non per RIG-I. a, b, ELISA di IFN- da surnatanti di MEF (WT o Isg15−/−) (a) e cellule HeLa (WT o ISG15 KO) (b) trasfettate transitoriamente con quantità crescenti di MDA5 o RIG-I marcate con FLAG per 40 ore. I lisati di cellule intere (WCL) sono stati analizzati da IB con anti-ISG15, anti-FLAG e anti-actina (controllo del caricamento). c, ELISA di IFN- da surnatanti di MEF WT o Isg15−/− che sono stati simulatamente stimolati o trasfettati con RNA EMCV (0.1 o 0.4 µg ml−1), HMW-poly (I: C) (0.5 µg ml−1 ) o RABVLe (1 pmol ml−1 ), o infetto da SeV (10 unità di emoagglutinazione (HAU) ml−1 ) per 24 H. d, analisi RT-qPCR degli mRNA Ifnb1, Ccl5 e Tnf nei MEF WT e Isg15−/− stimolati come in c. e, fosforilazione di IRF3 nelle WCL di NHLF che sono state trasfettate con i siRNA indicati per 30 ore e quindi simulatamente stimolate o trasfettate con EMCV RNA (0,4 µg ml−1) o RABVLe (1 pmol ml−1) per 6 ore, valutata mediante IB con anti-pSer396-IRF3 e anti-IRF3. f, ELISA di IFN- da surnatanti di NHLF che sono stati trasfettati con i siRNA indicati per 30 ore e quindi simulati o trasfettati con EMCV RNA (0,4 µg ml−1) o RABVLe (1 pmol ml−1) o infettati con SeV (10 HAU ml−1) per 16 ore. g, ELISA di IFN- dai surnatanti di PBMC che sono stati trasdotti per 40 ore con le particelle lentivirali shRNA indicate e quindi infettati con mutEMCV (MOI=10) o SeV (200 HAU ml−1) per 8 ore. h, analisi RT-qPCR dell'mRNA di IFNA2 e IL-6 in PBMC che sono stati trasdotti e infettati come in g. I dati rappresentano almeno due esperimenti indipendenti con risultati simili (media ± sd di n= 3 repliche biologiche in a–d e f e media di n= 2 repliche biologiche in g e h). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.

Successivamente abbiamo testato l'effetto della delezione del gene ISG15 sull'attivazione di MDA5 e RIG-I endogeni da parte dei rispettivi ligandi. La produzione di IFN nonché l'espressione genica di IFNB1, CCL5 e TNF indotte dalla trasfezione dell'RNA del virus dell'encefalomiocardite (EMCV) o del poli(I: C) ad alto peso molecolare (HMW), entrambi rilevati prevalentemente da MDA5, erano profondamente attenuati nelle cellule Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa e ISG15 KO HAP-1 rispetto alle rispettive cellule di controllo (Fig. 1c, d e Dati estesi Fig. 1e-g). È importante sottolineare che l'ablazione dell'induzione del gene antivirale mediante RNA EMCV o HMW-poli(I: C) nelle cellule KO ISG15 non era dovuta all'espressione genica MDA5 abrogata; al contrario, l'espressione dell'mRNA MDA5 è stata migliorata nelle cellule ISG15 KO rispetto alle cellule WT (Dati estesi Fig. 1f, g). Contrariamente alla stimolazione con agonisti MDA5, la stimolazione di Isg15−/− MEF e cellule HeLa ISG15 KO da parte della trasfezione dell'RNA leader del virus della rabbia (RABVLe) o dell'infezione del virus Sendai (SeV), che sono stimoli RIG-I, ha portato alla produzione di IFN e espressione genica antivirale paragonabile alle cellule WT (Fig. 1c, d e Dati estesi Fig. 1e). Per escludere potenziali effetti clonali che potrebbero essere associati alle cellule prive del gene ISG15, abbiamo eseguito esperimenti di silenziamento genico transitorio nei fibroblasti primari normali del polmone umano (NHLF). Il silenziamento dell'ISG15, simile al knockdown dell'MDA5, ha portato a una perdita quasi completa della fosforilazione del fattore di regolamentazione dell'IFN 3 (IRF3) - un segno distintivo dell'attivazione del segnale RLR - in seguito alla stimolazione con l'RNA di EMCV ma non alla produzione di IFN inibita da RABVLe così come alla espressione del trascritto antivirale negli NHLF trasfettati con RNA EMCV, ma non nelle cellule stimolate con RABVLe o SeV (Fig. 1f e Dati estesi Fig. 1h). Anche il silenziamento mediato da piccoli hairpin (sh)RNA di ISG15 o MDA5 nelle cellule mononucleate primarie del sangue periferico umano (PBMC) ha ridotto sostanzialmente l'espressione delle proteine ​​antivirali e dei trascritti dopo l'infezione con un EMCV mutante ricombinante (mutEMCV) carente dell'antagonismo di MDA518,19, rispetto a PBMC infetti trasdotti con shRNA di controllo non mirato (Fig. 1g, h e Dati estesi Fig. 1i). Al contrario, la deplezione di ISG15 o MDA5 non ha influenzato le risposte delle citochine nei PBMC dopo l'infezione da SeV (Fig. 1g, h e Dati estesi Fig. 1i). Questi risultati mostrano che ISG15 è essenziale per la segnalazione immunitaria da parte di MDA5, ma non RIG-I. Le CARD MDA5 sono ISGilate a Lys23 e Lys43.

