La lamivudina migliora il declino cognitivo nei topi SAMP8: integrazione nella valutazione farmacologica in vivo e nella farmacologia di rete

Astratto

Gli inibitori della trascrittasi inversa come la lamivudina (3TC) svolgono un ruolo importante inanti età, ma i loro effetti sumalattie neurodegenerative causate dall'invecchiamentonon sono chiare, soprattutto sulle funzioni delsistema nervoso come la cognizione. In questo studio, abbiamo somministrato 3TC a topi soggetti a senescenza accelerata 8 (SAMP8) mediante perfusione gastrica (100 mg/kg) per 4 settimane. I nostri risultati hanno mostrato che 3TC ha migliorato significativamente ilstato di invecchiamento dei topi SAMP8, in particolare il declino delle capacità cognitive valutate dal test del labirinto acquatico di Morris. Per studiare ulteriormente i meccanismi molecolari dimigliorare lo stato di invecchiamentodi topi SAMP8 mediante 3TC, qPCR e metodi di colorazione dei tessuti sono stati utilizzati per studiare i tessuti cerebrali (cioè ippocampo e corteccia) dei topi, mentre l'analisi farmacologica di rete è stata applicata per studiare i potenziali bersagli di 3TC. I risultati hanno mostrato che i livelli di mRNA dei geni correlati all'elemento intercalato a lungo -1, alla risposta all'interferone di tipo 1, al fenotipo di secrezione associato alla senescenza eIl morbo di Alzheimernell'ippocampo e nella corteccia dei topi SAMP8 sono aumentati a causa disenescenza, ma questa tendenza è stata parzialmente invertita da 3TC. I risultati degli studi istologici hanno mostrato che il 3TC ha ridotto la morte dei neuroni dell'ippocampo, mentre i risultati dell'analisi farmacologica di rete hanno indicato che il 3TC può esercitare la sua influenza attraverso molteplici percorsi, tra cui la segnalazione degli estrogeni e le vie di segnalazione dell'interazione PI3K/Akt e ligando-recettore neuroattivo, che abbiamo verificato attraverso esperimenti in vitro. Questi risultati forniscono prove del potenziale terapeutico del 3TC nel trattamento delle malattie neurodegenerative.

PAROLE CHIAVEinvecchiamento, capacità cognitiva, lamivudina, llungo elemento inframmezzato-1, malattie neurodegenerative

Effetto cistanche di erbe cinesi suInibitori della trascrittasi inversa sull'anti-invecchiamento

1|INTRODUZIONE

Ad oggi, l'invecchiamento e le malattie neurodegenerative, comeMalattie di Alzheimer (AD) o di Parkinsonlegati all'invecchiamento, sono in continuo aumento a causa dei cambiamenti demografici globali.1,2 il declino cognitivo rappresenta un serio ostacolo al raggiungimento di una vita lunga e sana. Per decenni, ci sono stati sforzi considerevoli dedicati alla ricerca di farmaci che possano essere usati per trattare la degenerazione cognitiva con l'invecchiamento. bersaglio per lo studio della senescenza.4 La L1 appartiene alla famiglia più abbondante di retrotrasposoni a ripetizione terminale non lunga con ~500,000 copie, che comprende circa il 17% del genoma umano. Il gene L1 comprende un operone con due frame di lettura aperti (ORF1 e ORF2), entrambi necessari per la retrotrasposizione.5-7 L'ORF1 codifica una proteina (ORF1p) con attività di trascrittasi inversa che può essere inibita da analoghi nucleosidici, come lamivudina (2'-3'-deossi-3'-tiocitidina, 3TC).8

