Architettura tridimensionale dei nefroni nel rene normale e cistico

Contatto: emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Cle´ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Ge´rard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8 e Marco Pontoglio1,8

Cistanche fa bene ai reni

PAROLE CHIAVE: malattia renale cistica; rene; nefrone; nefronoftisi;pulizia dei tessuti

La funzione renale dipende in modo cruciale dalla complessa struttura tridimensionale dei nefroni. Qualsiasi distorsione della loro forma può portare adisfunzione renale. I metodi istologici tradizionali presentano importanti limitazioni per la ricostruzione tridimensionale dei tessuti. Qui, abbiamo combinato la pulizia dei tessuti, la microscopia multifotonica e il tracciamento digitale per la ricostruzione di singoli nefroni in condizioni fisiologiche e patologiche. Insiemi dinefronisono stati individuati diversi per posizione, forma e dimensione a seconda della loro funzione. È interessante notare che i nefroni tendono a trovarsi negli aerei. Quando questa tecnica è stata applicata a un modello dimalattia renale cistica, è stato riscontrato che le cisti si sviluppano solo in specifici segmenti di nefrone. Lungo lo stesso segmento, le cisti sono contigue all'interno di tubuli normali non dilatati. Inoltre, le forme delle cisti variavano a seconda del segmento del nefrone. Pertanto, i nostri risultati forniscono una strategia preziosa per visualizzare la complessa struttura dei reni a livello di singolo nefrone e, soprattutto, forniscono una base per comprendere i processi patologici come la cistogenesi.

Dichiarazione traslazionale

I metodi di compensazione forniscono uno strumento unico per comprendere come i cambiamenti morfologici portano a conseguenze patologiche. I reni sono organi critici che mantengono l'omeostasi del corpo attraverso la manipolazione di acqua, metaboliti ed elettroliti, che dipendono in modo cruciale dalla complessa 3-struttura dimensionale dei nefroni. Quando questa organizzazione strutturale è alterata, ne consegue la fisiopatologia renale. Nel presente studio, abbiamo sviluppato un potente metodo basato sul clearing ottico,

microscopia multifotonica e tracciatura digitale per lo studio del rene a livello di singolo nefrone in condizioni fisiologiche e patologiche. In particolare, forniamo la prima 3-ricostruzione dimensionale di un rene policistico alla scala dei singoli nefroni. Questo metodo può essere applicato a diversi contesti patologici, permettendoci di comprendere meglio il complesso processo di deterioramento renale e, di conseguenza, di sviluppare strategie terapeutiche più mirate.

Il rene mantiene l'omeostasi corporea attraverso la sua complessa struttura del nefrone 3-dimensionale (3D). Quando questa organizzazione strutturale è alterata, ne consegue la fisiopatologia renale.Malattie renali cronichesono caratterizzati dallo sviluppo di lesioni renali. È interessante notare che i patologi hanno riportato un'ampia eterogeneità nella distribuzione delle lesioni durante le malattie renali croniche.1,2 Se ciò riflette il fatto che specifici segmenti di nefrone possono essere danneggiati in modo diverso o, in alternativa, che alcuni nefroni hanno diverse suscettibilità a essere feriti nel loro insieme , è sconosciuto. Per affrontare questo problema, è obbligatorio ricostruire la forma 3D dei nefroni in contesti patologici.

Per quello che ci risulta,nefronisono stati completamente ricostruiti solo utilizzando sezioni 2D seriali.3–5 Sebbene il sezionamento istologico standard fornisca un'alta risoluzione, le ricostruzioni 3D sono laboriose e difficili da ottenere. Ciò è dovuto principalmente alle distorsioni meccaniche, che sono un effetto inevitabile della procedura di affettatura. Inoltre, la ricostruzione 3D da immagini 2D non consente l'imaging diretto di strutture 3D in tessuti interi.

La microscopia multifotonica ha migliorato la nostra capacità di rilevare i cambiamenti morfologici nelle sezioni spesse. Tuttavia, una limitazione significativa è la profondità accessibile ridotta a causa della dispersione della luce. Riducendo al minimo le differenze dell'indice di rifrazione, gli agenti di pulizia hanno notevolmente migliorato la capacità di visualizzare le profondità dell'immagine.6,7 Nonostante il fatto che il primo agente di pulizia sia stato introdotto un secolo fa,8 è solo di recente che sono stati sviluppati diversi protocolli di pulizia, principalmente per il cervello .9–17 Studi recenti hanno dimostrato il loro potenziale per l'imaging di altri organi solidi, come fegato, pancreas o reni.18–26

cistanche per malattie renali

Malattia policistica renale, una malattia geneticamente eterogenea che coinvolge mutazioni in diversi geni ciliari, è la malattia renale ereditaria più comune.27,28 La malattia del rene policistico è caratterizzata dallo sviluppo di cisti che portano alla completa distruzione del rene.28 Studi di microdissezione hanno suggerito che le cisti possono svilupparsi sia come una "spinta in uscita" di un segmento di nefrone, come nel policistico autosomico dominantemalattie renali; come espansione ectasica dei dotti collettori (CD), come nel policistico autosomico recessivomalattie renali; o esclusivamente nei tubuli midollari, come nella nefronoftisi (NPHP).27,29 Tuttavia, non è ancora noto come le cisti si sviluppino in 3D e si organizzino tra loro e nei normali tubuli vicini.

Qui, abbiamo combinato la compensazione ottica con la microscopia multifotonica per fornire nuove informazioni su comenefronisono modellati e organizzati in condizioni fisiologiche e come si modificano durante la malattia, come la cistogenesi. I nostri risultati dimostrano che esistono 3 tipi di nefroni e che i vasi possono influenzare l'organizzazione spaziale del nefrone. È interessante notare che abbiamo osservato che i nefroni tendono a giacere su piani specifici. Inaspettatamente, quando abbiamo applicato questa tecnica ai topi jck, abbiamo osservato che le cisti si sviluppavano solo in specifici segmenti di nefrone con cisti fusiformi mescolate a tubuli normali.

RISULTATI

Setup sperimentale

Per studiare la forma dell'interonefroniin relazione al loro ambiente, abbiamo adottato una tecnica basata sulla compensazione ottica e sulla microscopia multifotonica (Figura supplementare S1A). Confrontando diversi protocolli di compensazione ottica, abbiamo determinato che per il rene, l'alcol benzilico/benzil benzoato (BABB) era il più appropriato in termini di efficacia (Figura supplementare S1B e C e Tabella supplementare S1).

