Agenti emettitori di luce per la valutazione non invasiva della funzione renale Parte I

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Jiaguo Huang, et al

Parole chiave: fluorescenza · velocità di filtrazione glomerulare ·malattie renali ·funzione renale· nanoparticelle

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La valutazione non invasiva difunzione renalee la diagnosi di malattie renali sono state a lungo difficili. I metodi tradizionali non sono di routine disponibili, perché i protocolli esistenti sono ingombranti, dispendiosi in termini di tempo e invasivi. Negli ultimi anni, significativi progressi nell'area della diagnosifunzionalità renalee la malattia sulla base di agenti emettitori di luce è stata prodotta. Qui, esaminiamo brevemente gli agenti emettitori di luce, inclusi agenti fluorescenti organici e nanoparticelle luminescenti inorganiche renali cancellabili per il monitoraggio non invasivo e in tempo reale difunzione renalee malattia. Inoltre, vengono discussi alcuni requisiti e strategie significativi riguardanti la progettazione di agenti di velocità di filtrazione glomerulare ideali e nanoparticelle renali chiaribili. Infine, discutiamo le sfide future nell'accelerare la traduzione clinica di questi agenti emettitori di luce sviluppati, insieme a considerazioni sugli sforzi che devono essere fatti per sviluppare nuovi agenti e diagnosticare malattie renali.

1. Introduzione

Il rene riceve un abbondante flusso sanguigno pari al 25% della gittata cardiaca ed elimina xenobiotici e prodotti metabolici dal sangue nelle urine.[1] Durante la formazione dell'urina sono coinvolti tre processi renali, tra cui filtrazione glomerulare, riassorbimento tubulare e secrezione tubulare (Figura 1a).[2] La filtrazione glomerulare è essenziale per il rene per rimuovere rapidamente i prodotti di scarto e le tossine dal plasma.[3]I tubuli renali sono responsabili del riassorbimento e della secrezione di sostanze per regolare il pH plasmatico, le concentrazioni di potassio e altri ambienti fisiologici.[4] Il danno renale nella funzione glomerulare e tubulare influisce sulla capacità del rene di rimuovere xenobiotici e prodotti metabolici dal sangue nelle urine.[5] Pertanto, la valutazione difunzione renaleè fondamentale per diverse situazioni cliniche.

Malattia renale o la perdita direnefunzioneè spesso difficile da diagnosticare in una fase iniziale, ma può causare insufficienza renale letale in seguito. Da notare, la differenziazione degli stadi della disfunzione renale è stata una sfida a lungo termine. Pertanto, le tecniche precliniche che possono prontamente mettere in scena la disfunzione renale sono essenziali per comprendere la progressione della malattia renale. Inoltre, l'insufficienza renale acuta (ARF) ha numerose cause come ipotensione, sepsi, traumi, necrosi tubulare acuta, nefrotossicità farmaco-indotta e ostruzione urinaria.[6] Identificare i colpevoli della malattia nell'ARF è difficile e spesso si basa sulla biopsia renale. Tuttavia, questo metodo è invasivo e presenta potenziali rischi.[6] L'imaging a fluorescenza in vivo è un metodo preclinico poco costoso, altamente sensibile e ampiamente utilizzato che viene utilizzato per studiare varie malattie. Sviluppi significativi nell'area della diagnosirenefunzionee malattie sulla base di agenti emettitori di luce e imaging a fluorescenza sono state realizzate negli ultimi dieci anni. Lo scopo di questa rassegna è descrivere: uno, agenti tradizionali e metodi di determinazione per la valutazione direne funzione; due, l'utilizzo di agenti fluorescenti organici per la valutazione non invasiva in tempo reale della funzione renale; tre, nanomateriali inorganici in combinazione con tecnologie di imaging per identificare vari tipi di nefropatie e per differenziare gli stadi della disfunzione renale. L'enfasi principale è posta sulla progettazione e applicazione di agenti emettitori di luce, inclusi agenti fluorescenti organici e nanomateriali inorganici come mezzo per monitorare la funzione e la malattia renale.

