Isolamento di un estratto dal microrganismo simbiotico del corallo molle Salinispora arenicola che esercita effetti citoprotettivi e antietà Parte 1

Astratto: Le cellule hanno sviluppato un sistema altamente integrato responsabile della stabilità del proteoma, vale a dire la rete di proteostasi (PN). Poiché la perdita di proteostasi è un segno distintivo dell'invecchiamento e delle malattie legate all'età, l'attivazione dei moduli PN può probabilmente estendere la durata della salute. Qui, presentiamo i dati sulla bioattività di un estratto (SA223-S2BM) purificato dal ceppo Salinispora arenicola TM223-S2 che è stato isolato dal corallo molle Scleronephthya lewinsohni; questo corallo è stato raccolto a una profondità di 65 m dall'ecosistema mesofotico del Mar Rosso EAPC (Eilat sud, Israele). Il trattamento di cellule umane con moduli proteostatici attivati ​​da SA223-S2BM ha ridotto il carico ossidativo e conferito protezione contro lo stress ossidativo e genotossico. Inoltre, SA223-S2BM ha potenziato le attività del proteasoma e delle catepsine lisosomiali nelle mosche della Drosophila e ha mostrato effetti protettivi sulla pelle, come evidenziato dall'efficace inibizione degli enzimi correlati all'invecchiamento della pelle, dell'elastasi e della tirosinasi. Suggeriamo che l'estratto SA223-S2BM costituisca una probabile fonte promettente per dare priorità alle molecole con proprietà anti-invecchiamento.

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una forte capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità riducente rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento cutaneo. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e ha la capacità di eliminare le specie reattive dell'ossigeno e prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi, e ha anche un buon effetto di riparazione sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

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Parole chiave: invecchiamento; risposte antiossidanti; microrganismo marino; rete di proteostasi; Salinispora arenicola

1. Introduzione

L'invecchiamento è caratterizzato da un declino dipendente dal tempo della capacità funzionale e della resistenza allo stress, nonché da un aumento dei tassi di mortalità e morbilità [1]. L'invecchiamento non è solo un processo passivo, poiché è regolato da eventi di segnalazione molecolare e cellulare conservati nell'evoluzione [2,3]. Gli organismi sono costantemente sfidati da fattori di stress sia interni (relativi al metabolismo) che esterni (derivati ​​dalla dieta o dall'ambiente), che possono portare al graduale accumulo di biomolecole danneggiate e alla fine compromettere l'omeostasi cellulare [4,5]. Le proteine ​​​​sono coinvolte in tutte le funzioni cellulari fondamentali e, pertanto, l'omeostasi del proteoma (proteostasi) è fondamentale per la funzionalità e la sopravvivenza cellulare [6].

L'integrità del proteoma è mantenuta dalla rete proteostatica (PN), che si estende a tutti i compartimenti subcellulari ed è regolata a livello cellulare, tissutale e dell'organismo per garantire la salute e la longevità dell'organismo [7]. Sostenere la proteostasi richiede alle cellule di coordinare e regolare le funzioni di sintesi, ripiegamento, selezione, trasporto e degradazione di tutti i polipeptidi [8,9]. Queste funzioni cellulari sono principalmente svolte da tre principali rami interconnessi della PN, vale a dire la rete di chaperoni molecolari, le vie proteolitiche ubiquitina-proteasoma-(UPP) e autofagia-lisosoma-(ALP) [10,11].

Gli chaperoni molecolari assicurano il corretto ripiegamento delle proteine ​​e il mantenimento conformazionale e cooperano anche con le vie di degradazione [12]. L'UPP è il sito principale del controllo di qualità della sintesi proteica ed è coinvolto nel riciclaggio di proteine ​​normali a vita breve e di proteine ​​mal ripiegate o non ripiegate non riparabili [6], mentre l'ALP è responsabile del riconoscimento e della rimozione di aggregati proteici e organelli danneggiati [13]. La perdita di proteostasi è un segno distintivo dell'invecchiamento [14], nonché un importante fattore di rischio per molte patologie umane legate all'età, tra cui cancro, diabete, disturbi cardiovascolari e malattie neurodegenerative [15]. Pertanto, l'attivazione della PN è considerata un approccio promettente per ritardare l'insorgenza e/o la progressione dell'invecchiamento e delle malattie legate all'età [16-18].