L1 attivo può sintetizzare il cDNA al di fuori della cromatina e quindi reinserirlo nel genoma catalizzato da ORF1p, alterando infine l'espressione di altri geni e causando malattie associate all'instabilità genomica.9,10 L'ospite generalmente inibisce l'attività trasponibile di L1 attraverso una serie delle regolazioni, come la modificazione epigenetica e la regolazione del fattore limitante dell'ospite.11,12 La trasposizione di L1 si verifica generalmente solo nelle cellule germinali o tumorali, mentre studi recenti hanno dimostrato che L1 è anche molto attivo nel sistema nervoso centrale o nelle cellule che invecchiano, sebbene i meccanismi neurali sottostanti di L1 non sono chiari.13 Gli studi hanno dimostrato che i fattori (ad es. TREX1, RB1 e FOXA1) correlati al meccanismo di monitoraggio di L1 sono disfunzionali nella senescenza cellulare, determinando l'attivazione di L1. TREX1 è un'asi dell'esonucolo 3' che degrada i DNA invasori estranei e la sua perdita è stata associata all'accumulo di cDNA L1 citoplasmatico.14 È stato dimostrato che RB1 si lega a elementi ripetitivi, inclusi gli elementi L1, e ne promuove l'eterocromatinizzazione.15 E FOXA1 è up-regolato nelle cellule senescenti13 e legato alla regione centrale dell'UTR L1 5'. La L1 attivata attiva ulteriormente la risposta dell'interferone di tipo I (IFN-I), che induce l'infiammazione attraverso il cDNA trascrizionale inverso e mantiene il fenotipo di secrezione associato alla senescenza (SASP). Pertanto, come fattore importante nell'infiammazione asettica causata dall'invecchiamento, L1 è considerato un obiettivo importante per il trattamento delle malattie legate all'invecchiamento. Nei topi anziani trattati con 3TC, l'accumulo di fattori infiammatori viene migliorato inibendo la trascrizione extracellulare di L1 nei tessuti muscolari e in altri tessuti.16 Ad oggi, gli studi sugli effetti degli inibitori della trascrittasi inversa sulle funzioni del sistema nervoso sono scarsi. Recentemente, migliaia di varianti del cDNA genomico (gencDNA) sono state trovate nel cervello di pazienti deceduti con AD, risultanti dal reinserimento di varianti di splicing dell'RNA caratteristiche nel genoma.17 Questo fenomeno è considerato una causa importante dell'AD. I fattori che causano la generazione di gencDNA includono la trascrizione, la distruzione del DNA, la trascrittasi inversa e l'invecchiamento.

Gli studi hanno dimostrato che il processo di formazione del gencDNA è bloccato utilizzando gli inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa nelle linee cellulari di ovaio di criceto cinese (CHO) con attività endogene della trascrittasi inversa.19 Inoltre, i pazienti affetti da AIDS di età superiore ai 65 anni che hanno assunto inibitori della trascrittasi inversa per lungo tempo raramente ha sviluppato l'AD.20 Pertanto, ipotizziamo che il 3TC, in quanto inibitore della trascrittasi inversa, possa essere un potenziale farmaco per il trattamento del deterioramento cognitivo e delle malattie neurodegenerative causate dall'invecchiamento. È stato dimostrato che i topi 8 soggetti ad accelerazione della senescenza (SAMP8), come modello per lo studio dell'invecchiamento umano e delle malattie legate all'età, mostrano molte caratteristiche che si verificano nelle prime fasi delle malattie neurodegenerative, come l'aumento dello stress ossidativo, la neuroinfiammazione e la declino.21 In questo studio, quindi, i topi SAMP8 sono stati selezionati come modello animale ideale per le malattie neurodegenerative causate dall'invecchiamento. Ci siamo concentrati sugli effetti cognitivi del 3TC sui topi che invecchiano prematuramente e sui percorsi molecolari associati all'invecchiamento, fornendo prove del ruolo degli inibitori della trascrittasi inversa nel trattamento delle malattie neurodegenerative dovute all'invecchiamento. Abbiamo inoltre applicato il metodo della farmacologia di rete per prevedere gli obiettivi di 3TC, costruire reti e analizzare le funzioni biologiche e i percorsi correlati a 3TC.

2|SEZIONE SPERIMENTALE 2.1 |

Animali Il SAMP8 maschio di 44-settimane e i topi R1 (SAMR1) con senescenza accelerata normale forniti dalla Tianjin University of Traditional Chinese Medicine sono stati utilizzati dopo un periodo di acclimatazione di 1-settimane. Il protocollo sperimentale sugli animali è stato approvato dal Comitato etico animale dell'ospedale provinciale di Shandong ed è stato eseguito sulla base della Guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I topi sono stati tenuti in gabbie autoclavate e hanno ricevuto cibo e acqua sterili. I pesi corporei dei topi sono stati registrati ogni giorno. Un diagramma di flusso degli esperimenti condotti in questo studio è riportato nella Figura 1A. Al termine degli esperimenti, i topi sono stati sottoposti a eutanasia mediante inalazione di etere dietilico.

2.2|Preparazione e trattamento di 3TC

I farmaci venivano preparati al momento il giorno di ogni esperimento. Il 3TC acquistato da MCE (Shanghai, Cina) è stato sciolto in DMSO ad una concentrazione finale di 2 mmol/L. La soluzione madre è stata quindi diluita alla concentrazione di lavoro utilizzando acqua potabile con la concentrazione finale di DMSO inferiore al 0,1 percento. Sono stati istituiti tre gruppi di topi: un gruppo di controllo trattato con soluzione di veicolo (acqua potabile), un gruppo di test trattato con 3TC e il gruppo SAMR1 che ha ricevuto il veicolo utilizzato come altro gruppo di controllo per l'invecchiamento. Il gruppo di test ha ricevuto per via orale 3TC alla dose di 100 mg/kg al giorno. Tutti i topi sono stati alimentati mediante somministrazione intragastrica per 4 settimane (Figura 1B).

FIGURA 1 Disegno sperimentale ed effetti del 3TC sul miglioramento della perdita di peso relativa dovuta all'invecchiamento e ai punteggi di classificazione della senescenza. (A) Diagramma di flusso degli esperimenti farmacologici per studiare l'effetto di 3TC sull'abilità cognitiva dei topi SAMP8. (B) Presentazione schematica del programma degli esperimenti sugli animali. (C) Il flusso di lavoro concettuale per prevedere le interazioni farmaco-bersaglio utilizzando Pharmmapper che mostra, da sinistra a destra, la struttura molecolare di 3TC, il diagramma strutturale 3D di 3TC e il modello farmacoforico previsto con il legame 3TC al recettore degli estrogeni con il più alto normalizzato punteggi adatti. (D) Il modello di crescita del peso corporeo in ciascun gruppo di topi. (E) Cambiamenti nei punteggi di valutazione prima e dopo il trattamento di 3TC. SAMR1 plus Veicolo: 44-topi SAMR1 di una settimana trattati con veicolo per 4 settimane. SAMP8 plus Veicolo: 44-topi SAMP8 di una settimana trattati con veicolo per 4 settimane. SAMP8 più 3TC: 44-topi SAMP8 di una settimana trattati con 3TC per 4 settimane. Test t di Student: *p < 0.05, **p < 0.01 e ***p < 0,001. ns: nessuna significatività statistica. Gli asterischi neri rappresentano un confronto con il gruppo di veicoli SAMR1 plus. Gli asterischi rossi rappresentano un confronto con il gruppo di veicoli SAMP8 plus. La linea blu segna il gruppo SAMP8 plus 3TC all'età di 44 e 48 settimane.

2.3|Sistema di valutazione del punteggio

Il grado di senescenza nei topi è stato valutato utilizzando un sistema di punteggio di classificazione descritto in precedenza.22 Ciascuna categoria di punteggi contiene cinque livelli, che vanno da 0 a 4 con il punteggio più alto del grado che indica il grado più alto di senescenza dell'animale . I punteggi per ciascuna categoria sono stati valutati separatamente da quattro sperimentatori esperti che erano accecati dalle condizioni di trattamento (Tabella Supplementare S1).

.2.4|Prova del labirinto acquatico di Morris

Gli studi sul labirinto acquatico di Morris sono stati eseguiti secondo il protocollo di Morris, compreso un esperimento di navigazione orientativa e prove con sonda.23 Il labirinto acquatico era una piscina circolare (120 cm di diametro dotata di una piattaforma di ± 1 grado. I topi sono stati addestrati a trovare la piattaforma sotto la superficie dell'acqua entro un minuto. Se il mouse non ha trovato la piattaforma entro 60 s, è stato guidato alla piattaforma e gli è stato permesso di rimanervi per 20 s. Ciascuno dei topi è stato addestrato cinque volte al giorno con ciascuno separato l'uno dall'altro di 15 minuti. In ogni prova, la posizione di partenza era diversa, in ordine pseudocasuale. Il sesto giorno del test, la piattaforma è stata rimossa e l'animale è entrato nel labirinto acquatico da un punto opposto al quadrante del labirinto dove si trovava la piattaforma durante l'addestramento e gli è stato permesso di esplorare il labirinto per 60 s. Il percorso di nuoto e la quantità di tempo che i topi hanno trascorso alla ricerca del labirinto sono stati registrati dalla videocamera e analizzati utilizzando EthoVision XT (Noldus Software). Ogni gruppo era composto da un minimo di otto animali.

2.5|Estrazione dell'RNA e PCR quantitativa

L'RNA totale è stato estratto dai tessuti ippocampali e corticali dei topi dopo i trattamenti con TRIzol Reagent (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore. Ciascun campione di RNA (1 ug) è stato trascritto in modo inverso per generare cDNA utilizzando il kit di trascrizione inversa del cDNA (Takara) e quindi amplificato mediante PCR utilizzando il kit TaKaRa Taq (Takara). I set di primer sono descritti nella Tabella supplementare S2.

2.6|Preparazione dei tessuti

Gli animali sono stati anestetizzati con etere dietilico e i loro cervelli sono stati raccolti dopo perfusione transcardiaca con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e una soluzione di paraformaldeide al 4%. I tessuti cerebrali sono stati rimossi e fissati in paraformaldeide per oltre 2 giorni. I cervelli fissi sono stati incorporati in paraffina con il tessuto ippocampale sezionato con uno spessore di 5 μm.

2.7|Colorazione con ematossilina ed eosina (H & E).

La morfologia del cervello è stata analizzata utilizzando metodi di colorazione con ematossilina ed eosina (H & E). Le sezioni in paraffina dei tessuti dell'ippocampo sono state decerate e disidratate con un gradiente di alcol di una serie di concentrazioni. La colorazione HE è stata eseguita utilizzando un kit di colorazione H & E (Solarbio) secondo le istruzioni del produttore. Dopo essere state immerse in etanolo e xilene, le sezioni sono state montate con resina e osservate al microscopio ottico (Olympus).

2.8|Colorazione di Nissl

Il metodo di colorazione Nissl (Biyuntian) è stato utilizzato per rilevare la lesione neuronale sulle sezioni dei tessuti dell'ippocampo. Le sezioni sono state incubate con colorazione Nissl per 30 minuti e lavate con etanolo al 95%. Le cellule colorate sono state contate e fotografate al microscopio ottico (Olympus). Le cellule sono state contate su tre campi non sovrapposti selezionati casualmente in ciascuna diapositiva del tessuto ippocampale con l'indice di sopravvivenza definito come il numero di neuroni sopravvissuti/numero totale di neuroni.

2.9|Colorazione TUNEL

Sezioni di tessuti ippocampali sono state incubate con soluzione di proteinasi K per 15 minuti seguita da incubazione con miscela di reazione TUNEL (Beyotime). Dopo aver lavato tre volte con PBS, le sezioni sono state montate con una soluzione di montaggio contenente il colorante nucleare DAPI e osservate utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale o un microscopio a fluorescenza laser confocale.

2.10|Costruzione del database target di 3TC

Il database di destinazione di 3TC è stato costruito sulla base di due database. Innanzitutto, i potenziali bersagli di 3TC sono stati identificati utilizzando la mappa genica farmacodinamica inversa basata sul database Pharmmapper (//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Tutti i componenti chimici sono stati convertiti nel formato '.mol2' da Chembiodraw e caricati nel database Pharmmapper (Figura 1C). Le molecole con un punteggio di adattamento normalizzato maggiore di 4.0 sono state identificate come potenziali bersagli di 3TC. In secondo luogo, il database ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL141/) è stato utilizzato per interrogare le attività biologiche di bersagli o composti. Le proteine ​​verificate come derivate da Homo sapiens sono state identificate come potenziali bersagli di 3TC.

2.11|Analisi dell'interazione della proteina bersaglio e costruzione della rete

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 sono stati selezionati nell'impostazione progettata dopo aver eliminato i duplicati.

Per studiare in modo completo i meccanismi molecolari di 3TC, le reti PPI sono state costruite utilizzando il software Cytoscape versione 3.6.0.(http://www.cytoscape.org/). L'analisi del grado dei nodi è stata eseguita con Centiscape 2.2 (//apps.cytoscape.org/apps/centiscape) per schermare i geni hub nelle reti con il valore di centralità di vicinanza, il valore di centralità di interezza e il valore di centralità di grado impostato su {{6 }}.2, 450 e 50, rispettivamente.

2.12|Arricchimento e schermatura dei percorsi di segnalazione per 3TC

L'analisi dell'arricchimento di Gene Ontology (GO) con processi biologici, componenti cellulari e funzioni molecolari di potenziali bersagli è stata effettuata per l'annotazione della funzione biologica basata su un database di bioinformatica DAVID (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). Le vie metaboliche KEGG sono state annotate sulla base dei database dell'Enciclopedia dei geni e dei genomi di Kyoto (KEGG) utilizzando il server di annotazione automatica KEGG online (http://www.genome.jp/kegg/)

2.13|Associazione di 3TC a obiettivi previsti

I file di struttura SDF del composto 3TC sono stati ottenuti dal sito web di Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Il file SDF è stato trasformato in un file PDB dal software OpenBabel2.3.2 e le proteine ​​del recettore ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) e EGFR (PDBID:6S9C) sono state ottenute dal database Protein Data Bank (www.wwpdb .org). Il software PYMOL2.3.4 è stato utilizzato per rimuovere acqua e ligandi dalle proteine ​​del recettore. Lo studio di docking è stato eseguito utilizzando AutoDock Vina (1.1.2), un software di docking molecolare open source sviluppato da Scripps. Il software Tools è stato utilizzato per modificare le quattro proteine ​​del recettore e il comando Grid Box nel programma Grid è stato utilizzato per aprire lo strumento Grid Option per analizzare ciascuna proteina del recettore. La spaziatura del reticolo è stata impostata su 1 e il centro della tasca è stato impostato come centro del sito di rilegatura.

2.14|Coltura cellulare e trattamento

Le linee cellulari neuronali dell'ippocampo di topo HT22 sono state acquistate dalla Shanghai Cell Biotechnology Company. Le cellule HT22 sono state coltivate in DMEM integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS). Le cellule sono state seminate in 6-pozzetti 1 giorno prima dei trattamenti sperimentali. La senescenza delle cellule è stata indotta dalla formaldeide (FA), acquistata da Sigma-Aldrich, come precedentemente descritto.24 Le cellule HT22 sono state divise in tre gruppi, incluso il gruppo FA trattato con 30 µmol/L FA per 24 h, il gruppo FA/3TC gruppo trattato sia con 30 µmol/L di FA che con 50 µmol/L di 3TC e il gruppo di controllo coltivato senza FA o 3TC.

2.15|Immunofluorescenza e microscopia

Il mezzo è stato rimosso e le cellule sono state fissate utilizzando una soluzione di paraformaldeide al 2% per 1 ora a temperatura ambiente. L'esperimento di immunofluorescenza è stato condotto come descritto in precedenza.25 Gli anticorpi utilizzati in questo studio includevano l'anticorpo anti LINE-1 ORF1p (1:1000; Sigma-Aldrich) con l'anticorpo secondario Alexa Fluor 594 (1:1000; Invitrogen) . Le cellule sono state incubate con DAPI (diluizione 1:500; Thermo Fisher Scientific) per 1 minuto per etichettare i nuclei. Dopo l'aggiunta dell'agente di montaggio tempra anti-fluorescenza, le cellule sono state osservate utilizzando un microscopio confocale (Nikon). 2.16|Analisi Western blot

Le espressioni di EGFR, p-AKT1 (Active Akt1: fosforilato a S473) e ADRB2 sono state misurate mediante analisi Western blot. Le proteine ​​totali sono state raccolte dalle cellule dopo vari trattamenti. Il Western blot è stato eseguito come descritto in precedenza.26 Gli anticorpi utilizzati in questo studio includevano un anticorpo anti-EGFR (1:500; Sigma-Aldrich), un anticorpo anti-pAKT1 (1:1000; Sigma-Aldrich) e un anticorpo anti-ADRB2 (1:200; Sigma-Aldrich) con anticorpo secondario anti-coniglio (1:1.000; Invitrogen). Dopo il lavaggio, le macchie sono state sviluppate con il sistema di rilevamento Western blotting ECL (Amersham, Aylesbury, Regno Unito).

2.17|Analisi dei dati e statistiche

Ogni esperimento è stato ripetuto almeno tre volte e considerato valido con le prove che hanno mostrato risultati simili. I risultati sono stati presentati come media ± deviazione standard (SD). La differenza significativa è stata determinata dal test t di Student con p < 0.05.

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