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2. Agenti tradizionali e metodi di determinazione per la valutazione della funzione renale

Lo stato funzionale dei reni può essere valutato utilizzando la velocità di filtrazione glomerulare (GFR), il flusso sanguigno renale e il riassorbimento tubulare o la secrezione di varie sostanze.[7] Tra questi, il GFR è spesso utilizzato per valutare la funzionalità renale complessiva ed è accettato come il miglior indicatore perrenefunzione.[8] Il GFR rappresenta il volume plasmatico liberato dai nefroni per unità di tempo durante la formazione dell'urina. È generalmente presentato in millilitri al minuto.[3] Tuttavia, il GFR non può essere misurato direttamente. Il metodo più comune si basa sul concetto di liquidazione.[4] La concentrazione di creatinina endogena nel plasma è comunemente usata per determinare il GFR (Figura 1b), ma può risultare in stime errate dovute all'età, al sesso, alla massa muscolare e a molte altre variabili antropometriche.[9] La determinazione della clearance plasmatica/urinaria di agenti renali esogeni come 99mTc-DTPA (acido dietilentriamminopentaacetico, DTPA), inulina e iotalamato (Figura 1c) è invasiva e ingombrante a causa della necessità di fasi di campionamento multiple di sangue/urina e di noiose analisi del campione mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC).[8] Inoltre, molti studi hanno rivelato che la creatinina e lo iotalamato sono secreti dalle cellule dei tubuli prossimali, mentre la cistatina C e il 99mTc-DTPA sono riassorbiti dalle cellule epiteliali tubulari, il che porta a una distorsione del GFR.[5] La clearance urinaria è il metodo tradizionale per determinare il GFR. Tuttavia, le raccolte urinarie a tempo sono lunghe, ingombranti e suscettibili di errore. Un lungo periodo di raccolta delle urine nell'arco delle 24 ore per determinare la clearance della creatinina non è più raccomandato di routine come mezzo di valutazionerenefunzione.[5] In alternativa, la clearance plasmatica viene utilizzata per determinare il GFR per evitare disagi e per evitare errori nelle raccolte di urina cronometrate. Tuttavia, il principale limite della clearance plasmatica è la necessità di prelievi ematici ripetuti e invasivi.[4] Pertanto, sono fortemente desiderati nuovi agenti GFR e metodi di determinazione per migliorare la determinazione direnefunzione.

Figura 1. a) Tre processi coinvolti nella formazione dell'urina, inclusa la filtrazione glomerulare, il riassorbimento tubulare e la secrezione tubulare. b) Strutture dei marker endogeni della funzione renale. c) Strutture dei marker esogeni della funzione renale.[8] Ristampato con il permesso del rif. [8]. Copyright (2016) Società chimica americana.

3. Agenti organici fluorescenti per la valutazione non invasiva della funzione renale

La valutazione in tempo reale e non invasiva del GFR è essenziale non solo per monitorare i pazienti malati al letto del paziente nelle cliniche, ma anche per diagnosticare e stadiare i pazienti con malattia renale cronica.[10] L'imaging in vivo non invasivo, inclusa la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT), la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (TC) sono ampiamente utilizzate per la valutazionerenefunzionemediante il monitoraggio in tempo reale della cinetica di eliminazione renale degli agenti eliminabili dai reni.[11-13] Tuttavia, queste tecniche possono dare luogo a stime errate, poiché vengono utilizzati agenti GFR tradizionali e si sospetta il loro riassorbimento o secrezione nei tubuli prossimali. Quel che è peggio, la diagnosi delle malattie renali non è stata notevolmente migliorata con l'uso di queste tecniche, a causa dei loro costi elevati, della bassa accessibilità e del potenziale rischio di esposizione alle radiazioni.[12] Pertanto, nuove tecniche non invasive sono altamente necessarie per la valutazionerenefunzione. A tal fine, lo sviluppo di agenti fluorescenti e metodi di rilevamento ha fornito nuove strategie. Tuttavia, finora è stato sviluppato solo un numero limitato di agenti fluorescenti per la valutazionerenefunzione(Tabella 1).

3.1. Agenti fluorescenti a base di pirazina per la valutazione della funzione renale

Sforzi considerevoli sono stati compiuti da Dorshow et al., che si sono concentrati sullo sviluppo di agenti GFR esogeni per la valutazione in tempo reale della funzione renale utilizzando metodi non radioattivi.[10,14] Due approcci generali per la progettazione di agenti renali fluorescenti sono stati considerati. Il primo approccio prevede l'aumento della fluorescenza di agenti renali noti o esistenti che sono emettitori intrinsecamente poveri come i complessi lantanidi-metallo; ad esempio, una serie di complessi Eu3 plus e In3 plus di ligandi DTPA-monoammide recanti "antenne" molecolari per migliorare la fluorescenza del metallo attraverso il processo di trasferimento dell'energia di risonanza anintramolecolare ligando-fluorescenza del metallo è stata preparata e valutata mediante potenziamento della fluorescenza e biodistribuzione. I composti 18a e 18b (Figura 2a) mostrano il più alto potenziamento fluorescente in quei complessi metallici di tipo DTPA. Le proprietà di clearance renale possono essere valutate utilizzando i corrispondenti complessi radioattivi 111In. Per valutare se questi complessi sono riassorbiti o secreti dalle proteine ​​​​del trasportatore di anioni organici (OAT) nei tubuli renali, viene somministrato probenecid, un inibitore delle proteine ​​​​OAT (30 minuti prima) per bloccare sia il riassorbimento tubulare che le vie di secrezione. Tuttavia, i risultati suggeriscono che questi complessi vengono escreti non solo per filtrazione glomerulare ma anche per secrezione nei tubuli prossimali.[10].