L'invecchiamento della pelle è caratterizzato da cambiamenti strutturali e funzionali in (tra gli altri) componenti della matrice extracellulare, come l'elastina [19]. L'elastasi è l'enzima coinvolto nella degradazione dell'elastina, con conseguente sviluppo di rughe e perdita di elasticità [20]. La tirosinasi è un enzima chiave nella sintesi della melanina, responsabile della pigmentazione (tra gli altri) della pelle umana [21,22]. Tuttavia, l'eccessiva attivazione della tirosinasi è associata a diversi disturbi della pelle, come l'iperpigmentazione e il melanoma[22,23]. Pertanto, l'inibizione dell'elastasi e della tirosinasi costituisce un approccio importante contro l'invecchiamento cutaneo.

I prodotti naturali (NP) hanno una lunga storia - ben documentata, prima della nascita della scienza e della tecnologia moderne, in varie culture - nel trattamento delle malattie umane [24-26]. Pertanto, le NP possono fungere da materiali di partenza altamente arricchiti e impalcature per lo sviluppo di farmaci; infatti, oltre la metà di tutti i farmaci sono NP, derivati ​​da NP o ispirati a NP [27-29]. Il mondo marino, che ospita la maggior parte della biodiversità, è in gran parte inesplorato e quindi potrebbe essere la risorsa più vasta per scoprire nuove NP [30]. Tra gli organismi che vivono in ambienti marini, i coralli molli sono promettenti fornitori di NP bioattive e sono noti per ospitare molti microrganismi diversi [31,32].

Alla luce di questi fatti, stiamo attualmente eseguendo un ampio screening ad alto rendimento delle NP per identificare molecole bioattive che potrebbero potenzialmente ritardare la senescenza cellulare e/o l'invecchiamento in vivo. Nello studio qui presentato, abbiamo esaminato un estratto metanolico, vale a dire SA223-S2BM, del ceppo Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 applicando saggi in vitro, nonché e approcci bioguidati in vivo. Il ceppo S. arenicola TM223-S2 è stato isolato dal corallo molle Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (inizialmente denominato Scleronephthya lewinsohni da Verseveldt e Benayahu, 1978), che è stato ottenuto in modo sostenibile dall'ecosistema mesofotico del Mar Rosso EAPC ( a sud di Eilat, Israele) a una profondità di 65 m. L'estratto metanolico SA223-S2BM ha attivato meccanismi citoprotettivi sia nelle cellule umane che nelle mosche Drosophila melanogaster (D. melanogaster) ed ha esercitato proprietà protettive della pelle in vitro. Pertanto, l'estratto SA223-S2BM potrebbe essere la fonte per la probabile identificazione di molecole con potenziali proprietà citoprotettive e anti-invecchiamento.

2. Materiali e metodi

2.1. Origine e isolamento dell'estratto SA223-S2BM

2.1.1. Collezione Corallo

Il corallo molle S. Levinson è stato raccolto da un ROV H800 (ECA Robotics) gestito da Sam Rothberg R/V dell'Istituto Interuniversitario di Scienze Marine di Eilat (IUI). In situ, la fotografia è stata eseguita da una fotocamera in bianco e nero a bassa luminosità VS300 (ECA Robotics) e da una fotocamera 1CAM Alpha HD (SubC Imaging). I campioni sono stati ottenuti dal braccio ROV dalla barriera corallina mesofotica di Eilat, al largo del terminal del molo petrolifero (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), a 65 m, il 7 marzo 2017. Il sito di raccolta è caratterizzato da un pendio moderato con tratti rocciosi circondati da un fondale sabbioso. Al momento della raccolta, il materiale è stato immediatamente congelato a -80°C. Un esemplare di voucher è stato conservato in etanolo al 70% per l'identificazione tassonomica e depositato presso lo Steinhardt Museum of Natural History, Tel Aviv University (SMNHTAU_Co_37500).