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Per corroborare la nostra analisi sulla SM che ha identificato l'ISGylazione di MDA5–2CARD, abbiamo prima testato se l'MDA5 endogeno è modificato anche da ISG15. L'MDA5 endogeno è stato fortemente ISGilato in cellule trasfettate con HMW-poly (I: C) o infettate con virus dengue (DENV) o Zika (ZIKV) rilevati da MDA5 (rif. 5) (Fig. 2a). In particolare, l'MDA5 endogeno è stato anche ISGilato in cellule non infette, sebbene a livelli molto bassi (Dati estesi, Fig. 2a), il che è coerente con i risultati precedenti secondo cui molte proteine ​​ospiti sono anche ISGilate a bassi livelli in condizioni normali (non infette)20. Nelle cellule trattate con anti-IFNAR2 per bloccare la sovraregolazione dell'ISG mediata dalla segnalazione IFNAR, il silenziamento di ISG15 o MDA5 ha portato a una riduzione comparabile dell'espressione del gene IFNB1 dopo l'infezione da mutEMCV (Dati estesi Fig. 2b), indicando che ISG15-dipendente La segnalazione MDA5 si verifica anche in assenza di segnalazione IFNAR.

t MDA5Δ2CARD (contenente elicasi e CTD), è il sito primario dell'ISGilazione MDA5 che mostra due bande prominenti per ISGylated 2CARD (Fig. 2b). La ricostituzione di cellule HeLa ISG15 KO con WT ISG15 o con un mutante ISG15 non coniugabile in cui le due glicine necessarie per la coniugazione sono state sostituite con alanina (ISG15-AA)21, ha dimostrato la coniugazione covalente ISG15 (Fig. 2c) . La mutazione dei singoli residui di lisina in GST-MDA5-2CARD in arginina ha rivelato che la mutazione di un singolo sito di Lys23 e Lys43 ha ridotto notevolmente l'ISGylazione (Dati estesi Fig. 2c), mentre la loro mutazione combinata (Lys23Arg / Lys43Arg) ha quasi abolito l'ISGylazione (Fig. 2d) ). Anche FLAG-MDA5 Lys23Arg / Lys43Arg a lunghezza intera ha mostrato un'ISGylazione marcatamente ridotta (Fig. 2e e Dati estesi Fig. 2d); la ISGilazione residua osservata in FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg è probabilmente dovuta a siti minori aggiuntivi nella 2CARD e/o Δ2CARD. Da notare che la mutazione Lys23Arg / Lys43Arg non ha influenzato MDA5–2CARD SUMOylation5 (Dati estesi Fig. 2e). Inoltre, mentre RIG-I–2CARD era fortemente ubiquitinato (che rappresenta l'ubiquitinazione covalente legata a Lys63-7), né MDA5–2CARD WT né il mutante Lys23Arg/Lys43Arg hanno mostrato livelli rilevabili di ubiquitinazione (Extended Data Fig. 2f). Collettivamente, questi risultati indicano che le CARD MDA5 subiscono ISGylation in due siti principali, Lys23 e Lys43.

Per l'attivazione di MDA5 è necessaria la CARD ISGylation.

Confrontando la loro capacità di trasduzione del segnale, i mutanti Lys23Arg e Lys43Arg a sito singolo di MDA5–2CARD hanno mostrato un'attivazione del promotore dell'IFN parzialmente ridotta rispetto a WT MDA5–2CARD, mentre il mutante Lys23Arg/Lys43Arg aveva un'attività di segnalazione profondamente ridotta, che era quasi altrettanto forte come quello dei mutanti difettosi nella segnalazione Ser88Glu e Ser88Asp6 (Extended Data Fig. 2g). Al contrario, un mutante in cui Lys68, che è il residuo di lisina più prossimale a Lys43 e Lys23, è stato sostituito con arginina (Lys68Arg) ha mostrato una coniugazione ISG15 e una competenza di segnalazione paragonabili a WT 2CARD (Extended Data Fig. 2c,g). Anche MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, a differenza di WT MDA5–2CARD, non è riuscito a indurre la dimerizzazione di IRF3 (Dati estesi Fig. 2h). Anche FLAG-MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg o Lys23Arg / Lys43Arg hanno mostrato capacità di attivazione del promotore dell'IFN ridotte, o quasi abolite, rispetto a FLAG-MDA5 WT (Fig. 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ha mostrato un profondo difetto di segnalazione anche quando espresso in quantità elevate, mentre WT MDA5 ha indotto trascrizioni antivirali in modo dose-dipendente (Fig. 2g). D'accordo, la fosforilazione di STAT1, un segno distintivo della segnalazione IFNAR, così come l'espressione della proteina ISG erano altamente indotte da MDA5 WT, ma non da Lys23Arg/Lys43Arg (Fig. 2h). La complementazione di astrociti umani geneticamente modificati (SVGA) MDA5- con MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg o Ser88Glu ha portato a trascrizioni IFNB1, CCL5 e ISG notevolmente ridotte rispetto alle cellule che esprimono WT MDA5 (Fig. 2i e Dati estesi Fig. 2i) . Questi risultati dimostrano che l'ISGylazione su Lys23 e Lys43 è essenziale per le risposte delle citochine mediate da MDA.

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La defosforilazione da parte di PP1 regola l'ISGilazione di MDA5.

