itLingua
Casa / Conoscenza / Contenuto

Conoscenza

Ishophloroglucin A isolato da Ishige Okamurae sopprime la melanogenesi indotta da -MSH: in vitro e in vivo, parte 2

Apr 03, 2023

3. Discussione

sdasdad

Il composto DPHC isolato da IOE aveva già segnalato l'inibizione della tirosinasiattività ed effetto protettivocontro il danno cellulare indotto dalle radiazioni UV-Bin vitro[8]; Tuttavia,l'effetto anti-melanogenesidei componenti derivati ​​da IOE in silico per interazione contirosinasi,in vivonegli studi sul fenotipo in modelli animali e sui loro meccanismi molecolari sottostanti,non sono stati ancora esaminati. Nel presente studio, abbiamo determinato l'anti-melanogenesi e la tirosinasiattività inibitorie dell'IPA, un florotannino isolato da IO e IOE, in un modello vertebrato di zebrafishin vivo e in cellule di melanoma B16F10 in vitro, dopo induzione con -MSH.


Trattamento con -MSH è noto per indurre la sintesi di melanina e l'attività della tirosinasi.20]. Inoltre, è stato dimostrato che la tirosinasi è essenziale per la melanogenesi.29]. Studi precedentihanno dimostrato che il docking molecolare può essere utilizzato per valutare l'attività inibitoria della tirosinasi [30,31]. Pertanto, sono stati eseguiti calcoli di docking molecolare per comprendere il modello di legame dell'IPAe DPHC, un noto polifenolo isolato da IO, che ha rivelato una maggiore energia di legame inattività anti-melanogenesi rispetto all'arbutina, come controllo positivo. Secondo i risultati (fig1), L'IPA ha rivelato i punteggi di attracco più bassi, che indicavano l'interazione dell'IPA con il bersagliola proteina tirosinasi era più forte degli altri due composti, DPHC e arbutina. Tuttavia,c'è una limitazione nel correlare l'inibizione dell'attività della tirosinasi dei funghi con quella cellulareproduzione di tirosinasi o melanina in melanociti in coltura [32]. Quindi, gli effetti inibitoridell'IPA sul'attività della tirosinasi e la melanogenesi sono state esaminate in un pesce zebrain vivomodello e murino B16F10cellule di melanoma.


I pigmenti di melanina si accumulano sulla superficie del pesce zebra, consentendo l'osservazione microscopica delprocesso di pigmentazione senza complicate procedure sperimentali, rendendoli un modello adattoper lo screening degli inibitori della melanogenesi [33,34]. Abbiamo valutato gli effetti inibitori della melaninadell'IPAe IOE in un modello di larva di pesce zebra stimolato da -MSH attraverso la determinazione del contenuto di melanina.Tutti i campioni testati hanno esercitato profondi effetti inibitorisulla pigmentazione del pesce zebra senza significativitàtossicità (figura S2). Gli effetti inibitoridi pigmentazione sono stati osservati tramite analisi morfologica dilarve di pesce zebra legate al diversotrattamenti (fig2). Inoltre, l'uso di larve allo stadio inizialepiuttosto che la fase adulta offre un altro vantaggio nel testare gli effetti percutaneidi medicinaleo composti cosmetici [33,35]. In questo caso abbiamo scelto -MSH come induttore sia in zebrafish in vivoe nelle cellule di melanoma B16F10in vitro. Secondo entrambi i risultati in embrioni di zebrafish e B16F10cellule di melanoma, il contenuto di melanina è aumentato di -stimolazione MSH.


Il contenuto di melanina è correlato direttamente con l'attività e i livelli proteici della tirosinasi.36]. Perciò,abbiamo determinato gli effetti inibitoridi IPA e IOE sull'attività tirosinasica indotta da -MSH attivatocellule B16F10. Abbiamo scoperto che il gruppo trattato con IPA presentava una diminuzione dell'attività della tirosinasi e della melaninacontenuto stimolato da -MSH, con una riduzione di circa il 35% dell'attività della tirosinasi e del 40%.contenuto di melanina (fig4AC). IOE ha inibito l'attività della tirosinasi in modo dose-dipendente eha ridotto significativamente la melanogenesi nelle cellule B16F10 (Figura4B,D). Rispetto ad arbutina, IPA eIOE hanno effetti inibitori significativisulla produzione di melanina e sull'attività della tirosinasi, che era toi risultati di precedenti studi di docking molecolare.


