L'isoastilbina inibisce l'apoptosi neuronale e lo stress ossidativo nel modello di Arat di lesione da ischemia-riperfusione nel cervello: coinvolgimento di SIRT1/3/6

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Astratto

Sfondo.È stato dimostrato che l'isoastilbin (IAB) haantiossidantee funzioni anti-apoptotiche. Uno studio recente ha scoperto che IAB può ridurreossidativofatica nella malattia di Alzheimer. Tuttavia, non è noto se la funzione antiossidante di IAB sia protettiva anche in altre malattie del cervello.
Obiettivi.Per studiare i ruoli ei meccanismi sottostanti di IAB nella riperfusione dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) nei ratti.
Materiali e metodi.I ratti maschi Wistar sono stati divisi casualmente in 5 gruppi: gruppo sham, gruppo MCAO/R e 3 gruppi MCAO/R trattati con IAB (20 mg/kg, 40 mg/kg o 80 mg/kg) una volta al giorno per 3 giorni. Dimensione dell'infarto, punteggio di gravità neurologico modificato (mNSS),ossidativofaticamarcatori e marcatori di apoptosi neuronale sono stati utilizzati per saggiare la funzione di IAB.
Risultati.Rispetto al gruppo MCAO/R, la somministrazione di IAB ha ridotto la dimensione dell'infarto e i punteggi mNSS nei ratti MCAO/R. L'isoastilbina ha anche ridotto il livello di malondialdeide (MDA) e migliorato l'attività della catalasi (CAT), della superossido dismutasi (SOD) e della glutatione perossidasi (GSH-PX). Il trattamento con isoastilbina ha attenuato il neuronale indotto da MCAO/Rapoptosirispetto al gruppo theMCAO/R, come indicato dai risultati dei test X-dUTP nick-end (TUNEL) mediati da deossinucleotide transferasi terminale e western blot. L'isoastilbina ha anche invertito la downregulation dell'espressione della proteina SIRT1/3/6 indotta da MCAO/R.
Conclusioni.Queste osservazioni suggeriscono che IAB protegge daossidativostress e apoptosi neuronale nei ratti a seguito di lesione da ischemia-riperfusione cerebrale (I/R) attraverso la sovraregolazione di SIRT1/3/6, indicando che IAB potrebbe essere un promettente agente terapeutico per la lesione cerebrale I/R.
Parole chiave:apoptosi, stress ossidativo, isoastilbina, danno focale da ischemia-riperfusione cerebrale

Sfondo

L'ictus ischemico ed emorragico sono tra le principali cause di disabilità e morte in tutto il mondo.1,2L'ictus ischemico è causato da ostruzioni nei vasi sanguigni, mettendo così gli organi bersaglio a rischio di morte cellulare.3Sebbene il trattamento più efficace per l'ischemia cerebrale sia quello di ripristinare l'afflusso di sangue, la terapia trombolitica può aumentare le dimensioni dell'infarto e aggravare la lesione da ischemia-riperfusione (I/R) all'interno del cervello.1,4 Pertanto, è urgente sviluppare nuovi farmaci per il trattamento della lesione cerebrale I/R.

La lesione da ischemia-riperfusione nel cervello comporta una fisiopatologia complessa, inclusa l'insorgenza diossidativofatica, apoptosi e deplezione dell'adenosina trifosfato (ATP), che possono portare a un danno neuronale.5 Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono prodotte durante l'ischemia, portando a neuroniapoptosie disfunzione neurologica.6 Nello specifico, le NADPH ossidasi generano ROS durante la lesione I/R, che le provocaossidativofatica. Questo stress è caratterizzato da una maggiore perossidazione lipidica, una diminuzione dell'attività della catalasi (CAT) e della superossido dismutasi (SOD) e una diminuzione del livello di glutatione (GSH).7–11 Alti livelli di ROS eossidativofaticaa sua volta, innescherà la morte cellulare attraverso la via apoptotica mitocondriale in seguito a danno cerebrale I/R.12 I pori di transizione della permeabilità mitocondriale possono aprirsi come conseguenza dell'accumulo superfluo di ROS, con conseguente riduzione del potenziale transmembrana mitocondriale e aumento della produzione di attivatori della caspasi come come citocromo c, che alla fine avvia la cascata della caspasi e provoca la morte cellulare.12 Geng et al. ha proposto che l'apoptosi delle cellule neuronali sia almeno parzialmente mediata dalla via dell'apoptosi mitocondriale nella lesione cerebrale I/R.13 Di conseguenza, l'inibizione o l'inversione dello stress ossidativo e l'apoptosi neuronale stanno promettendo nuovi metodi per attenuare la lesione cerebrale I/R.