2.1.2. Isolamento e identificazione del ceppo

S. arenicola TM223-S2 è stata isolata da un campione di 1 mL di S. Levinson. Il campione di corallo molle raccolto è stato macinato in acqua di mare sterile e riscaldato a 50°C per 1 ora. La sospensione risultante è stata diluita in serie, piastrata su terreno di isolamento selettivo agar e incubata a 28°C per almeno 6 settimane. Il ceppo Salinispora è stato isolato e la colonia è stata purificata su agar di brodo marino (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) e conservata a -20 ◦C in una soluzione di glicerolo al 10%.

2.1.3. Indagine sulla filogenesi

L'analisi filogenetica è stata eseguita utilizzando un frammento del gene 16S rRNA amplificato dal DNA genomico di S. arenicola TM223-S2. Il DNA genomico del ceppo TM223-S2 è stato isolato utilizzando un DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen), secondo le istruzioni del produttore. Il frammento di RNA ribosomiale 16S è stato amplificato mediante PCR utilizzando i primer 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C) e 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Gli ampliconi sono stati sequenziati mediante sequenziamento di Sanger e le sequenze sono state allineate rispetto al database di RNA ribosomiale 16S del progetto Targeted Loci di NCBI utilizzando MUSCLE. L'allineamento è stato ispezionato manualmente e le lacune sono state rimosse. La storia evolutiva è stata dedotta utilizzando il metodo della massima verosimiglianza e il modello Tamura-Nei [33] con 1000 repliche. L'albero iniziale per la ricerca euristica è stato ottenuto automaticamente applicando gli algoritmi neighbor-join e BioNJ a una matrice di distanze a coppie stimate utilizzando l'approccio di massima verosimiglianza composita (MCL) e quindi selezionando la topologia con un valore di log verosimiglianza superiore. Le analisi evolutive sono state condotte in MEGA X versione 10.1.7 [34].

2.1.4. Condizioni di coltivazione

Le spore di S. arenicola TM223-S2 sono state conservate a -20 ◦C in glicerolo al 10%. Prima della coltivazione, il ceppo è stato rianimato per 15 giorni su una piastra Petri da 15 cm contenente MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) integrata con il 2% di Agar (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , STATI UNITI D'AMERICA). Acqua di mare sterile (4 × 10 mL) è stata versata sulla superficie della piastra e le spore e il micelio sono stati recuperati dalla piastra grattando delicatamente la superficie con un bisturi per generare l'inoculo. La fermentazione allo stato liquido (LSF) è stata condotta in un pallone Erlenmeyer da 2 L per 20 giorni a 28 °C e agitazione a 130 rpm. La resina Amberlite XAD16 (30 g/L) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Paesi Bassi) è stata aggiunta prima della sterilizzazione per consentire l'intrappolamento in situ dei metaboliti microbici. Cinque millilitri dell'inoculo sono stati usati per inoculare 1 L su MB contenente 30 g di resina Amberlite XAD16. La fermentazione allo stato agar unita all'estrazione in fase solida (SPE) [35] è stata eseguita su terreno MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) integrato con il 2% di Agar (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) per 20 giorni a 28 ◦C. Amberlite XAD16 sterilizzata (35 g) miscelata con 35 mL di inoculo è stata distribuita in modo omogeneo sulla superficie di una piastra Petri da 1 MB di agar (25 cm × 25 cm).

Per LSF, la resina XAD16 è stata separata dalla brodocoltura mediante filtrazione e lavata con acqua prima di essere eluita con acetato di etile (100 mL) e quindi con metanolo (100 mL). Gli eluati sono stati concentrati a secchezza sotto vuoto e solubilizzati in DMSO a una concentrazione di 10 mg/mL. L'estratto risultante, SA223-S2LAE (estratto con acetato di etile), è stato utilizzato per le valutazioni biologiche.

Per SPE, la resina XAD16 è stata recuperata grattando accuratamente la superficie della piastra di agar. La resina recuperata è stata lavata con acqua per eliminare la biomassa prima di essere eluita con acetato di etile (100 mL) e poi con metanolo (100 mL). Gli eluati sono stati concentrati a secchezza sotto vuoto e solubilizzati in DMSO a una concentrazione di 10 mg/mL. Gli estratti risultanti, SA223-S2BAE (estratto con acetato di etile) e SA223-S2BM (estratto con metanolo), sono stati utilizzati per le valutazioni biologiche.