Similmente al RIG-I, l'MDA5 è fosforilato all'interno delle CARD nelle cellule non infette, il che impedisce l'autoattivazione; la defosforilazione di RIG-I e MDA5 da parte di PP1 / è cruciale per liberare gli RLR dai loro stati di repressione della segnalazione6,22–24. La defosforilazione di RIG-I consente l'ubiquitinazione delle CARD legata alla Lys63-, che promuove la multimerizzazione e la segnalazione di RIG-I5. I dettagli di come la defosforilazione della CARD (a Ser88) innesca l'attivazione di MDA5 sono rimasti sfuggenti, e quindi abbiamo testato se la defosforilazione regola l'ISGylazione di MDA5. Silenziamento di PP1 / ISGylazione MDA5–2CARD fortemente ridotta (dati estesi Fig. 3a). Inoltre, i mutanti fosfomimetici Ser88Glu e Ser88Asp avevano ridotto l'ISGilazione, mentre il mutante Ser88Ala fosfomimetico mostrava un'ISGilazione più forte rispetto a WT MDA5-2CARD (Dati estesi Fig. 3b). Al contrario, MDA5 WT e Lys23Arg / Lys43Arg avevano una fosforilazione Ser88 comparabile (Dati estesi Fig. 3c). Insieme, questi dati suggeriscono che la defosforilazione di MDA5 in Ser88 precede la CARD ISGylation. Successivamente abbiamo utilizzato la proteina V del virus del morbillo (MeV-V), che antagonizza la defosforilazione di MDA5 Ser88 attraverso PP1 / antagonismo25. L'espressione di MeV-V ha potenziato la fosforilazione di Ser88 (indicativa di defosforilazione ablata) di GST-MDA5-2CARD o FLAG-MDA5 in modo dose-dipendente, come precedentemente mostrato25. La fosforilazione migliorata da parte di MeV-V è correlata a un declino dell'ISGylazione (Dati estesi Fig. 3d, e). Contrariamente a WT MeV-V, un MeV-V mutante che ha abolito il legame PP1-e l'antagonismo di defosforilazione di MDA5-(MeV-VΔtail)25, ha mostrato scarsi effetti sull'ISGylazione di MDA5–2CARD (Extended Data Fig. 3f), rafforzando l'inibizione dell'ISGilazione dovuta principalmente all'inibizione di PP1, e non ad altri effetti antagonisti, da parte di MeV-V. Le proteine ​​V dei virus Nipah e Hendra (NiV-V e HeV-V) hanno anche migliorato la fosforilazione di MDA5 Ser88 e, di conseguenza, hanno smorzato l'ISGylazione di MDA5 (Extended Data Fig. 3g,h), suggerendo che diverse proteine ​​V paramixovirali inibiscono l'ISGylazione di MDA5 attraverso la manipolazione della fosforilazione di Ser88, sebbene i meccanismi precisi per le singole proteine ​​V restino da determinare. Presi insieme, questi dati suggeriscono che l'ISGylazione della MDA5 CARD dipende dalla defosforilazione in Ser88.

ISGylation promuove assiemi MDA5 di ordine superiore.

L'attivazione degli RLR richiede il legame dell'RNA, l'oligomerizzazione degli RLR e la loro traslocazione dal citosol ai mitocondri per l'interazione con MAVS5. Per chiarire il meccanismo con cui ISGylation influisce sull'attività di MDA5, abbiamo prima esaminato se ISGylation influisce sul legame dell'RNA. L'MDA5 endogeno purificato da MEF WT o Isg15−/− ha interagito altrettanto bene con HMW-poli (I: C) in vitro (Dati estesi Fig. 4a). MDA5 WT e Lys23Arg/Lys43Arg hanno mostrato un legame comparabile con HMW-poly (I: C), indicando che ISGylation non influenza la capacità di legame dell'RNA di MDA5 (Extended Data Fig. 4b). Quando abbiamo monitorato la traslocazione di MDA5 dal citosol ai mitocondri in seguito alla stimolazione dell'RNA di EMCV, abbiamo scoperto che il silenziamento di ISG15, ma non la trasfezione C, ha abolito la traslocazione di MDA5 (Fig. 3a). Al contrario, la traslocazione di RIG-I dopo la trasfezione di RABVLe è stata efficiente sia nei pazienti con deplezione di ISG15-che in quelli con si. Cellule trasfettate con C (Fig. 3b). Questi dati hanno indicato che ISGylation regola la traslocazione di MDA5 o un passo a monte di essa. Poiché la traslocazione da citosol a mitocondri di MDA5 richiede l'interazione con 14-3-3η26, abbiamo confrontato il legame 14-3-3η di WT e MDA5 mutante. La capacità di MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg di legare 14-3-3η era simile a quella di WT MDA5 o del mutante Lys68Arg (Dati estesi Fig. 4c). Tuttavia, mentre la stimolazione dell'RNA di EMCV induceva efficacemente l'oligomerizzazione di MDA5 nei MEF WT, la formazione di oligomeri MDA5 è stata ablata nei MEF carenti di ISG15- (Fig. 3c). Il knockdown dell'ISG15 nelle cellule 293T ha anche abolito l'oligomerizzazione di FLAG-MDA5-2CARD (Fig. 3d). Al contrario, la co-espressione dei componenti del macchinario ISGylation, Ube1L e UbcH8, ha fortemente migliorato l'oligomerizzazione di MDA5–2CARD in si. Cellule trasfettate con C, ma non in cellule impoverite di ISG15- (Fig. 3d), indicando che l'ISGilazione è necessaria per la formazione dell'oligomero MDA5. A sostegno di questo concetto, FLAG-MDA5 Lys23Arg / Lys43Arg ha mostrato un'oligomerizzazione quasi abolita, mentre WT MDA5 si oligomerizzava in modo efficiente (Fig. 3e). Abbiamo anche confrontato l'effetto della mutazione Lys23 Arg/Lys43Arg con quello delle mutazioni che distruggono l'oligomerizzazione che si localizzano sull'interfaccia tra i monomeri di MDA5 e impediscono la filamentazione di MDA5 mediata dal legame dell'RNA (Ile841Arg/Glu842Arg e Asp848Ala/Phe849Ala)27,28, o alle CARD (Gly74Ala/Trp75Ala) e interrompono l'oligomerizzazione di 2CARD27. A differenza di WT MDA5, il mutante Lys23Arg/Lys43Arg, simile a MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, ha mostrato un'oligomerizzazione carente e, coerentemente con ciò, ha abolito la capacità di attivazione del promotore dell'IFN (Fig. 3f,g). L'introduzione di Lys23Arg/Lys43Arg nello sfondo Ile841Arg/Glu842Arg o Asp848Ala/Phe849Ala, ciascuno dei quali di per sé ha ridotto l'oligomerizzazione e la segnalazione di MDA5, ha anche abolito la formazione di oligomeri MDA5 e l'induzione di IFN (Fig. 3f,g). Poiché LGP2 facilita la nucleazione di MDA5 sull'RNA a doppio filamento e quindi l'oligomerizzazione di MDA529,30, abbiamo confrontato il legame LGP2 di MDA5 WT e Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg / Lys43Arg ha interagito con LGP2 in modo efficiente come WT MDA5 (Extended Data Fig. 4d), rafforzando la proposta che CARD ISGylation promuove l'oligomerizzazione di MDA5 indipendentemente dalla filamentazione mediata dal legame dell'RNA. Collettivamente, questi risultati stabiliscono che ISGylation facilita l'oligomerizzazione delle CARD e gli assemblaggi MDA5 di ordine superiore.