Per esplorare il meccanismo attraverso il quale IAB attenua i danni indotti da I/R, ci siamo concentrati sulla cascata di segnalazione SIRT. Studi recenti hanno dimostrato un ruolo protettivo di SIRT1/3/6 in varie malattie, tra cui la degenerazione neurale nel cervello, l'infiammazione dei vasi sanguigni e l'accumulo di grasso corporeo. In effetti, abbiamo scoperto che il trattamento con IAB aumenta il livello di espressione SIRT durante la lesione I/R, indicando che IAB può proteggere dalle celluleapoptosisovraregolando l'espressione SIRT. Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono che l'IAB è un trattamento potenzialmente utile per la lesione cerebrale I/R clinica.

Obiettivi

Il nostro obiettivo generale era quello di esaminare gli effetti ei meccanismi sottostanti di IAB nella lesione I/R utilizzando il modello animale MCAO/R.

Materiali e metodi

Animali

I ratti maschi Wistar sono stati acquisiti dalla Shanghai Laboratory Animal Company (Shanghai, Cina). Ratti di età compresa tra 60 e 90 giorni con peso corporeo normale (200–250 g) sono stati nutriti ad libitum con cibo e acqua e mantenuti in un ambiente coerente (25 ± 2 gradi, 40 ± 10 percento di umidità relativa e 12 ore di ciclo luce/buio) . Gli animali sono stati trattati secondo le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Jiamusi College, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Heilongjiang, Cina. Il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Jiamusi College, Università di medicina cinese di Heilongjiang ha approvato le procedure sugli animali (approvazione n. 20190815).

Istituzione di lesioni MCAO/R e trattamento IAB

La tossicità di IAB è stata determinata come descritto in precedenza.15 L'isoastilbina (Chengdu Purechem-Standard Co., Ltd., Chengdu, Cina) è stata diluita a concentrazioni finali di 20 mg/kg, 40 mg/kg e 80 mg/kg in fosfato -soluzione tamponata (PBS). Gli animali sono stati randomizzati in 5 gruppi: 1. sham; 2. MCAO/R; 3. MCAO/R seguito da 20 mg/kg IAB; 4. MCAO/R seguito da 40 mg/kg IAB; e 5. MCAO/R seguito da 80 mg/kg IAB.

I ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale (ip.) di 50 mg/kg di pentobarbital di sodio (Sinopharm Chemical Reagent, Pechino, Cina). Per introdurre MCAO/R, abbiamo esposto le arterie carotidee, vale a dire l'arteria carotide esterna (ECA), l'arteria carotide comune destra (CCA) e l'arteria carotide interna (ICA). L'ECA e l'ACC sono state legate prossimalmente. L'ICA è stata legata utilizzando una sutura monofilamento da 0,285 mm, inserita nel lume dell'ICA per circa 18 mm attraverso il moncone dell'ECA per ostruire l'arteria cerebrale media (MCA). Un laserIl doppler (USCN KIT INC., Wuhan, Cina) è stato utilizzato per confermare che il flusso sanguigno era ridotto a meno del 20% del livello normale. Il gruppo farsa ha subito la stessa operazione; tuttavia, le arterie non erano legate. Dopo 2 ore di occlusione, le arterie legate sono state riperfuse e i ratti sono stati quindi sottoposti a gavaged con IAB (20 mg/kg, 40 mg/kg o 80 mg/kg) o PBS al giorno per 3 giorni consecutivi. Infine, 72 ore dopo MCAO/R, è stata valutata la capacità neurologica dei ratti.