La ricostruzione 3D e il tracciamento digitale richiedono immagini di alta qualità con alta risoluzione e un elevato rapporto segnale-sfondo. Abbiamo osservato che il segnale ottico fornito dalla fluorescenza nativa non era uniforme sulle sezioni renali. In particolare, le immagini del midollo erano scarsamente contrastate con un basso rapporto segnale-sfondo (Figura supplementare S2). Per migliorare il rapporto segnale-sfondo, abbiamo colorato le sezioni con acido periodico-Schiff (Figura supplementare S1D), perché abbiamo notato empiricamente che questa colorazione ha dato origine a un contrasto elevato nelle sezioni sottili durante 2- fluorescenza fotonica. Tuttavia, il segnale non era uniforme durante le spesse sezioni renali colorate con acido di Schiff (Figura supplementare S1E). Pertanto, abbiamo colorato le sezioni renali con lectine accoppiate a flfluorocromi: agglutinina di arachidi e agglutinina di germe di grano, che colorano glomeruli e tubuli, e agglutinina di Griffonia simplicifolia, che segna i vasi sanguigni.30 Sorprendentemente, con la combinazione di queste lectine, il segnale di il rapporto di fondo è stato notevolmente aumentato nel complessosezioni renali, con un miglioramento significativo sia nel piano xy che nell'asse z (figura supplementare S1E e filmato supplementare S1).

Visualizzazione 3D del segmento del nefrone

Per visualizzare la forma di interi nefroni, abbiamo tracciato i loro percorsi, iniziando dal polo urinario del glomerulo e finendo alla giunzione CD (Film Supplementare S2). Nonostante il fatto che le lectine utilizzate legano globalmente tutti i segmenti di nefrone, abbiamo notato che, se attentamente ispezionate, queste lectine erano caratterizzate da un pattern specifico nel modo in cui macchiavano le membrane basali o luminali nei diversi segmenti di nefrone. In altre parole, abbiamo sfruttato il modello stereotipato della colorazione della lectina per identificare i diversi segmenti di nefrone. In questo modo, potremmo facilmente identificare 6 entità: tubulo prossimale (PT), arto sottile (TL) dell'ansa di Henle (HL), arto ascendente spesso (TAL) di HL, tubulo contorto distale (DCT), tubulo connettivo (CNT ), e CD. La transizione tra PT e TL è stata caratterizzata dall'improvvisa perdita del tipico segnale del bordo della spazzola PT e dalla diminuzione della larghezza del lume, che era quasi praticamente assente in TL (Figura 1a). Al contrario, la transizione tra TL e TAL è stata caratterizzata da un aumento significativo del diametro tubolare esterno e da una larghezza del lume relativamente costante (Figura 1b). In tuttonefroni, la transizione di TAL a DCT è stata trovata sistematicamente al polo vascolare del glomerulo. Questa transizione è stata caratterizzata da un improvviso allargamento del diametro tubolare esterno dovuto principalmente a un aumento significativo del diametro del lume (Figura 1c). La transizione tra DCT e CNT è stata caratterizzata da una riduzione sia del diametro tubolare che del lume (Figura 1d). Infine, la connessione tra CNT e CD corticale è stata caratterizzata da un improvviso aumento sia del diametro tubulare che del lume (Figura 1e). La quantificazione di queste transizioni morfologiche era statisticamente significativa (Figura 1f) e la sua pertinenza è stata verificata con la colorazione con specifici marcatori tubolari (Figure supplementari S3–S5 e Film supplementare S3–S5).

La forma e le dimensioni dei PT differiscono in base alla loro profondità

La colorazione di spessosezioni renalici ha permesso di tracciare le coordinate dell'evoluzione spaziale di interi segmenti PT. È interessante notare che abbiamo scoperto che la loro forma era estremamente variabile e determinata dalla posizione dei loro glomeruli nella corteccia. A livello globale, abbiamo identificato 3 modelli. Il primo cor rispondeva ai nefroni (SN) più superficiali (Figura 2a; Film supplementare S6), che occupavano la parte più esterna della corteccia (il 30% più esterno vicino alla capsula renale). Le loro parti contorte formavano strutture compatte con solo da 6 a 7 convoluzioni attorno al proprio glomerulo, occupando spazi molto piccoli e ravvicinati. La convoluzione di queste SN terminava in una lunga e diritta pars recta che scendeva nel midollo. All'estremità opposta di questo spettro, abbiamo osservato un secondo modello dinefronisituato nella parte più profonda della corteccia (40 percento in più di profondità interna), vicino al midollo (nefroni juxtamidollari [JNs]) (Figura 2a; Figura S6 supplementare e Film supplementare S6). I loro PT erano caratterizzati da un breve ciclo iniziale che scendeva sistematicamente verso la papilla e poi si girava a U per risalire verso la capsula renale. In contrasto con le SN, i tubuli contorti prossimali JN erano caratterizzati da grandi bobine che si sono evolute attorno al proprio glomerulo e occupavano domini ampi e poco confezionati nella corteccia iuxtamidollare. La parte contorta del PT di JN aveva da 10 a 15 convoluzioni, formando grandi domini. Infine, il terzo modello includeva nefroni situati nella parte centrale della corteccia (nefroni centrali [MNs]) (Figura 2a; Film supplementare S6). È interessante notare che questi tubuli avevano una forma e un orientamento spaziale che rappresentavano una transizione tra SN e JN. In effetti, contenevano da 8 a 9 convoluzioni con bobine più grandi delle SN, ma più piccole delle JN. Inoltre, i MN avevano pars recta più lunghi rispetto ai JN. È interessante notare che un confronto globale delle forme dei PT ha mostrato che SN e MN avevano uno schema omogeneo mentre i JN erano estremamente eterogenei (Figura supplementare S6). Inoltre, la ricostruzione spaziale di diversi nefroni ha rivelato che i PT non si mescolano mai (Film supplementare S6), indicando che ogni nefrone occupa il proprio spazio individuale nella corteccia.