Figura 2|L'attivazione di MDA5 richiede ISGylation su Lys23 e Lys43. un'ISGilazione endogena di MDA5 in NHLF che sono stati trattati in modo simulato, trasfettati con HMW-poli(I: C) (0.1 µg ml−1) per 40 ore (a sinistra) o infettati con DENV o ZIKV (MOI {{ 10}} per ciascuno) per 48 h (a destra), determinato mediante IP con anti-MDA5 (o un controllo isotipico IgG) e IB con anti-ISG15. b, ISGilazione di MDA5–2CARD e MDA5Δ2CARD marcati con FLAG in cellule HEK293T transfettate transitoriamente che esprimevano anche V5–ISG15, HA–Ube1L e FLAG–UbcH8, valutate da FLAG PD e IB con anti-V5 a 40 ore dopo la trasfezione. c, ISGilazione endogena di MDA5 in cellule HeLa ISG15 KO ricostituite stabilmente con il vettore, WT ISG15 o ISG15-AA e co-trasfettate con HA–Ube1L e FLAG–UbcH8 dopo il trattamento con IFN (1,000 U ml−1) per 24 ore, determinato mediante IP con anti-MDA5 e IB con anti-ISG15. d, ISGilazione di GST–MDA5–2CARD WT e Lys23Arg/Lys43Arg in cellule HEK293T co-trasfettate con V5–ISG15, HA–Ube1L e FLAG–UbcH8 per 24 ore, determinate mediante GST PD e IB con anti-V5. e, ISGilazione di FLAG–MDA5 WT e Lys23Arg/Lys43Arg in cellule HEK293T co-trasfettate con V5–ISG15, HA–Ube1L e FLAG–UbcH8, determinate da FLAG PD e IB con anti-V5. f, attività reporter dell'IFN-luciferasi nelle cellule HEK293T che sono state trasfettate per 40 ore con vettore, FLAG-MDA5 WT o mutanti. I valori di luciferasi sono presentati come induzione di piega rispetto ai valori per le cellule trasfettate con vettore, impostati su 1. I WCL sono stati rilevati da IB con anti-FLAG e anti-actina. g, analisi RT-qPCR dell'mRNA di IFNB1 e CCL5 in cellule HEK293T che sono state transfettate transitoriamente con il vettore o con quantità crescenti di FLAG-MDA5 WT o Lys23Arg/Lys43Arg. h, fosforilazione di STAT1 e abbondanza di proteine ​​ISG (IFIT1 e -2) nelle WCL delle cellule HEK293T che sono state transfettate transitoriamente con il vettore o FLAG–MDA5 WT o Lys23Arg/Lys43Arg, determinate da IB. I, analisi RT-qPCR dei geni antivirali indicati negli SVGA MDA5 KO che sono stati ricostituiti transitoriamente con vettore vuoto o MDA5 WT contrassegnato con FLAG, Lys23Arg/Lys43Arg o Ser88Glu. I dati rappresentano almeno due esperimenti indipendenti con risultati simili (media ± sd di n= 3 repliche biologiche in f, g e i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Figura 3|CARD ISGylation promuove la formazione di assiemi MDA5 di ordine superiore. a,b, frazionamento citosol-mitocondri di WCL da NHLF che sono stati trasfettati per 30 h con siRNA di controllo non mirato (si. C) o siRNA specifico per ISG15- (si.ISG15) e quindi trattati in modo simulato o trasfettati con RNA EMCV (0,4 µg ml−1) (a) o RABVLe (1 pmol ml−1) (b) per 16 ore. L'IB è stato eseguito con anti-MDA5 (a), anti-RIG-I (b), anti-ISG15 e anti-actina (a e b). -Tubulina e MAVS sono serviti come marcatori di purezza per la frazione citosolica e mitocondriale, rispettivamente (a e b). c, Oligomerizzazione endogena di MDA5 in MEF WT e Isg15−/− che sono stati trasfettati con RNA EMCV (0,5 µg ml−1) per 16 ore e valutati mediante SDD–AGE e IB con anti-MDA5. Le WCL sono state ulteriormente analizzate mediante SDS-PAGE e analizzate da IB con anti-MDA5 e anti-actina. d, Oligomerizzazione di FLAG–MDA5–2CARD in cellule HEK293T trasfettate con i siRNA indicati, con o senza HA–Ube1L e FLAG–UbcH8 per 48 ore, determinate da NativePAGE e IB con anti-FLAG. Le WCL sono state ulteriormente analizzate mediante SDS-PAGE e analizzate da IB con anti-FLAG, anti-HA, anti-ISG15 e anti-actina. e, Oligomerizzazione di FLAG-MDA5 WT e Lys23Arg/Lys43Arg in cellule MDA5 KO HEK293 transfettate transitoriamente, valutate mediante SDD-AGE e IB con anti-FLAG. Le WCL sono state ulteriormente analizzate mediante SDS-PAGE e IB con anti-FLAG e anti-actina. f, Oligomerizzazione di MDA5 WT marcati con FLAG e mutanti in cellule MDA5 KO HEK293 transfettate transitoriamente, valutate da NativePAGE e IB con anti-MDA5. Le WCL sono state ulteriormente analizzate mediante SDS-PAGE e analizzate da IB con anti-MDA5 e anti-actina. g, attività reporter dell'IFN-luciferasi in cellule MDA5 KO HEK293 che sono state trasfettate per 24 ore con un vettore vuoto o con MDA5 WT contrassegnato con FLAG o mutanti. L'attività della luciferasi è presentata come induzione di piega rispetto ai valori delle cellule trasfettate con vettore, impostati su 1. I dati rappresentano almeno due esperimenti indipendenti con risultati simili (media ± sd di n= 3 repliche biologiche in g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

La segnalazione MDA5 dipendente da ISGylation limita la replicazione del virus.