L'altro approccio si basa sulla trasformazione di coloranti lipofili fluorescenti in sostanze idrofile e anioniche per costringerli ad essere eliminati dai reni. Pertanto, la spina dorsale pirazina-acido dicarbossilico (Figura 2a, composto 1a) è lipofila e insolubile in acqua e può essere utilizzata come fluoroforo e può essere modificata nelle posizioni 2,5- con gruppi di ritiro degli elettroni e alle 3,{6}}posizioni con gruppi donatori di elettroni per migliorarne le proprietà della lunghezza d'onda.[14] Con questo concetto, vari sostituenti neutri e anionici sono stati progettati e sintetizzati condensando lo scaffold della pirazina con derivati ​​dell'amminoetanolo, dell'amminopropandiolo e degli amminoacidi. Questi derivati ​​della pirazina possono essere suddivisi in due categorie generali: una, derivati ​​della pirazina recanti gruppi amminici primari con la lunghezza d'onda nell'intervallo del blu dello spettro (Figura 2 b, composti 2 a–e); due pirazine N-alchilate recanti gruppi donatori di elettroni con la lunghezza d'onda nella regione verde dello spettro (Figura 2 b, composti 2 f – j). Studi in vitro e in vivo mostrano che i marcatori della pirazina2 d, 2 h e 2j hanno un basso legame con le proteine ​​plasmatiche (PPB<7%), plasma="" clearance="" half-lives="" ranging="" from="" 20="" to="" 30="" min,="" high="" urine="" recovery,="" and="" are="" excreted="" by="" the="" kidneys.="" more="" importantly,="" renal="" tubular="" secretion="" is="" not="" a="" significant="" elimination="" pathway="" for="" these="" three="" compounds,="" which="" is="" testified="" by="" treating="" with="" probenecid="" to="" block="" the="" oat="" pathway.="">

Figura 2. a) Strutture e lunghezze d'onda ottiche di complessi DTPA-monoammidici e acido pirazina-dicarbossilico nonché potenziali derivati.[10] b) Strutture e lunghezze d'onda ottiche di agenti fluorescenti a base di pirazina.[14] c) Strutture e lunghezze d'onda ottiche dei coniugati PEG-pirazina.[15]

Sono stati inoltre condotti studi approfonditi per sviluppare una nuova classe di derivati ​​della pirazina basati sulla frazione poli(etilenglicole) (PEG).[15] Il PEG è un polimero idrofilo, non tossico e biocompatibile costituito da unità ripetute di ossido di etilene. È stato approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) nel 1990 per la somministrazione parenterale o topica come componente di vari cosmetici, alimenti e sistemi di somministrazione di farmaci.[16] In particolare, il PEG viene eliminato attraverso i reni senza accumulo nel corpo, mentre il tasso di clearance dipende dal peso molecolare. È stato riportato che la PEGilazione può influenzare significativamente la via di escrezione e il tasso di clearance. Ad esempio, l'emivita di clearance aumenta da 18 min a 1 giorno se il peso molecolare del PEG aumenta da 6 a 190 kDa, ed è stato dimostrato che le catene di PEG con pesi molecolari inferiori a 6 kDa sono filtrate dal glomerulo e non riassorbite da tubuli prossimali del rene.[16] Queste considerazioni hanno portato allo studio di una serie di coniugati di pirazina PEGilati. Per uno studio sistematico dell'effetto della lunghezza del PEG, catene PEG con lunghezze ent diverse sono state coniugate alla spina dorsale pirazina, mentre il peso molecolare totale del PEG per la modifica è stato limitato a meno di 5 kDa per la filtrazione libera. Questi coniugati possono anche essere suddivisi in due categorie: uno, derivati ​​della pirazina recanti gruppi amminici primari con la lunghezza d'onda nella regione blu dello spettro; due, N-alchilatepirazine con la lunghezza d'onda nella regione verde dello spettro. Allo stesso modo, sono stati eseguiti saggi sia in vitro che in vivo che includono proprietà di fluorescenza, PPB, recupero urinario della dose iniettata, studi di blocco del probenecid e cinetica di clearance plasmatica. I composti della pirazina PEGilata 4 d e 5 c hanno valori di PPB molto bassi (rispettivamente 5 e 3 percento), alti valori di recupero urinario (rispettivamente 96 e 97 percento) ed emivite di clearance plasmatica brevi (rispettivamente 25 e 19 min) topi. Questi due composti presentano proprietà superiori a quelle dello iotalamato, che è uno standard accettato per la misurazione del GFR.[15] Negli studi preclinici, è stata eseguita una serie di studi di sicurezza/tossicità in vitro e in vivo con l'agente fluorescente 2 d (Figura 2 b), tra cui compatibilità ematica, test di mutazione, test di aberrazione cromosomica e diversi studi di tossicità a dose singola su ratti e cani per determinare tossicità generale e tossicocinetica.[17] Dopo aver somministrato dosi elevate fino a 200-300 volte la dose umana stimata, tutti gli animali sono sopravvissuti al sacrificio programmato. Non si riscontrano effetti sul peso corporeo, sul consumo di cibo e sulle osservazioni oftalmiche e nessuna patologia anatomica anormale viene osservata dalla valutazione macroscopica o microscopica di qualsiasi organo o tessuto. I risultati di questi studi tossicologici iniziali suggeriscono che i profili di sicurezza/tossicità del composto 2 d dovrebbero essere sufficienti per iniziare un primo studio clinico sull'uomo. -studi umani.[17]