Le analisi morfometriche hanno confermato le grandi differenze nelle dimensioni e nella forma di SN e JN, con un aspetto intermedio per i MN. Il PT dei JN era più di 2- volte più lungo del PT dei SN (Figura 2b); tuttavia, la rettilineità era maggiore negli SN rispetto ai JN (Figura 2c), coerentemente con l'osservazione che i tubuli JN erano molto più tortuosi (Figura 2a; Figura S6 supplementare).

Figura 1|Criteri morfologici utilizzati per identificare i segmenti di nefrone. (a-e) Morfologia dei diversi segmenti del nefrone nei topi di controllo. I nefroni sono stati tracciati dal polo urinario del glomerulo al dotto collettore (tubulo prossimale [PT]: turchese; lembo sottile [TL] dell'ansa di Henle: grigio chiaro; arto ascendente spesso [TAL] dell'ansa di Henle: grigio scuro; tubulo contorto distale [DCT]: rosa; tubulo di collegamento [CNT]: giallo; dotto collettore corticale [CCD]: arancione). Le frecce indicano il diametro dei diversi segmenti di nefrone. (continua)

Figura 1|(Continua) (f) Quantificazione del diametro tubolare esterno dei diversi segmenti di nefrone. I dati sono espressi come SEM medio. Analisi della varianza seguita dal test di Tukey-Kramer: **P < 0.01,="" ***p=""><>

Figura 3|La ricostruzione tridimensionale (3D) del nefrone rivela 3 diversi tipi di nefroni. (a) Immagini 3D rappresentative di un intero nefrone (pannelli di sinistra) dai glomeruli al condotto di raccolta nella corteccia superficiale (blu), nella corteccia media (verde) e nella regione juxtamidollare (rossa) nei topi di controllo. Segmentazione dei nefroni (pannelli di destra) per i 3 diversi tipi di nefroni. Barra ¼ 150 mm. (b) Quantificazione dell'interdistanza tra i 2 rami dell'ansa di Henle per i 3 tipi di nefroni. (c) Quantificazione della lunghezza del nefrone per il (continua)

Figura 3|(continua) 3 tipi di nefroni. (d) Quantificazione della lunghezza dei diversi segmenti del nefrone a seconda del tipo di nefrone. I dati sono espressi come media -SEM. Analisi della varianza seguita dal test di Tukey-Kramer: nefrone juxtamedullary (JN) versus nefrone superficiale (SN): ###P < 0.001;="" jn="" contro="" nefrone="" medio="" (mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" tubo="" di="" collegamento;="" dct,="" tubulo="" contorto="" distale;="" pt,="" tubulo="" prossimale;="" tal,="" spesso="" arto="" ascendente="" dell'ansa="" di="" henle;="" tl,="" lembo="" sottile="" dell'ansa="" di="">

La dimensione glomerulare varia con la profondità

Abbiamo quindi analizzato la profondità e il diametro dei glomeruli selezionati casualmente da ciascuna delle 3 zone. Le analisi morfometriche hanno rivelato che i glomeruli si trovavano in media a 783 e 355 mm dalla capsula renale rispettivamente in JN e SN. Come riportato in precedenza, abbiamo osservato che le dimensioni dei glomeruli variavano in base alla loro profondità. In particolare, il volume glomerulare di JN era 3 volte maggiore di quello di SN e MN (Figura 2d).

Ricostruzione 3D del nefrone

Abbiamo quindi tracciato l'evoluzione spaziale di interi nefroni da PT a CNT. La visione globale della loro ricostruzione 3D ha confermato che la forma del nefrone differiva tra SN, MN e JN (Figura 3a; Film supplementare S7). Questa differenza era principalmente dovuta alla struttura di PT. Inoltre, abbiamo osservato che HL aveva una diversa organizzazione spaziale 3D. In particolare, TL e TAL erano più distanti nei JN rispetto a SN e MN (Figura 3b). Le analisi morfometriche hanno rivelato che le JN erano globalmente 2- volte più lunghe delle SN (Figura 3c). L'aumento della lunghezza è stato distribuito proporzionalmente in tutti i segmenti, ad eccezione di TAL e DCT, che tendevano ad avere una lunghezza assoluta simile in tutti i tipi di nefrone (Figura 3d). Ciò ha suggerito che l'allungamento del nefrone è un processo sorprendentemente omogeneo.

I vasi arcuati influenzano la convoluzione PT juxtamidollare

Per ottenere una prospettiva più completa delstruttura renale, abbiamo sfruttato la colorazione dell'agglutinina di Griffonia simplicifolia, che ci ha permesso di tracciare i vasi arcuati e i loro rami nei vasi corticali radiati (Figura 4a; Film supplementare S8). È interessante notare che la concomitante ricostruzione 3D di nefroni e vasi ha mostrato che i vasi arcuati tendono ad essere in una sorprendente organizzazione spaziale parallela con i tubuli vicini. In particolare, abbiamo osservato che il percorso seguito da specifici JN (JN vincolati) tende a seguire il percorso della nave vicina (Figura 4b; Film supplementare S9). Sorprendentemente, questa distorsione (osservata solo in un sottoinsieme di nefroni JN) spiegava la grande eterogeneità nelle forme di PT (Figura supplementare S6). Le analisi morfometriche hanno rivelato che i PT "vincolati" erano significativamente più lunghi e tortuosi (ridotta rettilineità) rispetto a quelli "non vincolati" (Figure 4c e d). Vale la pena notare che le parti contorte di SN e MN erano posizionate sopra i vasi arcuati e non erano vincolate.