Valutazione del volume dell'infarto cerebrale di ratto

Dopo il trattamento IAB, i cervelli sono stati rapidamente pesati per misurare il loro peso umido. Successivamente, i cervelli sono stati disidratati a 100 gradi per 24 ore per valutare il loro peso a secco. La concentrazione di acqua nel cervello è stata calcolata come: ((peso umido ‒ peso secco)/peso umido) × 100 percento.

Punteggio di gravità neurologico modificato (mNSS)

Le funzioni sensoriali, motorie, dell'equilibrio e neurologiche riflesse sono state valutate 72 ore dopo l'intervento chirurgico MCAO utilizzando mNSS.17 La gravità dei deficit neurologici è stata classificata su una scala da 0 a 10, con un punteggio più alto che indicava un danno più grave al sistema nervoso.

Misurazione di superossido dismutasi (SOD), malondialdeide (MDA), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH-PX)

Dopo il trattamento con IAB, il contenuto proteico è stato determinato dai tessuti cerebrali. La concentrazione proteica degli omogenati corticali è stata determinata utilizzando i kit BCA (Beyotime, Shanghai, Cina). SOD, MDA, CAT e GSH-PX sono stati rilevati utilizzando i kit corrispondenti (catalogo n. A003-1, A001-3, A007 e A005; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanchino, Cina). In breve, è stato raccolto il supernatante di omogenato corticale. Per SOD, i campioni sono stati incubati con WST{5}}/soluzione di lavoro enzimatica a 37 gradi per 30 min. L'assorbimento è stato misurato ad una lunghezza d'onda di 450 nm. Un'unità di attività enzimatica (U) SOD è stata definita come la quantità di campione necessaria per ottenere un tasso di inibizione del 50% del colorante formazano WST-8. Per MDA, i campioni sono stati miscelati con una soluzione di lavoro e quindi riscaldati a 100 gradi per 15 minuti. L'assorbimento del supernatante è stato misurato ad una lunghezza d'onda di 532 nm. Per CAT, i campioni sono stati miscelati con tampone di rilevamento CAT e soluzione di perossido di idrogeno e quindi incubati a 25 gradi per 5 minuti. L'assorbimento è stato rilevato ad una lunghezza d'onda di 520 nm. Per GSH-PX, i campioni sono stati miscelati con GSH a 37 gradi per 5 minuti. L'assorbimento del supernatante è stato misurato ad una lunghezza d'onda di 412 nm. Un'unità (U) di attività enzimatica è stata definita come la quantità di GSH-PX in 1 mg di proteina che ha catalizzato il consumo di 1 μmol/L di GSH sottraendo l'effetto della reazione non enzimatica.

Colorazione terminale di deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labelling (TUNEL).

I tessuti cerebrali dell'emisfero omolaterale sono stati isolati, fissati in paraformaldeide al 4% e incorporati in paraffina. I tessuti sono stati quindi tagliati in fette di 5-μm e l'antigene è stato esposto dopo 10 minuti di riscaldamento a microonde in tampone citrato. L'apoptosi neuronale è stata valutata utilizzando il test TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit; Roche, Penzberg, Germania), secondo le istruzioni del produttore. In breve, le fette di cervello sono state poste in paraformaldeide ghiacciata al 4% per 30 minuti e quindi sono state incubate al buio con la miscela di reazione TUNEL a 37 gradi per 1 ora. Successivamente, i nuclei sono stati colorati con 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; Sigma-Aldrich). I campioni sono stati ripresi e l'indice di apoptosi è stato calcolato come il numero di cellule TUNEL-positive diviso per il numero totale di cellule.

Macchia occidentale

I tessuti cerebrali di ratto sono stati lisati utilizzando il tampone del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (Beyotime, Dalian, Cina). Le proteine ​​sono state sottoposte al 12-15% di elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e quindi trasferite su membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF) (Millipore, Billerica, USA). Le membrane sono state bloccate utilizzando latte scremato al 5% e incubate con anticorpi primari a 4 gradi durante la notte. Gli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) sono stati successivamente incubati a temperatura ambiente per 2 ore. Segnali specifici di proteine ​​marcate sono stati rilevati utilizzando un sistema di chemiluminescenza. L'-actina è stata utilizzata per normalizzare i livelli di espressione proteica di Bcl-2, Bax e Sirtuin (SIRT1/3/6). Le immagini sono state analizzate utilizzando il software ImageJ.