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Infatti, per semplificare il metodo di determinazione del prelievo di sangue, Dorshow et al. hanno sviluppato un apparato di monitoraggio ottico per l'ottica non invasivarenefunzionestudi.[18]Il principio in breve è che un lobo dell'orecchio è incollato piatto su un vetrino posizionato a circa 2 mm sotto un fascio di fibre ottiche che registra il segnale di fluorescenza da un agente fluorescente di prova che passa attraverso l'orecchio. Una sorgente laser a stato solido da l=445 nm viene diretta attraverso un chopper e in una gamba di un fascio di fibre ottiche biforcato in silice. Dopo un breve periodo di registrazione della linea di base, un agente fluorescente viene iniettato per via endovenosa nel ratto e il segnale di fluorescenza corrispondente alla distribuzione del plasma e dei tessuti e alla successiva clearance renale dell'agente fluorescente viene determinato nell'orecchio. Sebbene la clearance renale di un agente fluorescente possa essere rilevata con questo metodo ottico non invasivo, l'anestesia è necessaria durante l'intera misurazione e può causare una diminuzione del GFR.[18]

3.2. FITC–Inulina/Sinistrina per la valutazione non invasiva direneFunzione

L'inulina, un polimero inerte e privo di carica del fruttosio con un peso molecolare di circa 5000 Da soddisfa tutti i criteri di un agente esogeno ed è considerato l'agente GFR standard. Il GFR può essere determinato iniettando inulina per via endovenosa. Dato che l'inulina non viene riassorbita né secreta dai tubuli renali dopo la filtrazione glomerulare, la sua velocità di escrezione è direttamente proporzionale alla velocità di filtrazione dell'acqua e dei soluti attraverso il filtro glomerulare.[4] L'inulina è stata etichettata con successo nella sua variante coniugata con isotiocianato di fluoresceina (FITC-inulina, Figura 3a).[19] La sua cinetica di eliminazione si ottiene generalmente misurando i valori di fluorescenza nel plasma in un periodo di tempo specifico dopo l'iniezione in bolo.[20] Sebbene da questo test si ottengano generalmente risultati altamente riproducibili e il campionamento delle urine non sia richiesto, il prelievo di sangue ripetuto è stressante per gli animali. Inoltre, la soluzione di FITC-inulina deve essere riscaldata per migliorarne la solubilità e dializzata per rimuovere la FITC residua non legata, il che rende la procedura ingombrante.[20]

Per superare la scarsa solubilità in acqua di FITC-inulina, FITC-sinistrina è stata sviluppata mediante una reazione di etichettatura chimica in un solo passaggio (Figura 3a).[21] La sinistrina, un analogo dell'inulina, è stata introdotta nel 1963 come alternativa all'insulina per determinare la funzione renale grazie alla sua migliore solubilità in acqua.[22] La migliore solubilità in acqua della sinistrina è attribuita alla sua struttura chimica ramificata piuttosto che alla struttura lineare dell'inulina. D'altra parte, abbiamo sviluppato una tecnica transcutanea non invasiva per determinare la cinetica di eliminazione dell'agente fluorescente FITC-sinistrina sulla base di un dispositivo elettronico miniaturizzato attaccato alla pelle.[23] Il dispositivo transcutaneo intelligente comprende diodi emettitori di luce che eccitano un agente fluorescente e un fotodiodo che rileva il segnale di emissione dell'agente fluorescente iniettato.[23–25] Il flusso di lavoro della valutazione transcutanea direnefunzionecontiene tre passaggi principali:

1) Una soluzione di agente fluorescente viene iniettata in un animale per via endovenosa e l'agente viene diffuso dallo spazio vascolare nell'interstizio, dove viene escreto dai reni.