Successivamente abbiamo valutato se l'ISGylazione di MDA5 è necessaria per la sua capacità di limitare la replicazione del virus. FLAG-MDA5 WT, ma non Lys23Arg / Lys43Arg, ha inibito potentemente (di ~ 2log) la replicazione di EMCV (Fig. 4a). Allo stesso modo, le cellule MDA5 KO HEK293 ricostituite con WT MDA5, ma non le cellule integrate con il mutante Lys23Arg / Lys43Arg, hanno effettivamente limitato la replicazione DENV (Fig. 4b). Abbiamo anche ricostituito gli SVGA di astrociti MDA5 KO, un tipo cellulare fisiologicamente rilevante per l'infezione da ZIKV, con il vettore o con MDA5 WT o Lys23Arg/Lys43Arg, e quindi abbiamo valutato la replicazione di ZIKV in un arco temporale di 40-h. La replicazione di ZIKV è stata attenuata di ~100- volte nelle cellule ricostituite con WT MDA5 rispetto alle cellule che esprimono il vettore. Al contrario, le cellule integrate con MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg non hanno limitato ZIKV, in modo simile alle cellule che esprimono MDA5 Ser88Glu (Fig. 4c). Anche WT MDA5, ma non Lys23Arg/Lys43Arg, ha limitato la replicazione di SCoV2, sebbene in misura minore rispetto a quella osservata per gli altri virus testati (Fig. 4d).

Figura 4|L'ISGylazione è necessaria per la restrizione virale da parte di MDA5. Titoli EMCV nel surnatante delle cellule HEK293T che sono state trasfettate per 40 h con il vettore, o FLAG–MDA5 WT o Lys23Arg/Lys43Arg, e quindi infettate con EMCV (MOI=0.001) per 24 h, determinato mediante dosaggio TCID50. b, Percentuale di cellule MDA5 KO HEK293 infette da DENV che sono state trasfettate per 24 ore con il vettore o con FLAG–MDA5 WT o Lys23Arg/Lys43Arg e quindi trattate simulatamente o infettate con DENV (MOI=5) per 48 ore , valutato dal FACS utilizzando l'anti-flavivirus E (4G2). SSC, dispersione laterale. c, titoli di ZIKV nel surnatante di MDA5 KO SVGA che sono stati trasfettati per 30 ore con MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg o Ser88Glu vettoriali o marcati con FLAG e quindi infettati con ZIKV (MOI=0.1) per i tempi indicati , determinato mediante test della placca. pfu, unità formanti placca; hpi, ore post-infezione. d, titoli di SCoV2 nel surnatante di cellule HEK293T–hACE2 che sono state trasfettate per 24 ore con vettore vuoto o FLAG–MDA5 WT o Lys23Arg/Lys43Arg e quindi infettate con SCoV2 (MOI=0.5) per 24 h, determinato mediante test della placca. e, Schema dell'approccio sperimentale per "disaccoppiare" il ruolo di ISG15 nell'induzione di IFN mediata da MDA5-dal suo ruolo nello smorzare la segnalazione IFNAR. Sup., surnatante. f, le cellule "donatrici" NHLF sono state trasfettate per 40 ore con i siRNA indicati e quindi infettate con mutEMCV (MOI=0.1) per 16 ore. I surnatanti cellulari sono stati inattivati ​​con UV e trasferiti su cellule "riceventi" Vero. Dopo 24 ore, le cellule sono state infettate con ZIKV (MOI=0.002–2) per 72 ore e le cellule positive a ZIKV sono state determinate mediante immunocolorazione con anti-flavivirus E (4G2) e substrato perossidasi TrueBlue. g, le cellule "donatrici" RIG-I KO HEK293 sono state trasfettate con si. C o si.ISG15 insieme al vettore o FLAG–MDA5 WT o Lys23Arg/Lys43Arg, per 24 ore, seguito da infezione da EMCV (MOI=0.001) per 16 ore. I surnatanti cellulari inattivati ​​dai raggi UV sono stati trasferiti su cellule "riceventi" Vero per 24 ore, seguiti da infezione con EMCV (MOI=0.001–0,1) per 40 ore. Gli effetti citopatici indotti da EMCV sono stati visualizzati mediante colorazione Coomassie Blue. I dati rappresentano almeno due esperimenti indipendenti con risultati simili (media ± sd di n= 3 repliche biologiche in a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