I tubuli tendono a giacere negli aerei

È interessante notare che l'ispezione delle forme 3D dei nefroni ha indicato che tendono a giacere su piani (Figura 5a; Film supplementare S10). Per quantificare questo parametro e per valutare la possibile distorsione statistica di questa conformazione, abbiamo misurato la tendenza generale dei tubuli a piegarsi fuori dal piano definito dalle loro anse. Le nostre misurazioni hanno mostrato che rispetto a un modello simulato di camminata casuale generato con lo stesso insieme di angoli misurati consecutivi e lunghezza tra punti consecutivi (Figura 5b), i tubuli tendevano ad evolversi con una deviazione minore da un piano (Figura 5c). Ciò indicava che i tubuli tendevano a limitare il loro percorso lungo un piano. Le differenze osservate erano altamente statisticamente significative (P <>

cistance può migliorare la funzione renale

La ricostruzione 3D del nefrone rivela un modello specifico per lo sviluppo delle cisti

Per determinare se il nostro protocollo consente di tracciare i nefroni in tessuti patologici disorganizzati, abbiamo caratterizzato le forme e la distribuzione spaziale delle cisti nei topi jck, un modello ampiamente utilizzato di NPHP e malattia cistica.31–{1}}Le immagini D lo hanno mostrato nonostante della comparsa di cisti prominenti, il decorso 3D generale dei nefroni non differiva significativamente da quello dei topi di controllo (Film supplementare S11). Allo stesso modo, le analisi morfometriche hanno confermato che la lunghezza globale dei nefroni, il volume glomerulare e la lunghezza di ciascunonefronesegmento erano paragonabili a quelli dei topi di controllo (Figura supplementare S7). Da notare, a causa dello sviluppo della cisti, non siamo stati in grado di differenziare TL da TAL in HL. Tutti i nefroni hanno sviluppato cisti fusiformi (Film supplementari S11 e S12). Una delle caratteristiche più sorprendenti è stata l'osservazione che le dilatazioni cistiche fusiformi si sono verificate in più posizioni lungo lo stessonefronesegmento (Film supplementari S12 e S13). Curiosamente, abbiamo osservato che le cisti non si sono mai sviluppate negli arti discendenti di PT e HL (Figura 6a; Film supplementare S12). Al contrario, sono stati rilevati principalmente negli arti ascendenti HL, DCT, CNT e nella parte superiore dei CD, in continuità con CNT (Figura 6a; Film supplementare S12). In particolare, abbiamo osservato che la DCT, così come i segmenti CNT, avevano una probabilità particolarmente aumentata di sviluppare cisti nelle rispettive parti più distali (Figura 6b). Le analisi morfometriche quantitative delle immagini di ricostruzione 3D hanno rivelato che il volume totale della cisti pernefroneera particolarmente alto in CNT (Figura 7a). Inoltre, abbiamo osservato che gli allargamenti delle cisti in HL e DCT erano maggiori nei JN rispetto a SN e MN (Figura 7a; Film supplementare S12). Inoltre, l'incidenza della cisti era significativamente più alta nei JN rispetto agli altri tipi di nefroni (Figura 7b). Abbiamo anche osservato che l'interdistanza glomerulare media (calcolata sui 5 glomeruli più vicini) tendeva ad essere particolarmente aumentata nei topi cistici, specialmente nella corteccia più superficiale (Figura supplementare S8).

La ricostruzione 3D di numerose cisti ha rivelato che erano estremamente variabili per forma e volume (Figura 6c; Film supplementari S11 e S13). Nell'arto ascendente HL, le cisti avevano una forma fusiforme con un piccolo diametro. Nella DCT, le cisti avevano una forma piuttosto sferica e più grande ed erano disseminate tra i tubuli non dilatati. È interessante notare che la transizione tra DCT e CNT è stata sistematicamente caratterizzata da una normale struttura non dilatata. Al contrario, in CNT, abbiamo osservato sistematicamente una struttura cistica dilatata contigua direttamente a contatto con il CD. È interessante notare che, in CD, questa struttura si è progressivamente ridotta a una dimensione normale dei tubuli. Più distalmente, non è stato possibile rilevare ulteriori cisti nella porzione contigua del MC. Un'altra caratteristica consistente era la peculiare organizzazione spaziale delle cisti nell'arto ascendente HL. Infatti, sebbene le cisti fossero più profonde e più vicine al ciclo nelle SN, erano più superficiali e più vicine alla DCT nelle JN (Figura 6c). Anche in questo caso, le cisti occupavano una posizione intermedia nei MN (Figura 6c).

Figura 5|I tubuli del nefrone tendono ad evolversi come una struttura piatta. (a) Un percorso tipico di un tubulo prossimale del nefrone. Questo percorso illustra la sua tendenza a giacere su un piano. La planarità dell'evoluzione del percorso si nota meglio se opportunamente ruotato e allineato con il punto di vista dell'osservatore (si veda la rappresentazione di destra dello stesso segmento tubolare, che, sul lato sinistro, è rappresentato su una diversa angolo). (b) Rappresentazione schematica di un percorso tubolare composto da 4 segmenti (tra 5 punti che definiscono un determinato percorso tubolare mostrato a titolo di esempio). Il grado in cui i percorsi tendono ad andare "fuori dal loro piano" può essere rappresentato dall'angolo qui indicato come "beta". (continua)

Figura 5|(Continua) Questo angolo viene misurato tra il segmento p3-p4 rispetto al piano (definito dai punti immediatamente precedenti p3, p2 e p1) e rappresentato nello schema da un rettangolo grigio scuro. Il calcolo degli angoli beta è stato quindi calcolato ricorsivamente lungo l'insieme dei punti in un percorso tubolare. Per valutare l'entità della distorsione di questi angoli beta, abbiamo simulato una camminata casuale (simulazione Monte Carlo [MCs]) utilizzando lo stesso insieme di angoli alfa consecutivi di ciascun percorso tubolare (misurato tra tutti i segmenti consecutivi). Questa camminata casuale ha generato un percorso con un insieme identico di angoli alfa e angoli beta randomizzati. (c) Grafici di violino della distribuzione globale degli angoli beta e del risultato di MC nel tubulo prossimale (PT), arto sottile (TL) dell'ansa di Henle, arto ascendente spesso (TAL) dell'ansa di Henle, tubulo contorto distale ( DCT) e tubulo connettivo (CNT). MC, P <>

DISCUSSIONE

I metodi istologici tradizionali sono limitati nella loro capacità di rilevare cambiamenti patologici che influenzano la forma globale dei nefroni. Qui, presentiamo un potente approccio basato sulla pulizia dei tessuti che ha il potenziale per affrontare questioni cruciali sull'architettura renale con dettagli spaziali senza precedenti in condizioni normali e patologiche. I nostri risultati hanno confermato l'esistenza di 3 tipi di nefroni, che differiscono per posizione, forma e dimensioni, coerenti con le loro specificità funzionali. Inoltre, abbiamo dimostrato che i nefroni tendono a giacere negli aerei e ad adattarsi all'organizzazione spaziale della nave. È interessante notare che quando abbiamo applicato questa tecnica a un modello dimalattia renale cistica, abbiamo osservato che le cisti si sviluppano in tutto

nefroni, ma solo in segmenti specifici. È interessante notare che abbiamo dimostrato che la forma della cisti varia in base al segmento del nefrone e che lungo lo stesso nefrone le cisti si intercalano con i tubuli normali non dilatati. Complessivamente, questi risultati forniscono la prima caratterizzazione 3D della disposizione spaziale di nefroni e vasi e, soprattutto, forniscono le basi per comprendere un processo patologico, come la cistogenesi.