2.2. Attività inibitorie di elastasi e tirosinasi

L'attività inibitoria dell'elastasi dell'estratto prioritario è stata valutata utilizzando l'elastasi del pancreas suino (PPE) di tipo IV (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) e il substrato N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (Merck KGaA, Darmstadt, Germania), come precedentemente descritto [36]. È stata determinata la capacità dell'estratto di inibire l'azione catalitica della tirosinasi nell'ossidazione di L-DOPA a dopacromo, come riportato in precedenza [37].

2.3. Linee cellulari, condizioni di coltura cellulare e saggio di vitalità cellulare

I fibroblasti di prepuzio umano (cellule BJ) sono stati acquistati dall'American Tissue Culture Collection (ATCC), mentre i cheratinociti umani immortalizzati (cellule HaCaT) sono stati ottenuti da Elabscience, Inc. Entrambe le linee cellulari sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) integrati con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS) e l'1% (v/v) di amminoacidi non essenziali e sono stati mantenuti in condizioni di 5% di CO2, 95% umidità e 37 ◦C. In tutte le procedure sperimentali applicate, le cellule sono state sottocoltivate utilizzando una soluzione di tripsina/EDTA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). L'effetto dell'estratto SA223-S2BM sulla vitalità cellulare è stato stimato utilizzando il test MTT, come riportato in precedenza [38]. Il trattamento cellulare con perossido di idrogeno (H2O2) e doxorubicina (DXR) è stato eseguito come descritto nelle legende delle figure; H2O2 e DXR sono stati ottenuti da Merck KGaA (Darmstadt, Germania).

2.4. Linee di Drosophila e saggio di longevità

In questo studio, abbiamo utilizzato il ceppo Drosophila w1118 acquistato da Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, USA). Le mosche sono state mantenute a 25 ◦C e al 60% di umidità su un ciclo di 12 ore di luce: 12 ore di buio. In tutti gli esperimenti presentati, sono stati analizzati solo i tessuti somatici (testa e torace) delle mosche, poiché i tessuti riproduttivi mostrano una regolazione distinta dei meccanismi proteostatici e dei tassi di invecchiamento rispetto ai tessuti somatici [39].

La longevità delle mosche è stata valutata come descritto prima [40] utilizzando mosche femmine e maschi (numero uguale per sesso) che sono state coltivate in fiale contenenti (o meno) l'estratto studiato. Le mosche venivano trasferite in fiale con cibo fresco ogni due giorni e le morti venivano registrate ogni giorno. Per le curve di sopravvivenza e l'analisi statistica, sono stati utilizzati la procedura di Kaplan-Meier e il test log-rank (Mantel-Cox); la significatività è stata accettata a p <0,05.

2.5. Misurazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS)

Cellule o tessuti di mosche sono stati incubati con il colorante CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) a una concentrazione di 10 µM in PBS per 30 minuti al buio (37 ◦C e 25 ◦C, rispettivamente). Dopo la rimozione del colorante, le cellule o i tessuti delle mosche sono stati incubati con PBS per 15 minuti al buio (37 ◦C e 25 ◦C, rispettivamente), lisati in tampone di lisi [150 mM NaCl, 1% (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8.0] e, quindi centrifugato a 14,000 g per 15 min (4 ◦C). Successivamente, il contenuto proteico è stato misurato con il saggio Bradford (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) e la fluorescenza prodotta è stata misurata in un lettore di micropiastre multimodale Spark® (Tecan Trading AG, Männedorf, Svizzera) sotto eccitazione e lunghezze d'onda di emissione rispettivamente di 490 e 540 nm. Il perossido di idrogeno (H2O2) è stato utilizzato come controllo positivo, in quanto è ampiamente noto per causare danno/stress ossidativo [41].

2.6. Estrazione dell'RNA, sintesi del cDNA e analisi PCR quantitativa in tempo reale (Q-RT-PCR)

L'RNA totale è stato estratto dalle cellule utilizzando RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Giappone) e quantificato con uno spettrofotometro BioSpec-nano (Shimadzu Inc., Kyoto, Giappone). Successivamente, 1 µg di RNA è stato convertito in cDNA utilizzando il kit cDNA FastGene Scriptase II (NIPPON Genetics, Düren, Germania). Per eseguire analisi PCR quantitative in tempo reale, sono stati utilizzati 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estonia) e PikoRealTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). I primer specifici per i geni umani studiati erano come descritto in precedenza [42]. Il gene HMBS è stato utilizzato come normalizzatore.

2.7. Analisi di immunoblotting e misurazione dell'attività del proteasoma e delle catepsine

Gli studi di immunoblotting sono stati condotti come precedentemente descritto [43]. Gli anticorpi secondari primari e coniugati con perossidasi di rafano sono stati applicati per 1 ora a temperatura ambiente e gli immunoblot sono stati sviluppati utilizzando un kit di reagenti a chemiluminescenza potenziato (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). La quantificazione degli immunoblots è stata eseguita mediante densitometria a scansione e software ImageJ [44].

Le attività enzimatiche del proteasoma e delle catepsine nelle cellule o nei tessuti delle mosche sono state misurate con un sistema fluorometrico VersaFluor™ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) utilizzando Suc-LLVY-AMC (attività simile alla chimotripsina, CT-L) e fluoropeptidi Z-FR-AMC (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA), rispettivamente, come precedentemente descritto [42,45,46]. La 6-bromoindirubina-30 -ossima (6BIO) è stata utilizzata come controllo positivo, poiché è noto che attiva l'UPP sia nelle cellule umane che nei moscerini della Drosophila [42,47]; il farmaco Rapamicina, è stato utilizzato come controllo positivo per l'induzione di ALP e catepsine [48].

2.8. Anticorpi utilizzati

Anticorpi primari contro la subunità del proteasoma 5 (sc-55009), NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) e GAPDH (sc-25778), così come gli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano, sono stati acquistati da Santa Cruz Biotecnologie, Inc. (Dallas, TX, USA). Gli anticorpi primari contro 53BP1 (4937), fosfo-istone H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) e fosforo-p53Ser15 (9286) sono stati ottenuti da Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). L'anticorpo contro SQSTM1/p62 (BML-PW9860) è stato acquistato da Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA).

2.9. Analisi statistiche

Gli esperimenti sono stati eseguiti almeno in duplicati. MS Excel è stato utilizzato per le analisi statistiche. La significatività statistica è stata valutata utilizzando il test t di Student (t-test). I punti dati corrispondono alla media degli esperimenti indipendenti e le barre di errore indicano la deviazione standard (SD); significato a p < 0.05 o p < 0.01 è indicato nei grafici da uno o due asterischi, rispettivamente.

3. Risultati

3.1. Identificazione dell'actinomicete associato al corallo molle S. Levinson

Il ceppo microbico mirato è stato isolato dal corallo S. Levinson, che è un corallo molle endemico del Mar Rosso. Le colonie di questo corallo si trovano tipicamente in siti profondi, sia negli ecosistemi di barriera corallina mesofotica superiore (30–60 m) sia negli ecosistemi di barriera corallina mesofotica inferiore (60–105 m) [49]. Inoltre è un corallo molle azooxantellato che ottiene il proprio fabbisogno energetico attraverso l'alimentazione filtrante e, pertanto, si trova in ambienti esposti a forti correnti d'acqua.

Dall'analisi filogenetica basata sulla sequenza 16S rRNA, l'isolato TM223-S2 è risultato appartenere al genere Salinispora (Figura 1).

Poiché S. arenicola può essere distinta da S. Pacifica e S. tropica sulla base della sequenza 16S rRNA [50], abbiamo chiamato questo isolato S. arenicola TM223-S2 con un numero di accesso Genbank MW446171. Il ceppo è stato coltivato come riportato nella Sezione Materiali e Metodi ed estratto rispettivamente con acetato di etile e metanolo. L'indagine biologica preliminare ha indicato che l'estratto dalla coltura liquida, SA223-S2BAE, e l'estratto di acetato di etile dalla coltura solida, SA223-S2LAE, erano privi di qualsiasi attività biologica significativa (Figura S1). Pertanto, in questo studio è stato utilizzato solo l'estratto metanolico della coltura solida associata all'estrazione in fase solida, SA223-S2BM.