Successivamente abbiamo determinato l'effetto del silenziamento dell'ISG15 sulla capacità di MDA5 di inibire la replicazione del virus. Sebbene MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg non sia riuscito a sopprimere la replicazione di EMCV indipendentemente dal silenziamento di ISG15, WT MDA5 ha effettivamente limitato la replicazione di EMCV in si. Cellule C-trasfettate e, inaspettatamente, anche in cellule deplete di ISG15- (Extended Data Fig. 5a). In un'esplorazione del meccanismo alla base di questi risultati inaspettati, abbiamo scoperto che le cellule infettate da EMCV che esprimevano WT MDA5 avevano livelli marcatamente migliorati di espressione della proteina ISG quando ISG15 veniva silenziato rispetto alle cellule infette trasfettate con WT MDA5 e si. C (Dati estesi Fig. 5b). Allo stesso modo, è stata osservata un'elevata trascrizione di ISG e un'espressione proteica in cellule carenti di ISG15- che sono state trasfettate con RNA EMCV o infettate con mutEMCV, nonostante l'interruzione dell'induzione di IFN (Dati estesi Fig. 5c,d). Al contrario, il knockdown dell'MDA5 ha abrogato sia l'espressione della proteina IFN che quella dell'ISG, come previsto (Dati estesi Fig. 5d). Abbiamo notato che l'abbondanza proteica di USP18, un enzima deubiquitinante che regola negativamente la segnalazione IFNAR31, era notevolmente ridotta nelle cellule deplete di ISG15-in seguito all'infezione da EMCV rispetto alle cellule infette trasfettate con si. C o siRNA specifico per MDA5- (Extended Data Fig. 5b,d), che è coerente con il ruolo riportato di ISG15 nella prevenzione della degradazione dell'USP1832. Insieme, questi dati suggeriscono che in contesti sperimentali di targeting genetico ISG15- (ovvero silenziamento o KO) l'effetto antivirale di ISGylation MDA5 è mascherato da un'aberrante sovraregolazione dell'ISG dovuta all'ablazione dell'effetto inibitorio di ISG15 sulla segnalazione IFNAR.

Figura 5|SCoV2 PLpro si lega e deisila MDA5–2CARD. una rappresentazione a nastro della struttura cristallina del complesso SCoV2 PLpro: ISG15 (Banca dati delle proteine, numero di accesso 6YVA). Sono indicati i residui chiave che mediano l'interazione del sito 1 (Asn156 e Arg166/Glu167) o l'interazione del sito 2 (Phe69) in PLpro, nonché il suo sito cataliticamente attivo (Cys111). b, ISGilazione di GST–MDA5–2CARD in cellule HEK293T che sono state co-trasfettate per 20 ore con vettori o SCoV2 PLpro WT marcati con V5-o mutanti, insieme a FLAG–ISG15, HA–Ube1L e FLAG–UbcH8, determinato da GST PD e IB con anti-FLAG e anti-GST. Le WCL sono state analizzate da IB con anti-V5, anti-HA, anti-FLAG e anti-actina. c, Legame di MDA5 o RIG-I con tag HA a SCoV2-PLpro con tag V5- o MeV-V con tag FLAG (controllo positivo) in cellule HEK293T transfettate temporaneamente, determinato da HA PD e IB con anti-V5 o anti-FLAG e anti-HA. Le WCL sono state analizzate da IB con anti-V5 e anti-FLAG. d, Oligomerizzazione di FLAG–MDA5–2CARD in cellule HEK293T che sono state co-trasfettate con il vettore o SCoV2 PLpro WT o Cys111Ala marcate con V5-per 24 ore, valutate da NativePAGE e IB con anti-FLAG. Le WCL sono state ulteriormente analizzate mediante SDS–PAGE e rilevate mediante IB con anti-FLAG, anti-V5 e anti-actina. e, ISGilazione di GST–MDA5–2CARD in cellule HEK293T che esprimevano anche FLAG–ISG15, HA–Ube1L e FLAG–UbcH8 e sono state co-trasfettate per 40 ore con il vettore o il coronavirale PLpro con tag V5- indicato proteine, determinate mediante GST PD e IB con anti-FLAG, anti-V5 e anti-GST. I dati rappresentano almeno due esperimenti indipendenti con risultati simili.

Successivamente abbiamo utilizzato un test di protezione antivirus che disaccoppia sperimentalmente la segnalazione MDA5 nelle cellule infette da virus dalla segnalazione IFNAR a valle nelle stesse cellule (Fig. 4e). Supernatanti di cellule "donatrici" infette da mutEMCV che erano si. C trasfettati, o impoveriti di ISG15 o MDA5, sono stati inattivati ​​con i raggi ultravioletti (UV) e quindi trasferiti su cellule "riceventi" non infette. Le cellule riceventi "preparate" sono state quindi infettate con ZIKV per monitorare direttamente l'effetto antivirale della produzione di IFN mediata da MDA5-da parte delle cellule donatrici. Mentre i surnatanti del si. Le cellule "donatrici" trasfettate con C hanno inibito potentemente la replicazione di ZIKV e i surnatanti delle cellule knockdown ISG15 o MDA5 hanno limitato minimamente l'infezione da ZIKV (Fig. 4f). Allo stesso modo, i surnatanti di coltura delle cellule donatrici infette da EMCV sono stati trasfettati con WT MDA5 insieme a si. C ha portato a una maggiore protezione delle cellule riceventi dalla sfida virale rispetto a quella delle cellule che esprimono WT MDA5 e impoverite di ISG15 (Fig. 4g). Collettivamente, questi dati dimostrano che l'ISGylazione è importante per la restrizione mediata da MDA5-di una serie di virus a RNA.