La compensazione ottica del rene è impegnativa a causa degli alti livelli di autofluorescenza e densità cellulare. Confrontando diversi protocolli di clearing, abbiamo identificato in BABB una potente tecnica per implementare la visualizzazione e la ricostruzione di strutture situate nella parte più profonda delrene, cioè il midollo. Inoltre, BABB è rapido e scalabile e, una volta cancellati, i campioni possono essere conservati per mesi prima dell'acquisizione dell'immagine. Un altro vantaggio principale di questa tecnica è il suo basso costo. I chiarificanti possono provocare il restringimento o l'allargamento delle strutture.9-17 Tuttavia, poiché queste modificazioni delle dimensioni del rene sono isotrope, non ci si aspetta che le misurazioni relative ne risentano o ne distorcano l'interpretazione. Una delle limitazioni più importanti è l'annotazione di strutture che richiede molto tempo. Tuttavia, esiste un numero crescente di tecniche basate sul deep learning che dovrebbero superare rapidamente questa limitazione.

Coerentemente con i risultati ottenuti con le tecniche classiche, il nostro studio ha mostrato che i nefroni differiscono per forma e lunghezza a seconda della loro posizione. In particolare, abbiamo osservato che i JN hanno PT contorti più sviluppati e glomeruli più grandi e sono 2 volte più lunghi dei SN. L'aumento della lunghezza è il risultato di un processo armonioso perché l'allungamento interessa proporzionalmente tutti i segmenti del nefrone. Abbiamo anche osservato che i JN hanno HL più grandi. Complessivamente, questi dati mostrano chiaramente che la microanatomia di SN e JN è ​​significativamente diversa e che i MN mostrano caratteristiche intermedie. È interessante notare che gli studi fisiologici hanno dimostrato che anche i nefroni sono funzionalmente diversi.2 Gli eventi morfogenetici che stanno alla base di queste differenze non sono ancora noti. Si è quindi tentati di ipotizzare che la struttura particolare dei JN possa spiegare la specificità delle loro funzioni.

È interessante notare che, fornendo per la prima volta la ricostruzione 3D dei nefroni e dei loro vasi circostanti, abbiamo scoperto un vincolo spaziale tra i vasi arcuati e un sottogruppo di nefroni. Pertanto, è concepibile pensare che le navi possano dettare la stradanefroniallungare durante lo sviluppo.34,35 L'ispezione delle forme 3D dei nefroni combinata con simulazioni computazionali ha anche rivelato che i nefroni non si mescolano mai e che ogni nefrone tende a giacere su un piano. Resta da chiarire il significato funzionale di questa osservazione.

Sviluppo della cisti durantemalattia policistica renaleè ancora un processo intrigante. La NPHP, una condizione patologica caratterizzata dallo sviluppo di cisti, è la più comune malattia renale allo stadio terminale che causa malattie genetiche nei bambini e negli adolescenti. Finora sono stati identificati venti geni NPHP.36 Tra questi, NEK8 codifica per un membro della famiglia delle chinasi correlate alla mitosi A, che gioca un ruolo nella funzione delle ciglia e nella progressione del ciclo cellulare.37 Nek8 era originariamente caratterizzato come il gene mutato in topi jck.32 In particolare, è stato dimostrato che una mutazione nello stesso dominio proteico porta a NPHP9 negli esseri umani.38 2Gli studi D hanno suggerito che lo sviluppo delle cisti differisce notevolmente tra le diverse forme di malattia del rene policistico.27,29 In particolare , nella NPHP, le cisti sembrano derivare esclusivamente da CD e DCT.31 Sebbene informativi, questi studi immunoistochimici non possono argomentare contro la possibilità che la perdita di specifici marcatori tubulari39 spieghi artificialmente questa osservazione. Pertanto, il nostro studio 3D fornisce la prima chiara evidenza che lo sviluppo della cisti è un processo che può coinvolgere solo specifici segmenti di nefrone. È interessante notare che, sebbene la NIMA (Never In mitosis gene A)-Related Kinase 8 (NEK8) sia espressa nel citoplasma di tutti i segmenti di nefrone, la sua espressione nelle ciglia è limitata a DCT e CD. Poiché solo questi segmenti sono inclini a sviluppare cisti,31 possiamo postulare che l'interruzione della funzione ciliare NEK8 sia l'evento cruciale per la formazione di cisti. Curiosamente, abbiamo anche osservato che le cisti fusiformi sono in continuità con i tubuli normali non dilatati. Il fatto che una mutazione germinale recessiva porti a un fenotipo patologico solo in un sottoinsieme di cellule suggerisce che un secondo evento potrebbe innescare lo sviluppo di cisti in queste cellule, come suggerito per il policistico autosomico dominantemalattie renali.40,41

Abbiamo anche osservato che l'allargamento della cisti è più predominante nelle JN che nelle SN, almeno considerando le cisti che si localizzano tra PT e CNT. Coerentemente, è stato riportato che nel contesto della glomerulosclerosi, le lesioni glomerulari si trovano più frequentemente nelle JN che nelle SN.1,21,42 Se il superlavoro dovuto all'aumentonefronei tassi di fifiltrazione glomerulare e le attività di trasporto/enzimatiche spiegano l'aumentata suscettibilità dei JN al deterioramento è un'ipotesi interessante che merita ulteriori indagini.

In sintesi, descriviamo una nuova tecnica per l'immagine dei reni in 3D con specificità molecolare e risoluzione sufficienti per registrare direttamente la distribuzione spaziale e quantitativa di strutture interne specificatamente etichettate (nefroni, vasi e cisti). Data la comodità, la velocità e la capacità di quantificazione diretta, prevediamo che questa tecnica diventerà un potente strumento per comprendere la fisiopatologia renale.

Figura 6|La ricostruzione del nefrone tridimensionale (3D) rivela che le cisti si sviluppano solo in specifici segmenti del nefrone. (a) Immagini 3D rappresentative con rendering del volume della cisti di un intero nefrone (pannelli di sinistra) dai glomeruli al condotto di raccolta nella corteccia superficiale (blu), nella corteccia media (verde) e nella regione juxtamidollare (rossa) nei topi jck. Segmentazione dei nefroni (pannelli di destra) per i 3 diversi tipi di nefroni. Barra ¼ 150 mm. (b) Probabilità di sviluppare cisti nei diversi segmenti di nefrone nei topi jck. (continua)

Figura 6|(Continua) L'asse orizzontale è una lunghezza normalizzata di nefroni corrispondente a 50 bin (tubulo prossimale [PT], turchese; ansa di Henle [HL], bianco; tubulo contorto distale [DCT], rosa; tubulo di collegamento [CNT], giallo) . (c) Immagini rappresentative di ricostruzione di cisti 3D con rendering del volume della cisti dell'arto ascendente di HL (pannelli di sinistra), DCT (pannelli centrali) e CNT e dotti collettori corticali (CCD) (pannelli di destra) in superficiale (pannelli superiori), al centro (pannelli centrali) e nefroni juxtamidollari (pannelli inferiori) nei topi jck. Barra ¼ 50 mm.

METODI

Animali

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dai "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" e dal comitato etico dell'Université Paris Descartes. Sono stati utilizzati topi FVB/N di due mesi (n¼ 20) per impostare la condizione sperimentale per la pulizia dei reni. Lo studio è stato quindi condotto su 2- topi maschi jck di una settimana (n=4) e compagni di cucciolata di controllo (n=3).

Preparazione dei tessuti renali

Prima dell'uccisione, i topi sono stati perfusi, tramite cateterizzazione intracardiaca, con 25 ml di soluzione salina eparinizzata (1000 UI/l) seguiti da 75 ml di paraformaldeide al 4% in soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS). Gli esperimenti sono stati condotti in anestesia con xilazina (Rompun 2 percento, Bayer, Leverkusen, Germania, 6 mg/g di peso corporeo) e ketamina (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Francia, 120 mg/g di peso corporeo).

Per gli studi di clearing, i reni sono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 4 ore e incorporati in agarosio al 4% e sezioni spesse 1.{4}}mm che circondano l'ilo renale sono state tagliate e conservate in PBS a 4°C.Sezioni renalisono stati prima macchiati e poi cancellati.

Per studi immunoistochimici su sezioni sottili,renisono stati fissati in paraformaldeide al 4% durante la notte e sono state tagliate sezioni incluse in paraffifina e 4-mm.

Colorazione

Colorazione periodica con acido-Schiff. Le sezioni renali da 1.5-mm sono state incubate in acido periodico Schiff puro o diluito 1:100 PBS per 5 minuti a temperatura ambiente prima della pulizia.

Immunoistochimica su sezioni sottili incluse in paraffifina. Sezioni di quattro micrometri di reni inclusi in paraffifina sono state riscaldate per il recupero dell'antigene e incubate per una notte a 4°C con lectine accoppiate a flfluorocromo per tracciare i tubuli (agglutinina di arachidi di rodamina [RL-1072-5] e agglutinina di germe di grano di rodamina [RL{{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, diluito a 1:200) e anticorpo primario specifico del segmento per rappresentare segmenti tubolari distinti (lectina biotinilata di Lotus tetragonolobus [B-1325], Vector Laboratories, diluita a 1: 100; topo anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Germania, diluito a 1:200; anti capra AQP2 [C-17], Santa Cruz, diluito a 1:200) . Il giorno successivo, le sezioni sono state incubate con l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente (Alexa Fluor 488 conjugate [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mouse Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; tutto diluito a 1:500) prima di essere colorato con 40,{33}}diamidino-2-fenilindolo. Tutte le immagini sono state acquisite con un microscopio Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Francia) e preparate utilizzando il software FiJi (versione 1.50).

Colorazione di lectina su sezioni spesse. Le sezioni renali dello spessore di 1.5-mm sono state incubate a 4°C per 1 mese in Texas Red o lectine accoppiate con isotiocianato di flfluoresceina: agglutinina di arachidi (RL-1072-5) e agglutinina di germe di grano (RL{{6} }), diluito a 1:100 in 0,1% PBS azide e 0,1% Triton-X. Le sezioni sono state quindi lavate ogni giorno per 2 settimane con PBS prima della pulizia.

Cancellazione ottica

Per la compensazione delle incrostazioni, le sezioni renali da 1,5-mm sono state incubate in ScaleA2 (4 M urea, 0,1 percento di Triton X-100, 10 percento di glicerolo) o ScaleB4 (8 M urea, 0,1% Triton X-100) per 2 settimane, fino a 1 anno, a 4°C.

Per la pulizia BABB, le sezioni renali da 1,5- mm sono state disidratate in risciacqui sequenziali di etanolo a temperatura ambiente. I campioni sono stati quindi incubati in BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) in un rapporto 1:2 per almeno 2 giorni a 4°C.

Acquisizione di immagini al microscopio a due fotoni

I tessuti sono stati ripresi con gel acquoso su un microscopio multifotonico invertito (LaVision BioTec) dotato di un laser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figura supplementare S1A). La lunghezza d'onda di eccitazione era di 815 nm all'8% della potenza. Abbiamo utilizzato un obiettivo a immersione in acqua da 20 (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Giappone]; apertura numerica, 0,95; distanza di lavoro, 2,0 mm). Per l'acquisizione della fluorescenza, abbiamo utilizzato un rivelatore non scansionato all'80 percento con un filtro passa-banda 593/40 nm.

Il primo passaggio consisteva nell'acquisizione di immagini a mosaico 2D nella pila z centrale utilizzando parametri di acquisizione non ottimali (400 mm 400 mm e 1011 1011 pixel, con una sovrapposizione del 10 percento e una linea media a 2) per guidare la selezione dei campi centrali più rilevanti (Figura supplementare S9A). Una volta definiti la griglia xy e z fifields di interesse, i parametri sono stati regolati per acquisire immagini di alta qualità. Tale approccio ha ridotto la regione di interesse a 5 12 fifield per z stack. Quindi, abbiamo acquisito 850 z stack/fette ottiche (1-mm di passo) che circondano l'ilo renale nella parte centrale delsezione renale.