Studiare il meccanismo degli effetti inibitoriSU -Sintesi di melanina indotta da MSH incellule, è stato eseguito il Western blotting. I livelli di espressione delle proteine ​​​​correlate alla melanina, inclusiERK, JNK e p38, dopo il trattamento con IPA o IOE, sono stati valutati. Fosforilazione attivatadi ERK può promuovere la degradazione del MITF attraverso il percorso dipendente dall'ubiquitina-proteasoma [28]. Ciò suggerisce che i potenziali inibitori della melanogenesi possono sopprimere la sintesi della melanina promuovendola degradazione proteasomica del MITF, che era correlata all'attivazione della segnalazione ERKpercorsi [37]. I MAPK ERK, JNK e p38 appartengono alla famiglia MAPK [38–40]. Inoltre,l'attivazione della via MAPK p38 ha indotto l'espressione del MITF [41]. In questo studio, Western blotl'analisi ha rivelato che l'IPA promuove p-JNK e p-p38 (Figura5AVANTI CRISTO). Al contrario, i livelli di p-ERKnon è cambiato con il trattamento di IPA e IOE (Figura5UN). Questi risultati implicano che gli effetti inibitoridi IPA e IOE sull'attività della tirosinasi e sulla melanogenesi possono essere correlati a JNK e p38percorsi di segnalazione.

4. Materiali e Metodi

4.1. Prodotti chimici e reagenti

Dimetilsolfossido (DMSO), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT),L-DOPA, ormone stimolante gli alfa-melanociti ( -MSH) e tampone fosfatosoluzione salina (PBS)sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco è modificatoIl mezzo di Eagle (DMEM) e il siero bovino fetale (FBS) sono stati ottenuti da Invitrogen-Gibco(Grand Island, New York, USA). La chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK1/2), ERK1 fosforilata/2 (p-ERK1/2), chinasi N-terminale c-Jun (JNK), JNK fosforilata (p-JNK), p38, fosforilatap38 (p-p38), proteina legante l'elemento di risposta cAMP (CREB), CREB fosforilata (p-CREB),fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF), proteina correlata alla tirosinasi-1 (Trp-2),anticorpi IgG anti-topo e anti-coniglio per la proteina -1 correlata alla tirosinasi (Trp{-1), tirosinasi (TYR)sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Tutti gli altri reagenti, incluso -MSH, sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Chemical Co.

4.2. Docking molecolare della tirosinasi

Per lo studio di docking, la struttura cristallina della tirosinasi (PDB: 3NM8) è stata ottenuta dalBanca dati delle proteine. Gli studi di docking sono stati eseguiti utilizzando CDOCKERin Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc., San Diego, CA, USA). Quando un intero nucleotidesequenza è coperta dalla griglia del recettore, si presume che i ligandi scelgano la migliore posizione di attracco [42]. La procedura di attracco è stata menzionata nello studio precedente. In breve, sono stati seguiti tre passi: (1)conversione della struttura 2D in una struttura 3D; (2) calcolo degli oneri; e (3) aggiunta diatomi di idrogeno utilizzando il programma di aggancio flessibile [31,43]. 

4.3. Preparazione di IOE e isolamento di IPA

IO è stata raccolta nel giugno 2018 lungo la costa orientale dell'isola di Jeju, in Corea. L'alga è stata lavata due voltecon acqua di rubinetto per rimuovere il sale, le epifite e la sabbia attaccata alla superficie. Successivamente, è stato attentamenterisciacquato con acqua dolce ed è stato mantenuto in un frigorifero medico a−20 ◦C. Successivamente, il congelatol'alga è stata liofilizzata e omogeneizzata con un macinino prima dell'estrazione. L'IOE è stato estratto al 50%.etanolo (v/v, in acqua) sotto agitazione per 24 h a temperatura ambiente, quindi si filtra. Il filtratol'estratto è stato concentrato sotto decompressione e liofilizzato in polvere (IOE). Un 50 per cento di etanoloestratto di IO è stato condotto da Shinwoo Co. Ltd. (lotto n. SW9E29SA, Gyeonggi-do, Corea). L'IPA lo eraisolato da IOE come precedentemente descritto [9]. In breve, l'IOE è stato frazionato mediante centrifugacromatografia di partizione. Tutte le frazioni sono state raccolte e l'IPA è stato infine purificato mediante acolonna HPLC semipreparativa (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). L'IPA è stato determinato come ail polifenolo e la sua struttura chimica (Figura S1, Materiali supplementari) sono stati identificati tramite LC/SManalisi con una massam/z di 992.1315, indicando così una formula molecolare di C96H66O48 (1986.26 dipeso molecolare calcolato,∆0.6, [M − 2H] 2−). 