Figura 6|SCoV2 PLpro inibisce la segnalazione MDA5 mediata da ISG15- attraverso la sua attività di de-ISGilasi. a, analisi RT-qPCR delle trascrizioni IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5 e RIG-I in NHLF che sono stati trasfettati con i siRNA indicati per 40 h e quindi trasfettati con mock RNA o SCoV2 RNA (0,4 µg ml −1) per 24 ore. b, Legame di SCoV2 Nsp3 all'MDA5 endogeno nelle cellule A549-hACE2 infettate con SCoV2 (MOI=0.5) per 24 ore, determinato mediante IP con anti-MDA5 (o un controllo isotipico IgG) seguito da IB con anti-Nsp3 e anti-MDA5. Le WCL sono state analizzate dall'IB con anti-Nsp3 e anti-actina. c, ISGilazione endogena di MDA5 in cellule A549-hACE2 che sono state fintamente infettate o infettate con SCoV2 (MOI=0.5) per 40 ore in presenza di inibitore di PLpro (GRL-0617; 50 µM) o veicolo controllo (dimetilsolfossido), determinato mediante IP con anti-MDA5 (o un controllo isotipico IgG), seguito da IB con anti-ISG15 e anti-MDA5. L'abbondanza proteica di IFIT1, RSAD2, ISG15 e actina nelle WCL è stata sondata da IB. L'efficiente replicazione del virus è stata verificata da IB con anti-Nsp3 e anti-Spike (S). d, analisi RT-qPCR delle trascrizioni IFNB1, CCL5 e IFIT1 e RNA genomico di EMCV (gRNA), in cellule HeLa trasfettate transitoriamente per 24 ore con vettore o V5-SCoV2 PLpro WT o mutanti e quindi infettate con mutEMCV (MOI=0.5) per 12 ore. e, titoli EMCV nel surnatante di cellule RIG-I KO HEK293 che sono state trasfettate transitoriamente per 24 ore con vettore o FLAG–MDA5, insieme a SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala o Arg166Ser/Glu167Arg con tag V5- e quindi infettate con EMCV (MOI=0.001) per 16 ore, determinato mediante test della placca. f, Abbondanza proteica degli ISG indicati nelle WCL dall'esperimento in e, determinata da IB con gli anticorpi indicati. I dati rappresentano almeno due esperimenti indipendenti con risultati simili (media ± sd di n= 3 repliche biologiche in a, d ed e). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

SCoV2 PLpro prende di mira MDA5 per la de-ISGylazione.

I coronavirus come SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV e SCoV2 recentemente emerso codificano un PLpro che media la scissione della poliproteina virale33. Inoltre, PLpro svolge attività di deubiquitinazione e de-ISGylating. Recentemente è stato dimostrato che SCoV2 PLpro modula le risposte antivirali principalmente attraverso la sua attività di de-ISGilasi15. Poiché MDA5 è noto per essere un sensore importante per il rilevamento dei coronavirus34,35 e poiché i nostri dati hanno mostrato che l'ISGilazione è necessaria per la restrizione del virus mediata da MDA5-, abbiamo esaminato se SCoV2 PLpro rimuove enzimaticamente l'ISGilazione MDA5 per antagonizzare l'immunità innata. SCoV2 PLpro WT, ma non il suo mutante cataliticamente inattivo (PLpro Cys111Ala)15, ha abolito l'ISGilazione di GST-MDA5-2CARD e FLAG-MDA5 (Fig. 5a, b e Dati estesi Fig. 6a). I mutanti PLpro Asn156Glu e Arg166Ser/Glu167Arg, che sono marginalmente e gravemente compromessi nel legame ISG15 all'interfaccia "sito 1", rispettivamente14,36, hanno influenzato leggermente o meno l'ISGilazione. Al contrario, PLpro Phe69Ala, in cui l'interfaccia del "sito 2" che determina preferenzialmente il legame con l'ubiquitina, ma non con ISG15, è interrotta14,36, ha ridotto l'ISGilazione di MDA5 con la stessa potenza di WT PLpro (Fig. 5a, b e Dati estesi Fig. 6a ). SCoV2 PLpro, tuttavia, non ha soppresso l'ubiquitinazione di RIG-I-2CARD (dati estesi Fig. 6b). Abbiamo scoperto che PLpro interagiva specificamente con MDA5, ma non con RIG-I, così come MeV-V che lega MDA5 e fungeva da controllo37 (Fig. 5c). Basse quantità di PLpro hanno inibito la segnalazione da parte di MDA5, ma non RIG-I, mentre quantità più elevate di PLpro hanno soppresso la segnalazione antivirale da entrambi gli RLR (Dati estesi Fig. 6c). Ciò rafforza il fatto che MDA5 sia un obiettivo diretto di PLpro. La de-ISGilazione di IRF3 probabilmente spiega l'effetto inibitorio che dosi più elevate di PLpro hanno sulla segnalazione RLR15,38. Quando si esamina l'effetto di PLpro sull'oligomerizzazione di MDA5-2CARD, PLpro WT ma non Cys111Ala ha bloccato efficacemente l'oligomerizzazione di MDA5-2CARD (Fig. 5d), indicando che SCoV2 PLpro inibisce la formazione di oligomeri MDA5 dipendente dall'ISGylazione attraverso la sua attività enzimatica. Anche gli enzimi PLpro dei relativi -coronavirus, SCoV, MERS-CoV e virus dell'epatite murina (MHV), nonché del -coronavirus HCoV-NL63 (NL63) si sono legati e hanno ridotto efficacemente l'ISGylazione di MDA5-2CARD (Fig. 5e) , suggerendo che l’antagonismo MDA5 da parte di PLpro potrebbe essere ampiamente conservato tra i coronavirus.

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

SCoV2 PLpro antagonizza la segnalazione MDA5 dipendente dall'ISG15-.

Successivamente abbiamo determinato la rilevanza della segnalazione MDA5 dipendente dall'ISG15- per l'induzione di citochine antivirali provocata da SCoV2. Poiché è noto che l'infezione da SCoV2 induce in misura minima IFN di tipo I a causa di efficaci antagonismi virali39, abbiamo isolato l'RNA totale dalle cellule infette da SCoV2- e quindi lo abbiamo ritrasfettato nelle cellule per stimolare la segnalazione immunitaria innata. L'RNA di SCoV2, ma non l'RNA proveniente da cellule trattate in modo simulato, ha indotto in modo robusto trascrizioni di IFN; tuttavia, questa induzione è stata notevolmente ridotta quando ISG15 o MDA5 sono stati messi a tacere (Fig. 6a). Il knockdown del RIG-I non ha influenzato negativamente l'espressione del gene antivirale suscitato dall'RNA SCoV2, indicando che gli RNA-PAMP SCoV2 sono principalmente rilevati dall'asse ISG15-MDA5 (Fig. 6a).