Cucitura, elaborazione e tracciatura di immagini

Ciascuna pila è stata affiancata secondo il metodo sviluppato da Preibisch et al., 43 che consente la cucitura di un'ampia raccolta di immagini utilizzando il plug-in "Grid/Collection stitching" del software Fiji (http://fifiji.sc/Fiji) . Poiché abbiamo osservato un importante spostamento tra 2 immagini adiacenti dopo la cucitura, abbiamo scritto un programma di corrispondenza personalizzato in Python. Questo programma compensa lo spostamento dell'immagine, consentendoci di allineare correttamente le immagini (Figura supplementare S9B). Le immagini con correzione cucita sono state analizzate utilizzando Imaris versione 8.4.2 (Bitplane, Zurigo, Svizzera). Tubuli e vasi sono stati tracciati utilizzando la modalità manuale del pacchetto tracciante fifilamento di Imaris e uniti da un Imaris Xtension che abbiamo sviluppato con MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Partecipa{{12) }} Filamento_Tool.zip?dl¼0) (Figura supplementare S9C). Glomeruli e cisti sono stati ricostruiti in 3D utilizzando la modalità manuale del pacchetto di superficie di Imaris. L'organizzazione spaziale 3D dei glomeruli è stata visualizzata utilizzando la modalità manuale del pacchetto spot di Imaris.

Morfometria

La lunghezza del segmento tubolare, la lunghezza del nefrone e la rettilineità sono state determinate utilizzando il pacchetto tracciante a fifilamento di Imaris. Secondo il software Imaris, la rettilineità è stata quantificata come il rapporto tra la distanza tra 2 punti e la lunghezza del percorso del segmento del nefrone. Trentuno PT e 12 nefroni interi sono stati ricostruiti e misurati in 3 topi wild-type, mentre 37 PT e 17 nefroni interi sono stati ricostruiti e misurati in 4 topi jck. Cisti e

i volumi glomerulari sono stati determinati utilizzando il "pacchetto di superficie" di Imaris. Trentuno e 34 glomeruli sono stati misurati rispettivamente nei topi wild-type e jck. Settantaquattro cisti sono state misurate in totale.

Gli angoli "fuori dal piano" delle curve tubolari (indicati come "beta") sono stati misurati tra il piano (definito da 3 punti consecutivi) e la direzione con il successivo quarto punto consecutivo nello spazio (Figura 5b). Per valutare la significatività statistica del bias osservato, abbiamo simulato la distribuzione degli angoli beta con una rotazione casuale degli angoli beta (simulazione Monte Carlo) in strutture composte dagli stessi segmenti con lo stesso insieme di angoli alfa.

Per il calcolo della probabilità di sviluppare una lesione cistica lungonefronesegmenti, abbiamo rappresentato ciascun nefrone con un insieme di punti nello spazio. Ogni punto è stato annotato in relazione alla presenza di cisti rispetto alla struttura normale e al tipo di segmento. La probabilità a ciascuna lunghezza standardizzata (fissata a 50 bin) è stata calcolata come rapporto tra il numero di punti con annotazione cistica e il numero totale di punti nel bin.

Per il calcolo dell'interdistanza glomerulare media, abbiamo considerato per ciascun glomerulo l'interdistanza glomerulare media calcolata sui 5 glomeruli più vicini.

Analisi e statistiche dei dati

I dati sono espressi come SEM medio. Le differenze tra i gruppi sperimentali sono state valutate utilizzando l'analisi della varianza seguita, quando significativa (P < {{0}}.05),="" dal="" test="" di="" tukey-kramer.="" quando="" sono="" stati="" confrontati="" solo="" 2="" gruppi,="" è="" stato="" utilizzato="" il="" test="" di="" mann-whitney.="" le="" analisi="" statistiche="" sono="" state="" eseguite="" utilizzando="" il="" software="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" versione="">

CHIARIMENTI

Tutti gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.

RINGRAZIAMENTI

Ringraziamo il Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative de Recherche Necker per l'assistenza tecnica. Ringraziamo Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler e Nicolas Kuperwasser per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Basilea , Svizzera) e Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Parigi, Francia).

CONTRIBUTI D'AUTORE

TB, NG e MZ hanno progettato ed eseguito gli esperimenti e analizzato i dati. Anche FB, LT, MGT e SG hanno eseguito alcuni esperimenti e analizzato i dati. MB e CN hanno eseguito gli esperimenti sui topi. Anche TB e MZ hanno contribuito alla stesura del manoscritto. GF ha rivisto il manoscritto. FT e MP hanno fornito la struttura concettuale e progettato lo studio, supervisionato il progetto e scritto il documento.

cistanche può tonificare i reni

MATERIALE SUPPLEMENTARE

File supplementare (PDF)

Figura S1. Configurazione sperimentale, procedura di acquisizione ed elaborazione delle immagini.

Figura S2. Limiti del segnale di autoflfluorescenza nelle risoluzioni xy e z.

Figura S3. Immagine bidimensionale della transizione tra PT e TL su sezioni renali incluse in paraffifina di 4- mm.

Figura S4. Immagine bidimensionale della transizione tra TAL e DCT su sezioni renali incluse in paraffifina di 4- mm.

Figura S5. Immagine bidimensionale della transizione tra DCT e CNT su sezioni renali incluse in paraffifina di 4- mm.

Figura S6. La ricostruzione tridimensionale rivela 3 diverse forme di tubuli prossimali.

Figura S7. La ricostruzione tridimensionale rivela che la lunghezza e la segmentazione dei nefroni non sono influenzate dalle cisti.

Figura S8. Densità dei glomeruli nei reni di controllo e cistici.

Figura S9. Procedura di acquisizione ed elaborazione delle immagini post-trattamento.

Tabella S1. Confronto dei metodi di compensazione. File supplementare (Film)

Film S1. La colorazione della lectina migliora notevolmente la risoluzione e il rapporto segnale-sfondo.

Film S2. Tracciamento del percorso di un tubulo.

Film S3. Ricostruzione tridimensionale di un rene sgomberato che mostra la giunzione tra il tubulo prossimale e l'arto sottile dell'ansa di Henle.