4.4. Origine e mantenimento del pesce zebra parentale

I pesci zebra adulti sono stati ottenuti da un commerciante commerciale (Seoul Aquarium, Seoul, Corea) e 10i pesci sono stati conservati in una vasca acrilica da 3-L a 28,5◦C, con un ciclo di luce: buio di 14:10 h. I pesci zebra eranoalimentato due volte al giorno, per 6 giorni⁄settimana, con mangime supplementare in scaglie di tetramina (SEWHAPET Food Co.,Seoul, Corea). Gli embrioni sono stati raccolti entro 30 minuti dalla deposizione naturale e indotti al mattinoaccendendo la luce. L'esperimento del pesce zebra ha ricevuto l'approvazione dalla Animal Care and UseComitato della Jeju National University (approvazione n. 2017-0001).

4.5. Misurazione del contenuto di melanina nelle larve di pesce zebra

IPA e IOE e stimolatore -Le concentrazioni di MSH sono state utilizzate per esaminare gli effettiDiconcentrazione sullo sviluppo embrionale. Quindici embrioni di pesce zebra (3-4 hpf) sono stati seminati in ciascunobene, comprendente 1,9 mL di mezzo embrionale, in una 12-pozzetto di semina. I campioni di prova sono stati scioltiin 1% DMSO con 1× PBS e mescolato bene. Ogni mattina per i primi 5 pdf, gli embrioni vitali eranoenumerati per ottenere una misura di sopravvivenza. Per determinare il contenuto di melanina, embrioni a7-9 hpf sono stati seminati in una 6-piastra a pozzetti con 30 embrioni in ciascun pozzetto in un mezzo embrionale da 2.7-ml.Dopo 3 giorni, le larve sono state lavate due volte con 1× PBS per rimuovere eventuali reagenti residui oparticelle e quantità simili di larve sono state poste nei tubi elettronici. Prima di misurare la melaninacontenuto, diverse larve di ciascun gruppo sono state catturate con un microscopio e le rimanenti sono state centrifugate.


Dopo la centrifugazione, il pellet è stato sciolto in 1 mL di 1 N NaOH a 90◦C per 60 min. La miscelaè stato quindi agitato vigorosamente su vortex per solubilizzare il pigmento di melanina. L'assorbanza del supernatante eramisurato a 490 nm. Il risultato è stato confrontato con il controllo che è stato considerato rappresentativocentinaio. Il contenuto di melanina è stato calibrato in base alla quantità di proteine ​​e le osservazioni sono state ripetutein triplice copia.

4.6. Citotossicità di IPA e IOE nelle cellule B16F10

Le cellule di melanoma di topo B16F10 sono state ottenute da ATCC (American Type Culture Collection,Manassas, VA, USA). Le cellule B16F10 sono state coltivate in DMEM integrato con 100 U/ml di penicillina,100 µg/ml di streptomicina e 10% di FBS. Le cellule sono state quindi incubate in un'atmosfera al 5% di CO22 A37 ◦C e sono state poi sottocoltivate ogni 3-5 giorni. La citotossicità di IPA e IOE contro B16F10le cellule sono state studiate tramite saggio colorimetrico MTT. In breve, le cellule sono state seminate in 24-pozzetti a

concentrazione di 2× 104cellule/ml. Circa 16 ore dopo la semina, le cellule sono state incubate con IPA e IOEa diversoconcentrazioni per 72 ore e la loro vitalità è stata determinata.

4.7. Determinazione del contenuto di melanina cellulare

Il contenuto di melanina cellulare è stato misurato utilizzando un metodo precedentemente descritto [33]. Le cellule(2 × 104 cellule/ml) sono stati incubati con varie concentrazioni di IPA e IOE per 72 h; Perciò,sono stati lavati in PBS ghiacciato. In breve, le cellule sono state incubate a 80◦C per 1 h in 1 mL di 1 NNaOH/10% di DMSO e sono stati quindi agitati su vortex per solubilizzare la melanina: l'assorbanza è stata misurata a450nm. La densità ottica dell'inibizione nel controllo è stata considerata pari al 100%. I dati sonopresentati sotto forma di percentuali medie e i risultati sono stati ripetuti in triplicato.

















Potrebbe piacerti anche