2) Il dispositivo è attaccato alla pelle di un animale prima dell'iniezione dell'agente fluorescente in modo da poter registrare una linea di base per un breve periodo di tempo. Il dispositivo consente all'agente fluorescente di essere eccitato ripetutamente all'interno dello spazio interstiziale lampeggiando ogni secondo alla lunghezza d'onda appropriata. Dopo ogni lampeggio, l'emissione di fluorescenza dell'agente fluorescente viene rilevata e convertita in un segnale digitale. Questi dati digitali sono archiviati in una memoria interna all'interno del dispositivo.

3) L'emivita di escrezione dell'agente fluorescente può essere calcolata dopo il trasferimento e l'elaborazione dei dati.[25]

Analogamente alla cinetica della clearance plasmatica, i dati raccolti vengono valutati per estrapolare la cinetica di escrezione dell'agente fluorescente.

Ampi studi surenefunzionemediante FITC-sinistrina sono stati condotti in modelli animali preclinici, inclusi vari ceppi di topi coscienti (Balb/c, C57BL/6, SV129 e C57BL/6),[26] ratti ipertesi sensibili al sale Dahl,[27] e grandi specie come cani e gatti.[28] Questo approccio transcutaneo è stato validato in diverse specie animali e fornisce una stima più precisa del GFR a causa di numerosi punti dati dalle misurazioni transcutanee piuttosto che un numero limitato di punti dati da campioni di sangue e urine. Inoltre, poiché le misurazioni vengono effettuate per via transcutanea, questo metodo è indipendente dai parametri antropometrici. Il dispositivo transcutaneo miniaturizzato consente di eseguire misurazioni GFR in animali coscienti senza anestesia, e quindi è possibile evitare una diminuzione della GFR correlata all'anestesia.[4] Tuttavia, sia l'inulina che la sinistrina soffrono dei loro limiti intrinseci, come costi elevati, disponibilità limitata e sofisticata estrazione e purificazione dalle radici delle piante. Pertanto, esiste una sfida insoddisfatta e di lunga data per sviluppare nuovi agenti GFR fluorescenti per la valutazione non invasiva in tempo reale difunzione renale.

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3.3. Derivati ​​della ciclodestrina etichettati in modo fluorescente per la valutazione non invasiva della funzione renale

Un agente fluorescente esogeno ideale per la valutazione transcutanea direnefunzionedovrebbe soddisfare determinati requisiti: uno, lunghezze d'onda di assorbimento e di emissione nella regione del visibile e più preferibilmente nella gamma del vicino infrarosso; due, alta idrofilia e PPB molto basso o assente;[29] tre, caratteristiche neutre o debolmente cariche; quattro, nessuna tossicità e nessun metabolismo in vivo; cinque, nessun riassorbimento e nessuna secrezione nei tubuli e filtrazione completa dal glomerulo nella teurina;[30] sei, facili da produrre con bassi costi.