Film S4. Ricostruzione tridimensionale di un rene schiarito che mostra la giunzione tra lo spesso arto ascendente dell'ansa di Henle e il tubulo contorto distale.

Film S5. Ricostruzione tridimensionale di un rene sgomberato che mostra la giunzione tra il tubulo contorto distale e il tubulo di collegamento.

Film S6. La forma e le dimensioni dei tubuli prossimali differiscono in base alla loro profondità.

Film S7. Ricostruzione tridimensionale del nefrone nei topi di controllo.

Film S8. Tracciamento del percorso di un vaso da un vaso arcuato a un vaso radiato corticale.

Film S9. I vasi arcuati modellano la forma dei tubuli prossimali iuxtamidollari.

Film S10. I nefroni tendono a giacere su un piano.

Film S11. La ricostruzione tridimensionale del nefrone mostra un pattern specifico per lo sviluppo delle cisti.

Film S12. La segmentazione tridimensionale del nefrone rivela che le cisti si sviluppano in specifici segmenti del nefrone.

Film S13. Disposizione spaziale e interrelazione di nefroni e vasi in un rene policistico

RIFERIMENTI

1. AR ricca. Una vulnerabilità finora non descritta dei glomeruli iuxtamidollari nella nefrosi lipoide. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Eterogeneità dell'anatomia del nefrone. Rene Int Suppl. 1987;20:S25–S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al. Ricostruzione tridimensionale del nefrone di ratto. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Ricostruzione tridimensionale digitale e ultrastruttura del tubulo prossimale del topo. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611–619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Ricostruzione tridimensionale del nefrone del topo. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Ora possiamo vedere chiaramente: clearing ottico e morfometria renale. Curr Opin Nefrolo Hypertens. 2017;26:179–186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Tecniche di clearing ed etichettatura per tessuti biologici su larga scala. Cellule moli. 2016;39:439–446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Lipsia, Germania: S. Hierzel; 1914.

9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Scala: un approccio chimico per l'imaging a fluorescenza FL e la ricostruzione del cervello di topo trasparente. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al. Imaging tridimensionale di organi eliminati con solvente utilizzando 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: un metodo di pulizia privo di detergenti e solventi per il tessuto neuronale e non neuronale. Sviluppo. 2013;140:1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. Cancellazione ottica di campioni cerebrali fissi utilizzando SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:22.2.1–22.2.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY per la mappatura del sistema nervoso. Metodi Nat. 2013;10:508–513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY per l'imaging rapido e ad alta risoluzione di tessuti intatti. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Fenotipizzazione unicellulare all'interno di tessuto intatto trasparente attraverso la compensazione dell'intero corpo. Cellula. 2014;158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Imaging del cervello intero con risoluzione unicellulare utilizzando cocktail chimici e analisi computazionale. Cellula. 2014;157:726–739.

17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Imaging molecolare tomografico e quantificazione 3D all'interno di organi di topo adulto. Metodi Nat. 2007;4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Microscopia multifotonica di organi di topo ripuliti. J Biomed opz. 2010;15:036017.

19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: un metodo semplice e rapido per immunomarcare campioni di tessuto di grandi dimensioni per l'imaging volumetrico. Cellula. 2014;159: 896–910.

20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Migliorata l'applicazione della tecnologia di pulizia dei tessuti elettroforetici, CLARITY, agli organi solidi intatti tra cui cervello, pancreas, fegato, rene, polmone e intestino. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. L'aumento della pressione capillare glomerulare e delle dimensioni mediano la glomerulosclerosi nella corteccia iuxtamidollare SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Imaging del rene: dalla microscopia ottica alla super risoluzione. Trapianto di quadrante di nefrolo. 2021;36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validazione di un metodo tridimensionale per il conteggio e il dimensionamento dei podociti in glomeruli interi. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Ruolo dell'architettura tridimensionale nel meccanismo di concentrazione delle urine del midollo interno renale di ratto. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. La pulizia ottica nel rene rivela un rimodellamento dei tubuli mediato dal potassio. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. L'imaging combinato strutturale e funzionale del rene rivela importanti differenze assiali nell'endocitosi del tubulo prossimale. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopatie. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Malattia policistica renale. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.

29. Wilson PD. Malattia policistica renale. N inglese J Med. 2004;350:151–164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Cambiamenti nel pattern di glicosilazione durante lo sviluppo embrionale del rene di topo come rivelato con i coniugati di lectina. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.

31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Sviluppo della malattia del rene policistico nei topi del rene cistico giovanile: approfondimenti sulla patogenesi, anomalie ciliari e caratteristiche comuni con la malattia umana. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821–2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Un difetto in una nuova chinasi della famiglia Nek provoca una malattia renale cistica nel topo e nel pesce zebra. Sviluppo. 2002;129:5839–5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J, et al. Mappatura della risonanza magnetica T2 e imaging ponderato in diffusione per la diagnosi precoce della cistogenesi e la risposta alla terapia in un modello murino di malattia del rene policistico. Rene int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Determinanti molecolari della specializzazione vascolare del nefrone nel rene. Nat Comune. 2019;10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Comunicazione endoteliale-epiteliale nella malattia del rene policistico: ruolo della segnalazione del fattore di crescita endoteliale vascolare. Segnale cellulare. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Molti geni, una malattia? Genetica della nefronoftisi (NPHP) e disturbi associati a NPHP. pediatria anteriore 2017;5:287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Regolazione del ciclo cellulare mediante la famiglia di protein chinasi NEK. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Le mutazioni di NEK8 influenzano la localizzazione ciliare e centrosomica e possono causare nefronoftisi. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.

39. Wilson PD. Polarità apico-basale negli epiteli della malattia del rene policistico. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.

40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. La lesione tubulare tossica nei reni di topi con delezione Pkd1- accelera la cistogenesi accompagnata da polarità cellulare planare disregolata e vie di segnalazione Wnt canoniche. Hum Mol Genet. 2009;18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Un passaggio critico dello sviluppo definisce la cinetica della formazione di cisti renali dopo la perdita di Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Meccanismo della suscettibilità unica dei glomeruli corticali profondi dei reni in fase di maturazione alla sclerosi glomerulare focale grave. Pediatr Ris. 1990;28:270–276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Cucitura ottimale a livello globale di acquisizioni di immagini microscopiche 3D piastrellate. Bioinformatica. 2009;25: 1463–1465.