3.2. L'estratto SA223-S2BM non mostra alcuna tossicità nelle cellule umane e attiva i componenti chiave della PN

In primo luogo, abbiamo esaminato l'effetto di SA223-S2BM sulla vitalità dei fibroblasti BJ della pelle normale e dei cheratinociti HaCaT immortalizzati nell'uomo eseguendo il test di tossicità MTT. A tale scopo, le cellule sono state incubate per 24 h con concentrazioni crescenti dell'estratto e, come mostrato nella Figura 2A1, A2, l'estratto non esercita un effetto citotossico su nessuna delle due linee cellulari esaminate a concentrazioni fino a 10 µg/mL ; a concentrazioni più elevate (superiori a 10 µg/mL), l'estratto riduce la vitalità cellulare soprattutto nelle cellule HaCaT.

Abbiamo quindi studiato l'effetto dell'estratto sui percorsi cellulari, che assicurano la stabilità del proteoma della cellula. Abbiamo osservato che l'esposizione a breve termine (24 h) dei fibroblasti BJ all'estratto studiato ha indotto significativamente l'espressione del gene del proteasoma PSMB7 (a una concentrazione di 10 µg/mL), mentre parallelamente tendeva ad aumentare l'espressione del Gene PSMB6 alla stessa concentrazione (Figura 2B1). Inoltre, l'estratto ha indotto l'espressione del gene del proteasoma 20S, PSMB6, e del gene del proteasoma 19S, RPN11 ad una concentrazione di 1 µg/mL nelle cellule HaCaT (Figura 2B2). Inoltre, il trattamento dei fibroblasti BJ con l'estratto per 24 h ha portato a una lieve induzione dei livelli di espressione della subunità del proteasoma 20S 5 alla concentrazione di 1 µg/mL (Figura 2C). A sostegno delle nostre scoperte, l'esposizione all'estratto ha aumentato significativamente l'attività del proteasoma simile alla chimotripsina sia nei fibroblasti BJ che nei cheratinociti HaCaT dopo 24 ore di incubazione (Figura 2D1, D2); i diversi risultati delle concentrazioni esaminate dell'estratto tra cellule BJ e HaCaT possono essere attribuiti a effetti specifici del tipo cellulare.

Inoltre, le analisi di espressione Q-RT-PCR hanno rivelato che il trattamento dei fibroblasti BJ con l'estratto per 24 ore ha indotto i livelli di espressione dei geni correlati all'ALP, denominati CTSB, CTSL, CTSD e SQSTM1, a una concentrazione di 10 µg/mL ( Figura 3A1). Inoltre, abbiamo osservato che l'esposizione delle cellule HaCaT all'estratto per 24 ore ha portato all'induzione dei livelli di espressione dei geni coinvolti nella funzionalità ALP (CTSB, CTSL, CTSD e SQSTM1) (Figura 3A2).

In linea con questi risultati, abbiamo notato la sovraregolazione delle proteine ​​​​correlate all'autofagia BECN1 e SQSTM1/p62 dopo l'esposizione dei fibroblasti BJ all'estratto alla concentrazione di 1 µ g/mL (Figura 3B1); aumentati livelli di espressione delle proteine ​​BECN1 e SQSTM1/p62 sono stati osservati anche nei cheratinociti HaCaT a entrambe le concentrazioni studiate (Figura 3B2). In conformità, abbiamo scoperto che l'estratto ha potenziato l'attività enzimatica delle catepsine lisosomiali nelle cellule BJ e HaCaT (Figura 3C1, C2); ancora una volta, i diversi risultati delle concentrazioni esaminate dell'estratto tra cellule BJ e HaCaT possono essere attribuiti a effetti specifici del tipo cellulare.

Inoltre, abbiamo esaminato l'effetto dell'estratto sui livelli di espressione di chaperon molecolari chiave. Pertanto, le analisi di immunoblotting hanno rivelato che l'estratto ha indotto i livelli di espressione degli chaperoni molecolari CLU (a entrambe le concentrazioni studiate) nelle cellule BJ (Figura 3D1), nonché di HSP27 (1 µg/mL) e HSP70 (a entrambe le concentrazioni studiate) nelle cellule HaCaT (Figura 3D2).

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