Il motivo per mantenere un PPB basso è che il legame con le proteine ​​generalmente influenza la farmacocinetica, la farmacodinamica e la biodistribuzione risultanti in vivo. Inoltre, il riassorbimento e la secrezione tubulare possono essere attivi o passivi, a seconda della particolare sostanza e del sistema di trasporto nelle cellule tubulari, ad esempio, proteine ​​del trasportatore di anioni organici (OAT) e proteine ​​del trasportatore di cationi organici (OCT). Pertanto, sono desiderabili caratteristiche deboli e cariche per prevenire interazioni con proteine ​​​​di trasporto organiche. È necessario prendere in considerazione tutte queste caratteristiche per la progettazione razionale di un agente GFR. Tenendo presente questo, abbiamo sviluppato con successo agenti fluorescenti a base di 2-idrossipropilciclodestrina (HPCD) per la misurazione transcutanea direnefunzione.[8] Gli agenti fluorescenti a base di HPCD sono progettati con giudizio combinando il principio di base dei farmaci realmente eliminati e la conoscenza del sistema di somministrazione dei farmaci a base di ciclodestrina (CD). In questo progetto, in primo luogo, l'introduzione di HPCD (inclusi HPaCD, HPbCD e HPgCD) aumenta l'idrofilia, diminuisce il PPB e accelera l'eliminazione degli agenti fluorescenti. La principale via di eliminazione degli HPCD dipende dalla via di somministrazione. Sia nei ratti che nei cani, dopo somministrazione orale, l'HPbCD viene escreto principalmente nelle feci, mentre viene escreto dai reni dopo somministrazione endovenosa. HPbCD è ben tollerato negli studi sugli animali (ad es. ratti, topi, cani e conigli) sia per studi a breve che a lungo termine. Per gli esseri umani, l'escrezione è principalmente dai reni. I CD sono ben tollerati nell'uomo e non hanno effetti avversi sui reni o altri organi in seguito a somministrazione orale o endovenosa.[31] I meriti della loro non tossicità hanno portato all'approvazione della FDA più di dieci anni fa.[32] Il motivo per l'utilizzo degli HPCD piuttosto che dei CD è che gli HPCD non solo hanno una migliore solubilità in acqua rispetto ai loro CD nativi, ma sono anche più stabili all'idrolisi da parte di a-amilasi di origine suina o umana.[33] Inoltre, la loro distribuzione del peso molecolare stretto, il basso costo e la disponibilità sufficiente li rendono la spina dorsale ideale per gli agenti GFR.[34] In secondo luogo, i fluorofori appartenenti alla famiglia degli xanteni vengono impiegati per etichettare gli HPCD (Figura 3 b). Oltre a FITC e fluoresceina, il pannello dei fluorofori xantenici è stato ampliato per includere i fluorofori a base di FITC decarbossilato, denominato XITC, per lo studio sistematico dei diversi legami e siti di coniugazione tra il fluoroforo e gli HPCD. Sulla base di una notevole conoscenza empirica che le sostanze anioniche e neutre vengono eliminate preferenzialmente attraverso il sistema renale,[14] i coloranti a base di rodamina non sono stati selezionati come fluorofori per etichettare gli HPCD a causa della carica positiva degli atomi di azoto della frazione anilina o del gruppo dietilanilina. Le tre categorie risultanti di agenti mostrano diversi legami di coniugazione covalente e cariche molecolari nette e si sospetta che mostrino una diversa farmacocinetica e farmacodinamica. Tutti i FITC-HPCD mostrano un PPB molto basso (<8%), which="" is="" comparable="" to="" or="" even="" lower="" than="" that="" exhibited="" by="" some="" previous="" gfr="" agents,="" for="" example,="" 51cr–="" edta="" (12.2%,="" edta="ethylenediaminetetraacetic" acid)="" and="" 99mtc–dtpa="" (11%).="" the="" extremely="" low="" ppb="" of="" the="" hpcd-based="" agents="" is="" attributed="" to="" conjugation="" of="" the="" hydrophilic="" hpcds="" on="" the="" hydrophobic="" fluorophores,="" which="" increases="" their="" hydrophilicity="" and="" reduces="" nonspecific="" interactions="" with="" serum="" proteins.="" these="" agents="" have="" no="" significant="" cytotoxic="" effect="" in="" representative="" human="" renal="" cell="" lines="" by="" using="" the="" 3-(4,5-dimethyl2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium="" bromide="" (mtt)="" assay.="" by="" using="" the="" above="" transcutaneous="" technique,="" the="" plasma="" clearance="" curves="" and="" kinetic="" parameters="" of="" all="" the="" agents="" can="" be="" obtained.="" the="" clearance="" half-lives="" of="" the="" hpcd-based="" agents="" either="" in="" the="" absence="" or="" in="" the="" presence="" of="" probenecid="" follow="" the="" order="" hpacd-based="" agents="" >="" hpbcd-based="" agents="">Agenti a base di HPgCD, suggerendo che il tasso di eliminazione aumenta con l'aumento delle dimensioni dell'HPCD. L'emivita di clearance degli agenti testati varia anche con il fluorophorescaffold utilizzato, ad esempio, XITC–HPbCD > FITC–HPbCD > fluorescein–HPbCD. Nella serie FITC-HPCD, FITC-HPaCD e FITC-HPgCD hanno entrambi un leggero riassorbimento tubulare perché si osservano emivite di clearance più brevi in ​​presenza di probenecid. Gli HPCD con fluoresceina mostrano un'emivita di clearance che è significativamente più alta con il trattamento con probenecid che senza il trattamento con probenecid, il che indica che sono secreti nei tubuli renali. Al contrario, FITC-HPbCD e XITC-HPbCD non mostrano alcun riassorbimento o secrezione tubulare e vengono eliminati dalla sola filtrazione glomerulare. Un prerequisito obbligatorio per un agente di funzione renale ideale è che possa ottenere il completo recupero urinario delle dosi iniettate (IDs) e che non abbia metabolismo in vivo. Quattro agenti, tra cui FITC–HPaCD, FITC–HPbCD, FITC–HPgCD e XITC–HPbCD, hanno recuperi urinari elevati di quasi il 100% degli ID e non subiscono metabolismo in vivo. Tuttavia, solo il 40-60% degli ID della fluoresceina-HPCD viene recuperato nelle urine. Questi risultati suggeriscono che la fluoresceina-HPCD non viene completamente escreta attraverso i reni ma anche per altre vie, compreso il metabolismo da parte degli enzimi in vivo. In sintesi, FITC-HPbCD è considerato un nuovo promettente agente GFR fluorescente esogeno. Da notare, la morte prematura e i segni clinici avversi, determinati dalla misurazione del peso corporeo e del consumo di cibo dei ratti, non sono osservati durante l'intera serie di esperimenti.