Abbiamo scoperto che la proteina non strutturale 3 (Nsp3) di SCoV2, all'interno della quale si trova PLpro, interagiva prontamente con MDA5 endogeno durante l'autentica infezione da SCoV2 (Fig. 6b). L'ISGylazione endogena di MDA5 non era rilevabile nelle cellule infettate da SCoV2-, sebbene il virus attivasse l'espressione di ISG15; tuttavia, nelle cellule infette trattate con uno specifico inibitore di PLpro15, l'ISGilazione di MDA5 e l'induzione di ISG a valle erano fortemente migliorate (Fig. 6c), supportando la proposta che PLpro sopprime efficacemente l'ISGilazione di MDA5 e la segnalazione durante l'infezione da SCoV2 vivo. Successivamente abbiamo esaminato l'effetto del WT e del PLpro mutante sull'attivazione dell'MDA5 endogeno durante l'infezione da mutEMCV. Coerentemente con il loro effetto sull'ISGylazione di MDA5 (Fig. 5b e Dati estesi Fig. 6a), SCoV2 PLpro WT e Phe69Ala hanno prevenuto l'induzione della trascrizione antivirale, mentre MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, simile al mutante Cys111Ala, non ha influenzato l'espressione del gene antivirale (Fig. 6d). In accordo con ciò, la replicazione di mutEMCV è stata migliorata nelle cellule che esprimono PLpro WT o Phe69Ala, ma non nelle cellule che esprimono PLpro Cys111Ala o Arg166Ser/Glu167Arg (Fig. 6d). Allo stesso modo, WT PLpro, ma non il mutante Arg166Ser / Glu167Arg o Cys111Ala, ha bloccato la restrizione EMCV da parte di FLAG – MDA5 (Fig. 6e); l'effetto sulla replicazione del virus era correlato alle proteine ​​ISG indotte (Fig. 6f). Collettivamente, questo stabilisce SCoV2 PLpro come un antagonista dell'IFN che de-ISGila attivamente MDA5.

Discussione

È noto che la coniugazione ISG15 conferisce attività antivirale a una moltitudine di virus; tuttavia, sono stati identificati solo pochi substrati genuini12. D'altra parte, ISG15 nella sua forma non coniugata agisce proviralmente rafforzando l'inibizione del segnale IFNAR mediata da USP18-31,32,40. Il presente studio identifica un ruolo chiave per ISGylation nell'induzione di IFN mediata da MDA5-. Il nostro lavoro sottolinea anche l'importanza del disegno sperimentale in cui disaccoppiare il ruolo di ISG15 nell'attivazione di MDA5 da quello nello smorzamento della segnalazione IFNAR è essenziale per rivelare la potente attività antivirale di ISG15. In un organismo infetto, è probabilmente la somma di molteplici eventi di ISGilazione (che colpiscono sia le proteine ​​dell'ospite che quelle virali) a determinare l'esito dell'infezione e della patogenesi, che può dipendere dal contesto12.

Benefici della cisanche tubulosa-rafforzare il sistema immunitario

I nostri risultati indicano che l'ISGilazione di MDA5 agisce in modo analogo all'ubiquitinazione di RIG-I5 legata alla Lys63-: entrambi i PTM (1) sono regolati dalla defosforilazione indotta da PP1- e (2) promuovono l'oligomerizzazione delle CARD e un RLR più elevato -assemblee di ordine. Tuttavia, mentre l’ubiquitina è abbondante sia nelle cellule non infette che in quelle infette, l’espressione dell’ISG15 è fortemente aumentata dalla stimolazione dell’IFN. Tuttavia, anche a livelli basali, ISG15 è coniugato a molte proteine ​​ospiti20, inclusa MDA5, come ha dimostrato il nostro lavoro, il che potrebbe essere sufficiente per l'attivazione iniziale di MDA5. Durante le infezioni virali rilevate da più PRR, l'ISGylazione di MDA5 può essere un meccanismo di "priming" in base al quale la sovraregolazione di ISG15 da parte di un sensore innato immediato (ad esempio RIG-I)41 innesca MDA5 per entrare in una modalità di "kick-start". Poiché ISG15 regola negativamente RIG-I16,17, ISGylation può innescare la "commutazione del sensore" in cui l'attivazione di MDA5 viene promossa quando i livelli di ISG15 aumentano, mentre l'attività di RIG-I viene smorzata. Abbiamo identificato che SCoV2 PLpro antagonizza l'ISGylazione di MDA5 attraverso la sua attività enzimatica dopo il legame con il sensore; questa strategia è probabilmente conservata tra i coronavirus, il che merita ulteriori indagini. Le analisi al microscopio crioelettronico hanno rivelato che il coronavirale Nsp3 fa parte di un complesso di pori che si estende su vescicole a doppia membrana derivate dal reticolo endoplasmatico ed esporta RNA virale appena sintetizzato42. Pertanto, MDA5 può posizionarsi in prossimità del sito di esportazione dell'RNA virale per facilitare il rilevamento di PAMP; tuttavia, il dominio PLpro di Nsp3 (che si trova sul lato citoplasmatico) blocca la segnalazione di MDA5 attraverso la de-ISGylazione diretta. Alcuni virus possono anche inibire l'ISGilazione dell'MDA5 attraverso la disregolazione della fosforilazione dell'MDA5, come mostrato per MeV-V. In sintesi, il nostro studio svela un ruolo di primo piano per ISGylation nell'attivazione dell'immunità mediata da MDA5- nonché nella sua inibizione da parte di SCoV2, svelando un potenziale bersaglio molecolare per la progettazione di terapie contro COVID-19.

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