analisi statistiche

I dati sono presentati come media ± deviazione standard (DS) da 3 esperimenti indipendenti. I dati di ciascun gruppo sono stati confermati per seguire una distribuzione normale utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), seguita dal test post hoc di Tukey utilizzando il software Prism v. 8 (GraphPad Software, San Diego, USA). Un valore di p< 0.05 indicated="" statistical="" significance.="" a post="" hoc="" power="" analysis="" was="" performed="" using="" g*power="" 3.1.9.7="" software="" (heinrich="" heine="" university,="" düsseldorf,="">

Risultati

L'isoastilbina protegge i neuroni dal danno indotto da MCAO/R

Per esplorare se i neuroni protetti da IAB soggetti a I/R cerebrale, sono state analizzate la concentrazione di acqua nel cervello e il volume dell'infarto. Negli animali di controllo, non c'era infarto e la concentrazione di acqua era relativamente bassa (Fig. 1B, C; gruppo sham). Dopo l'intervento chirurgico MCAO/R, abbiamo osservato aumenti significativi delle dimensioni dell'infarto e della concentrazione di acqua (Fig. 1B, C). L'infarto e l'edema ischemico indicano che il nostro approccio ha generato con successo il modello I/R nei ratti. È interessante notare che quando abbiamo applicato diverse concentrazioni di IAB (20 mg/kg, 40 mg/kg e 80 mg/kg) subito dopo la lesione, abbiamo osservato il recupero dose-dipendente dell'infarto e dell'edema cerebrale ischemico (Fig. 1B, C). Questo risultato suggerisce che IAB protegge dal danno cerebrale indotto dall'ischemia. Successivamente, abbiamo esaminato la cellaapoptosiutilizzando il test mNSS. Come mostrato in Fig. 1D, i ratti operati con la simulazione non hanno mostrato evidenti deficit neurologici, mentre i ratti MCAO/R hanno mostrato punteggi mNSS significativamente aumentati. Coerentemente con i cambiamenti morfologici mostrati in Fig. 1B e Fig. 1C, il trattamento IAB ha ridotto significativamente il punteggio mNSS dei ratti MCAO/R (Fig. 1D). Presi insieme, questi risultati forniscono la prova che IAB ha una funzione neuroprotettiva in un modello di roditore Vivo di lesione cerebrale I/R. Dato che una maggiore concentrazione di IAB aveva effetti protettivi migliori senza effetti collaterali evidenti, abbiamo usato 80 mg/kg per i seguenti esperimenti.

L'isoastilbina attenua lo stress ossidativo nei ratti MCAO/R

Per valutare l'influenza di IAB sulo stress ossidativo, i livelli di GHS-PX, MDA, SOD e CAT sono stati valutati dopo il trattamento con IAB. A causa dell'aumento dello stress ossidativo, i ratti sottoposti a MCAO/R avevano livelli più elevati di MDA rispetto ai ratti simulati. Questo effetto è stato attenuato dal trattamento IAB (Fig. 2A). Inoltre, i livelli di CAT, SOD e GHS-PX sono diminuiti nei ratti MCAO/R rispetto ai ratti sham (Fig. 2B, D). Il trattamento con IAB ha elevato i livelli di CAT, SOD e GHS-PX nei ratti MCAO/R (Fig. 2B, D), suggerendo che IAB proteggesse dal danno cerebrale I/R attenuando lo stress ossidativo.

L'isoastilbina inibisce l'apoptosi neuronale nei ratti MCAO/R

Successivamente, abbiamo utilizzato il test TUNEL per valutare il neuronaleapoptosidopo lesione cerebrale I/R. Come illustrato in Fig. 3A, c'è stato un aumento del numero di cellule TUNEL-positive nei ratti MCAO/R, che è stato ridotto dal trattamento IAB (Fig. 3A). Per esplorare i meccanismi alla base della protezione IAB, abbiamo esaminato l'espressione delle proteine ​​​​dell'apoptosi Bax e Bcl-2 utilizzando il western blot. Nei ratti sottoposti a MCAO/R, l'espressione di Bax (marcatore pro-apoptotico) era sovraregolata, mentre quella di Bcl-2 (marcatore anti-apoptotico) era sottoregolata, rispetto al gruppo sham (Fig. 3B, C ). Tuttavia, il trattamento IAB ha impedito i cambiamenti indotti da MCAO/R (Fig. 3B, C). Questi risultati suggeriscono che IAB ha inibito l'apoptosi neuronale nei ratti MCAO/R.

Isoastilbin sovraregola l'espressione SIRT

Successivamente, abbiamo cercato di esaminare come IAB protegge i neuroni dalo stress ossidativo. È stato riscontrato che la SIRT, una deacetilasi NAD più-dipendente localizzata principalmente nei mitocondri, è associata alla sopravvivenza cellulare e all'apoptosi, al metabolismo cellulare e alla risposta allo stress. La SIRT può attivare segnali e percorsi mitocondriali per promuovere la proliferazione dei mitocondri e la generazione di ATP. Partecipa anche all'infiammazione, in modo che la riduzione della SIRT porti all'aumento dei fattori di infiammazione cronica, come l'attività di NFκB e RelA/p65.18-20 È interessante notare che diversi studi hanno scoperto che la SIRT esercita un effetto protettivo neurale e attenua l'ossidazione stress nella fisiopatologia della lesione cerebrale I/R.21 Qui, abbiamo studiato l'espressione cerebrale di SIRT1/3/6 nei ratti sottoposti a MCAO/R. Abbiamo scoperto che la lesione da MCAO/R ha ridotto i livelli proteici di SIRT1/3/6, mentre il trattamento IAB ha attenuato questi effetti (Fig. 4A-D). Questi dati suggeriscono che IAB potrebbe essere protettivo nei ratti MCAO/R sovraregolando l'espressione di SIRT1/3/6 nella protezione contro lo stress ossidativo.

Discussione

La concentrazione di ROS raggiunge un picco, che può potenzialmente indurre apoptosi o necrosi cellulare.25-28 Esistono diversi marcatori consolidati di stress ossidativo. Ad esempio, l'MDA, un composto citotossico prodotto dalla perossidazione lipidica,29 è aumentato nei cardiomiociti di ratto dopo il danno I/R.30 Gli enzimi antiossidanti SOD, CAT e GHS-PX svolgono un ruolo importante nello scavenging dei superossidi e nella prevenzione del danno ossidativo.31, 32 Inoltre, i cambiamenti nell'attività di questi enzimi sono anche legati allo stress ossidativo. L'attenuazione dello stress ossidativo è un potenziale modo per proteggere i tessuti da lesioni I/R.

Uno studio recente ha dimostrato che l'effetto neuroprotettivo di IAB potrebbe essere dovuto alla modulazione dello stress ossidativo. Nello specifico, lo studio ha scoperto che IAB ha inibito la generazione di ROS e ha indotto SOD e GSH-PX a migliorare il danno ossidativo in un modello murino di AD.15 Tuttavia, non è ancora noto se e come IAB protegga dalle lesioni I/R nel cervello. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che IAB attenua con successo la lesione cerebrale I/R riducendo il volume dell'infarto e i deficit neurologici dopo la lesione MCAO/R. Per verificare se gli effetti di IAB sono dovuti all'attenuazione delle specie ROS, abbiamo misurato diversi marcatori di stress ossidativo. È stato riscontrato che il trattamento con isoastilbina dopo MCAO/R riduce i livelli di MDA, ma aumenta l'attività di CAT, SOD e GSH-PX. Questi risultati suggeriscono che il meccanismo alla base della neuroprotezione mediata da IAB contro le lesioni I/R è attraverso la riduzione dello stress ossidativo.

Infatti, l'I/R cerebrale è in grado di indurre l'apoptosi dei neuroni.33,34 L'attivazione di proteine ​​pro-apoptotiche (Bax e Bak) e la parallela inattivazione di proteine ​​anti-apoptotiche (come Bcl-2) si sono verificate durante Lesione I/R. Sia Bcl-2 che Bax si trovano nella parte esterna della membrana mitocondriale e partecipano alla modulazione dell'apoptosi cellulare.35–37 Studi precedenti hanno dimostrato che la sovraespressione di Bcl-2 blocca la morte neuronale in vitro e in vivo.38Erfani et al. hanno scoperto che il rapporto Bax/Bcl-2 aumentava durante la lesione cerebrale I/R, contribuendo all'apoptosi neuronale.39 Inoltre, nei cervelli dei topi sottoposti a MCAO/R sono state riscontrate sovraregolazione di Bax e sottoregolazione di Bcl-2. 40 Inoltre, è stato scoperto che IAB modula i livelli di espressione proteica sia di Bcl-2 che di Bax per migliorare il sistema redox nei topi con AD, indicando il ruolo anti-apoptotico di IAB in questa condizione.15 Nel presente studio, abbiamo dimostrato che la somministrazione di IAB ha ridotto l'apoptosi neuronale indotta da I/R in vivo sottoregolando Bax e sovraregolando Bcl-2. Questi risultati implicano che la capacità neuroprotettiva di IAB dipende dalla sua attività anti-apoptotica nei ratti. Tuttavia, l'I/R può anche portare a necrosi, che non è mediata dallo stress ossidativo.25-28 È di grande interesse esaminare se l'IAB può anche funzionare inibendo la necrosi per attenuare il danno da I/R.

Per esaminare il meccanismo attraverso il quale IAB attenua lo stress ossidativo, ci siamo concentrati sulle proteine ​​SIRT. Un precedente rapporto ha scoperto che la sovraespressione di SIRT3 inibiva la fissione mitocondriale per proteggere dal danno cerebrale I/R. Inoltre, SIRT6 può proteggere il cervello dai danni I/R attraverso la soppressione dello stress ossidativo.2 Qui abbiamo scoperto che SIRT1/3/ 6 è stato significativamente sottoregolato nei ratti MCAO/R, mentre la somministrazione di IAB ha aumentato l'espressione di SIRTl/3/6. Per quanto ne sappiamo, questo studio è il primo a dimostrare che IAB può aumentare l'espressione della proteina SIRT1/3/6 per attenuare lo stress ossidativo e l'apoptosi neuronale indotta da danno cerebrale I/R.

Limitazioni

Esistono diversi percorsi protettivi contro lo stress ossidativo. Qui, abbiamo dimostrato che il meccanismo di segnalazione della protezione IAB è tramite SIRT 1/3/6. Tuttavia, altri meccanismi contro lo stress ossidativo o il danno cerebrale I/R dovrebbero essere ulteriormente chiariti. Durante la lesione I/R sono coinvolte sia l'apoptosi che la necrosi; tuttavia, ci siamo concentrati solo sull'apoptosi. Pertanto, saranno necessarie ulteriori ricerche sul ruolo di IAB nella necrosi per spiegare completamente la funzione protettiva di IAB durante la lesione I/R.

Conclusioni

Qui, abbiamo dimostrato che IAB può alleviare lo stress ossidativo e l'apoptosi dei neuroni nei ratti sottoposti a I/R cerebrale. Inoltre, lo stress antiossidante e le funzioni anti-apoptotiche di IAB potrebbero insorgere attraverso la regolazione dell'espressione di SIRT1/3/6. Presi insieme, i nostri dati suggeriscono che l'IAB è un trattamento candidato per la lesione cerebrale I/R.

ORCID iDs Lifeng An  https://orcid.org/0000-0002-4835-1817 Dandan Zhu  https://orcid.org/0000-0001-9119-9956 Xin Zhang  https://orcid.org/0000-0002-9496-1691 Jingwen Huang  https://orcid.org/0000-0001-6449-5362 Guangbao Lu https://orcid.org/0000-0002-2465-8996

Lifeng An1,B,D, Dandan Zhu2,B, Xin Zhang2,C, Jingwen Huang1,C, Guangbao Lu1,A,F

1 Jiamusi College, Università di Medicina Cinese di Heilongjiang, Cina

2 Graduate School, Università di Medicina Cinese di Heilongjiang, Jiamusi, Cina

A – concetto di ricerca e design; B – raccolta e/o assemblaggio dei dati; C – analisi e interpretazione dei dati;

D – scrittura dell'articolo; E – revisione critica dell'articolo; F – approvazione finale dell'art

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