Uno dei maggiori ostacoli incontrati con una valutazione transcutanea non invasiva in tempo reale direne funzionein vivo utilizzando i suddetti agenti fluorescenti GFR è una forte autofluorescenza di fondo intrinseca da tessuto vivente a causa della loro breve lunghezza d'onda di emissione nelle regioni blu e verde dello spettro (l<600 nm),="" which="" significantly="" compromises="" the="" accuracy="" of="" the="" measurements="" under="" physiological="" conditions.="" however,="" the="" absorption="" coefficient="" of="" tissue="" in="" the="" near-infrared="" (nir)="" region="" (l="650–900" nm)="" is="" greatly="" suppressed="" to="" a="" minimum="" level,="" which="" thus="" drastically="" reduces="" the="" disturbances="" and="" noise="" from="" autofluorescence="" and="" increases="" tissue="" penetration.="" [35]="" therefore,="" it="" is="" highly="" desirable="" to="" develop="" gfr="" agents="" in="" the="" nir="" optical="" window="" for="" transcutaneous="" assessment="" of="">renefunzione. Recentemente, diversi studi hanno rivelato che i fluorofori organici convenzionali possono accumularsi in modo persistente nelle membrane lipidiche della pelle dopo l'iniezione endovenosa a causa della loro elevata lipofilia.[36] I grandi sistemi idrofobici p-coniugati di coloranti NIR organici generalmente portano a un forte legame tra coloranti e proteine ​​​​in siero; per esempio, il verde indocianina (ICG, Figura 4a) mostra PPB estremamente elevati (99 percento), assorbimento epatico ed escrezione. Un PPB così alto ostacola la sua escrezione renale. Sono stati fatti molti tentativi per superare questi ostacoli e aumentando il numero di gruppi solfonato sui coloranti cianinici è possibile ottenere una maggiore idrofilia e una diminuzione del PPB per alcuni coloranti eptametina-cianina.[37] Ad esempio, il PPB del colorante anionico commerciale IRDye800CW (Figura 4a) raggiunge il 41 percento. Sebbene la clearance renale di IRDye800CW possa essere determinata mediante tomografia optoacustica multispettrale (MSOT),[38] le sue curve di clearance plasmatica non presentano decadimento a 90 minuti dopo l'iniezione utilizzando misurazioni transcutanee.[35] Questi studi confermano ulteriormente che il rapido accumulo e la lunga ritenzione dei fluorofori organici convenzionali nella pelle rappresentano un dilemma per la misurazione transcutanea non invasiva della funzione renale.

Recentemente, Choi et al. riportato un lavoro pionieristico sui coloranti zwitterionico eptametina-cianina.[39] I coloranti zwitterionici con una carica complessiva neutra mostrano lipofilia e PPB ridotti a causa della schermatura della carica. Tutti gli analoghi zwitterionici vengono escreti dall'organismo nelle urine mediante la clearance renale senza quasi nessun assorbimento non specifico significativo in altri organi o tessuti.[40] Sebbene questi analoghi zwitterionici abbiano una PPB ridotta e possano essere completamente eliminati dai reni, la loro PPB è ancora superiore a quella degli agenti della funzione renale "standard" come l'inulina e lo iotalamato (9,5 percento) [35] e causano un'emivita di clearance relativamente lunga. Ispirati da quel lavoro, abbiamo riportato i primi agenti NIR GFR con idrofilia migliorata e PPB molto più basso (<7%) through="" introducing="" zwitterionic="" charges="" and="" hpbcd="" on="" heptamethine="" cyanine="" dyes.="" to="" study="" the="" influence="" of="" different="" molecular="" surfaces="" charges="" on="" their="" ppb="" and="" excretion="" systematically,="" nir="" fluorescent="" agents="" with="" three="" different="" molecular="" surface="" charge="" characteristics="" (i.e.="" zwitterionic,="" anionic,="" and="" cationic;="" figure="" 4="" b)="" have="" been="" designed,="" and="" they="" comprise="" two="" key="" functional="" components:="" hpbcd="" and="" nir="" fluorophores.="" covalent="" conjugation="" between="" hpbcd="" and="" the="" nir="" fluorophores="" is="" achieved="" by="" either="" ester="" bond="" or="" click="" chemistry.="" their="" spectra="" effectively="" match="" the="" configuration="" of="" the="" transcutaneous="" device,="" which="" consists="" of="" two="" light-emitting="" diodes="" with="" an="" excitation="" wavelength="" at="" 700="" nm="" and="" a="" photodiode="" for="" emission="" wavelength="" detection="" at="" 790="" nm.="" in="" in="" vitro="" studies,="" the="" zwitterionic="" agents="" abzwcy–hpbcd="" and="" aazwcy–hpbcd="" have="" much="" lower="" ppb="" (3.7="" and="" 6.5%,="" respectively)="" than="" the="" anionic="" agents="" (i.e.="" abancy–hpbcd="" and="" aaancy–hpbcd,="" 19.7="" and="" 26.8%,="" respectively)="" and="" the="" cationic="" agents="" (i.e.="" abcacy–hpbcd="" and="" aacacy–hpbcd,="" 23.5="" and="" 27.4%,="" respectively),="" and="" even="" lower="" than="" some="" "gold-standard"="" agents.="" in="" vivo,="" urinary="" recovery="" and="" fluorescent="" distribution="" investigations="" by="" small-animal="" imaging="" experiments="" demonstrate="" that="" both="" abzwcy–hpbcd="" and="" aazwcy–hpbcd="" can="" be="" completely="" and="" rapidly="" excreted="" through="" the="" kidneys.="" examination="" of="" urine="" samples="" by="" hplc="" and="" matrix-assisted="" laser="" desorption/ionization="" (maldi)="" proves="" that="" these="" two="" zwitterionic="" hpbcd-based="" agents="" have="" no="" metabolism="" in="" vivo.="" these="" two="" zwitterionic="" hpbcd-based="" agents="" can="" be="" excreted="" efficiently="" through="" the="" kidneys="" into="" the="" urine="" without="" reabsorption="" and="" secretion="" in="" the="" tubules="" (figure="" 5),="" as="" evidenced="" by="" studies="" on="" the="" blocking="" of="" both="" the="" oat="" and="" oct="" proteins="" in="" kidney="" tubules="" by="" treating="" with="" probenecid="" and="" cimetidine,="" respectively.="" studies="" in="" transgenic="" nephropathy="" rat="" models="" also="" show="" that="" zwitterionic="" hpbcd-based="" agents="" are="" promising="" agents="" for="" the="" evaluation="" of="">renefunzione. Basandosi su questi nuovi agenti NIR zwitterionici e su un dispositivo transcutaneo, viene convalidato un approccio rapido, robusto e biocompatibile per la valutazionerenefunzionein modelli di ratto che sono sia sani che con malattie renali senza la necessità di una lunga preparazione di campioni di sangue/urina.

Figura 5. Curve di clearance plasmatica di ABZWCY-HPbCD: a) in assenza eb) in presenza di trattamento con probenecid mediante misurazioni transcutanee in ratti sani. Curve di clearance plasmatica di AAZWCY-HPbCD: c) in assenza di trattamento, d) in presenza di probenecid ed e) in presenza di cimetidina mediante misurazioni transcutanee in ratti sani. f) Emivite di clearance di ABZWCY–HPbCD e AAZWCY–HPbCD in assenza e presenza di trattamento con probenecid o cimetidina.[35] Ristampato con il permesso del rif. [35]. Copyright (2017) Royal Society of Chemistry

Cstanches per migliorarefunzione renale

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Da: ' Agenti emettitori di luce per la valutazione non invasiva diReneFunzione' diJiaguo Huang, et al

--ChemistryOpen 2017, 6, 456 – 471 www.chemistryopen.org 464 T 2017 Gli autori. Pubblicato da Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinh