Co-immunoterapia basata su liposomi con agonista TLR e blocco del checkpoint SIRP47-CD per un trattamento efficace del cancro del colon

Astratto:

L’immunità antitumorale è una componente essenziale della terapia antitumorale ed è mediata principalmente dalla risposta immunitaria innata, che svolge un ruolo fondamentale nell’avviare e modellare la risposta immunitaria adattativa. Prove emergenti hanno identificato i checkpoint immunitari innati e i recettori di riconoscimento dei pattern, come CD47 e il recettore Toll-like 7 (TLR7), come promettenti bersagli terapeutici per il trattamento del cancro. Basandosi sulla proteina di fusione Fc-CV1, che comprende una variante SIRP ad alta affinità (CV1), e sul frammento Fc dell'anticorpo IgG1 umano, abbiamo sfruttato una preparazione che accoppiava Fc-CV1 ai liposomi caricati con imiquimod (agonista TLR7) ( CILP) per prendere di mira attivamente CT26. Modelli di tumore del colon singenico WT. Studi in vitro hanno rivelato che i CILP hanno mostrato proprietà di rilascio prolungato ed efficienza di assorbimento cellulare superiori rispetto all’imiquimod libero. In vivo, i test hanno dimostrato che i CILP hanno mostrato un accumulo più efficiente nei tumori e un effetto di soppressione del tumore più significativo rispetto ai gruppi di controllo. Questa preparazione immunoterapica possedeva i vantaggi di basse dosi e bassa tossicità. Questi risultati hanno dimostrato che una combinazione di terapia con blocco del checkpoint immunitario (ICB) e agonisti dell’immunità innata, come la preparazione di liposomi caricati con Fc-CV1 e imiquimod utilizzata in questo studio, potrebbe rappresentare una strategia altamente efficace per la terapia del tumore.

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Parole chiave:

imiquimod; liposoma; Fc-CV1; immunoterapia; cancro al colon

1. Introduzione

L’incidenza globale del cancro continua ad aumentare ogni anno, rappresentando una seria minaccia per la salute della popolazione mondiale e gravando pesantemente sui sistemi sanitari. Secondo un rapporto dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 2020, in tutto il mondo si sono verificati 19,29 milioni di nuovi casi di cancro e 9,96 milioni di decessi per cancro [1]. Tuttavia, con il continuo progresso nella diagnosi clinica, nella chirurgia, nella radioterapia e nella chemioterapia, la sopravvivenza globale e la qualità della vita dei pazienti affetti da cancro sono migliorate in modo significativo. In particolare, l’immunoterapia, che ha avuto origine con il vaccino Coley nel 1890 [2], è antecedente sia alla radioterapia che alla chemioterapia e ha compiuto progressi significativi nell’ultimo decennio, a beneficio dei pazienti affetti da cancro.

L’immunoterapia tumorale è stata riconosciuta per la sua eccellente biocompatibilità e elevata specificità ed è in grado di indurre risposte immunitarie per eliminare le cellule tumorali [3–5]. Due strategie principali per l’immunoterapia tumorale sono il potenziamento immunitario e la normalizzazione immunitaria [6]. I modelli di potenziamento immunitario consistono principalmente nella terapia con citochine, vaccini terapeutici antitumorali e anticorpi monoclonali. I recettori toll-like (TLR) sono considerati potenziali bersagli per l’immunoterapia antitumorale a causa del loro ruolo nell’attivazione del sistema immunitario innato. Gli agonisti dei TLR sono stati sviluppati come adiuvanti immunitari e una varietà di agonisti dei TLR sono in fase di sperimentazione clinica [7]. Il monofosforil lipide A e gli agonisti imiquimod, TLR4 e TLR7, rispettivamente, hanno ricevuto l'approvazione dalla Food and Drug Administration per l'applicazione clinica [7–9]. L'imiquimod, un agonista del TLR7 [9], attiva le risposte immunitarie e migliora l'attività antitumorale attivando il TLR7 [10,11]. La strategia di normalizzazione immunitaria è rappresentata da farmaci di blocco del checkpoint immunitario (ICB) che regolano la risposta immunitaria adattativa difettosa del tumore. Da quando il primo inibitore del checkpoint, ipilimumab, è stato approvato per l’applicazione clinica negli Stati Uniti nel 2011, gli inibitori del checkpoint immunitario, come gli inibitori PD1/PDL1, hanno fatto un passo avanti nell’immunoterapia antitumorale [12-14]. Ad eccezione dei checkpoint immunitari adattati simili a PD1/PDL1, anche alcuni checkpoint immunitari innati, come SIRP -CD47, hanno attirato molta attenzione e sono diventati aree di significativo interesse nello sviluppo di farmaci anticorpali [15-17].

Il checkpoint SIRP -CD47 è stato identificato per la prima volta nel 1999 [18,19]. SIRP è un recettore CD47 espresso nei neuroni del sistema nervoso centrale [20] e nelle cellule mieloidi, inclusi monociti, macrofagi, granulociti e cellule dendritiche. CD47 è una "molecola autoetichettante" espressa su quasi tutte le cellule normali e sovraespressa sulla maggior parte delle cellule tumorali [21]. Sulla superficie delle cellule tumorali, il CD47 si lega al SIRP, inibendo la fagocitosi mediata dai macrofagi, che è un importante mezzo di fuga immunitaria del tumore [22]. È stato dimostrato che la fagocitosi dei macrofagi all’interno del microambiente tumorale può essere migliorata quando il legame di CD47 e SIRP viene bloccato [20–25]. Pertanto, gli inibitori del checkpoint immunitario che bloccano la via CD47/SIRP sono stati sviluppati e applicati nella terapia del cancro [26].

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In questo studio, abbiamo utilizzato una combinazione di imiquimod e proteina di fusione (Fc-CV1) per trattare il cancro del colon. CV1 è una proteina SIRP ricombinante umana modificata che ha un'affinità 50,000- volte maggiore per CD47 rispetto alla proteina originale [27]. Fc-CV1 è stato costruito utilizzando la tecnologia "Knobs-into-holes", basata sul monomero CV1 e sul frammento Fc dell'IgG1 umana. Per superare i limiti della scarsa efficacia terapeutica e della tossicità sistemica associati all'imiquimod [28,29], abbiamo preparato nanoliposomi attraverso il metodo di iniezione di etanolo. I nanoliposomi hanno le caratteristiche di bassa tossicità nella somministrazione dei farmaci [30,31]. Successivamente, imiquimod è stato incapsulato in liposomi che hanno coniugato Fc-CV1 in superficie. Infine, questa nuova nanopreparazione può fornire attivamente agonisti TLR7 ai tessuti tumorali e ha la duplice funzione di farmaco ICB e agonista TLR. È stato utilizzato per trattare il modello di tumore del colon singenico CD47+ CT26.WT [32].

2. Risultati e discussione

2.1. Caratterizzazione di LP (liposomi vuoti), ILP (liposomi incapsulati con imiquimod non mirati a CD47-), CLP (liposomi mirati a CD47) e CILP (liposomi caricati con Fc-CV1 accoppiato a Imiquimod (agonista TLR7))

I CILP sono stati preparati con successo mediante iniezione di etanolo e metodo del gradiente di solfato di ammonio. La Figura 1A mostra il processo di sintesi dei CILP. Un'analisi TEM ha dimostrato che i CILP erano sferici e di forma uniforme (Figura 1B). Inoltre, il risultato DLS ha rivelato che la dimensione delle particelle dei quattro liposomi era una distribuzione unimodale (Figura 1C). Il tasso di legame (BR) è stato verificato da SDS-PAGE, che è visualizzato nella Figura 1D, E. La Figura 1D mostra il peso molecolare di Fc-CV1 e la luminosità relativa della banda dei CILP dializzati e pre-dializzati. Il BR è stato calcolato essere 67,13 ± 37,10% attraverso la densitometria a scansione delle bande elettroforetiche dell'immagine J (Figura 1E), fornendo la possibilità che il CD47- abbia come bersaglio le cellule tumorali.

Figura 1. (A) Illustrazione schematica della sintesi dei CILP. (B) Immagine TEM dei CILP

L'HPLC è stato utilizzato per rilevare l'efficienza di incapsulamento (EE) di imiquimod (Figura supplementare S1). Come mostrato nella Figura supplementare S1A, l'imiquimod libero ha mostrato un picco singolo significativo, mentre i CLP non hanno mostrato alcun picco nelle stesse condizioni di test (Figura supplementare S1B). Pertanto, è possibile rilevare i CILP direttamente nelle condizioni di test. Come previsto, i valori di rilevamento dei CILP prima e dopo la dialisi sono stati considerati rispettivamente come contenuto totale del farmaco e contenuto del farmaco nei liposomi (Figura supplementare S1C, D). L'EE di imiquimod è stato calcolato pari a 85,44 ± 4,11%. Rispetto al sistema di somministrazione dei farmaci a caricamento passivo riportato [33-35], questo studio ha ottenuto una maggiore efficienza di incapsulamento e un processo di preparazione più conveniente.

DLS ha dimostrato che i diametri degli LP erano 111,567 ± 0,655 nm, mentre CLP, ILP e CILP hanno mostrato una dimensione leggermente maggiore di 117,467 ± 0,34{{10} } nm, 120,233 ± 0,776 nm e 13{{30}},033 ± 0,974 nm, rispettivamente (Tabella 1). I cambiamenti nella dimensione di questi liposomi possono essere attribuiti alla modifica di Fc-CV1 e imiquimod. Il PDI era vicino a 0,1 (Tabella 1), indicando che questi veicoli di somministrazione dei farmaci erano altamente omogenei nella loro distribuzione. Inoltre, i valori del potenziale zeta di LP, CLP, ILP e CILP sono stati misurati rispettivamente in −2,231 ± 0,167 mV, −2,492 ± 0,033 mV, −2,383 ± 0,070 mV e −2,075 ± 0,070 mV (Tabella 1) , suggerendo che l'Fc-CV1 coniugato in superficie e l'imiquimod incapsulato hanno avuto scarso effetto sulla carica dei liposomi.

Tabella 1. I diametri, il potenziale zeta, il PDI e l'EE di LP, CLP, ILP e CILP, rispettivamente.

2.2. Efficienza di assorbimento cellulare in vitro

L'efficienza di assorbimento cellulare dei CILP è stata valutata attraverso l'intensità della fluorescenza di Cy5 assorbita dalle cellule CT26.WT utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto. Come mostrato nella Figura 2, rispetto ai gruppi Cy5 e ILP-Cy5 liberi, i gruppi CILPs-Cy5 hanno mostrato una capacità di assorbimento cellulare più forte dopo 30 minuti di incubazione. Questi risultati hanno dedotto che Fc-CV1 ha migliorato la capacità di rilascio intracellulare dei liposomi caricati con imiquimod a causa dell’affinità specifica per il recettore Fc-CV1, portando a un effetto antitumorale più potente.

Figura 2. Immagini delle cellule CT26.WT dopo l'incubazione con Cy5, ILPs-Cy5 e CILPs-Cy5 liberi (rosso) per 0,5 ore e colorazione con DAPI (blu). Barra della scala: 50 µm. (n {{10}}). *p<0,05; **** p < 0,0001

2.3. Curve di rilascio dei liposomi

Le curve di rilascio del farmaco di imiquimod libero, ILP e CILP sono state misurate in un ambiente simulato in vivo. La Figura 3 mostra che l'imiquimod libero è stato rilasciato interamente dopo 1 ora, mentre il tasso di rilascio (RR) dell'imiquimod incapsulato con ILP e CILP era solo 54,75 ± 4,08% e 39,70 ± 0,05% a 12 ore , rispettivamente. Inoltre, il lento rilascio di imiquimod negli ILP e nei CILP potrebbe essere risolto grazie alla proprietà di rilascio controllato del farmaco dei liposomi. Il RR di imiquimod negli ILP e nei CILP non ha mostrato differenze significative a 96 ore, indicando che il "post inserimento" ha mostrato un impatto trascurabile sulla stabilità della membrana dei liposomi.

figura 3. Curve di rilascio di imiquimod libero, ILP e CILP in PBS a 37 ◦C. I dati sono presentati come medie ± deviazione standard (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Studio sulla citotossicità

Per studiare la citotossicità dei CILP in vitro, il test CCK{{0}} è stato eseguito su cellule CT26.WT. Come mostrato nella Figura 4, i CILP a basse concentrazioni (0,1–1 µg/mL) non hanno mostrato citotossicità, il che è coerente con la sicurezza della terapia immunitaria. La vitalità cellulare era leggermente ridotta dopo il trattamento con 5 µg/mL di imiquimod, probabilmente a causa dei ROS e della morte cellulare immunogenica mediata dal reticolo endoplasmatico indotta da imiquimod [36]. Inoltre, i CILP portano ad una significativa diminuzione della vitalità cellulare rispetto ai gruppi di controllo, che è attribuita all’effetto sinergico di imiquimod e Fc-CV1.

Figura 4. La vitalità delle cellule trattate con Fc-CV1, imiquimod, CLP, ILP e CILP per 24 ore. La concentrazione di Fc-CV1 e di imiquimod era entrambe 0–10 µg/mL. * p < 0,05, ** p < 0,01, ns=nessuna differenza significativa

2.5. Studio sulla biodistribuzione

La distribuzione e l'accumulo di diverse formulazioni nei tumori e negli organi principali influisce direttamente sull'effetto terapeutico. Dopo la somministrazione endovenosa, i segnali di fluorescenza sono stati monitorati utilizzando un sistema di vivisezione nel vicino infrarosso per valutare la distribuzione e l'accumulo di diverse formulazioni nei tumori e negli organi principali dopo 24 ore. Come mostrato nella Figura 5, l'intensità di fluorescenza totale di ILPs-Cy5 e CILPs-Cy5 era superiore a quella del Cy5 libero, indicando che i liposomi possedevano una proprietà a lunga circolazione in vivo. Inoltre, l'intensità della fluorescenza del gruppo di trattamento CILPs-Cy5 era la più alta nel tessuto tumorale, il che potrebbe essere attribuito all'effetto di targeting del tumore dei ligandi Fc-CV1, migliorando così l'effetto antitumorale. Sorprendentemente, l’intensità della fluorescenza di fegati e milze era più potente di quella di altri organi, probabilmente a causa della fagocitosi dei liposomi da parte del sistema reticoloendoteliale (RES) nel fegato e nei reni [37].

Figura 5. Distribuzione della fluorescenza della Cy5- nei tumori e negli organi principali a 24 ore dalla somministrazione endovenosa. I dati sono mostrati come media ± deviazione standard (n=3). **** p < 0.0001

2.6. Studio sull'inibizione del tumore in vivo

Il programma terapeutico (Figura 6A) e gli effetti dei diversi preparati sono mostrati nella Figura 6. Rispetto ai gruppi PBS e LP, altri gruppi di trattamento hanno mostrato alcuni effetti di soppressione del tumore. In particolare, il volume del tumore era minimo dopo il trattamento con CILP, suggerendo che i CILP possedevano un eccellente effetto soppressore del tumore (Figura 6B).

Figura 6. (A) Illustrazione schematica del trattamento anti-cancro del colon sul modello tumorale CT26.WT. (B) Le curve di crescita del volume del tumore durante il periodo di trattamento. (C) Fotografie relative del tumore e (D) peso del tumore raccolto da diversi gruppi di trattamento il giorno 17. (E) Il rapporto peso corporeo relativo del peso corporeo rispetto a 0 giorno. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Alla fine dell'esperimento, i topi sono stati sacrificati e i loro tumori sono stati asportati, fotografati e pesati per determinare l'efficacia terapeutica dei diversi preparati. Come mostrato nella Figura 6C, D, il gruppo di trattamento dei CILP presentava i tumori più piccoli e leggeri rispetto ad altri gruppi, dimostrando che i CILP possedevano i maggiori effetti di soppressione del tumore. La tabella 2 mostra che il tasso di inibizione della crescita tumorale dei CILP è stato calcolato pari all'84,35%. Inoltre, il tasso di soppressione tumorale dell’84,35% è risultato significativamente più alto rispetto a quello dei gruppi CLP e ILP, e questo significa che esiste un effetto sinergico tra il blocco dell’asse “non mangiarmi” e l’attivazione della risposta immunitaria . Rispetto alla preparazione equivalente in vitro (2,5–5 µg/mL), il tasso di inibizione più elevato era strettamente correlato a quello della risposta immunitaria attivata dalla formulazione e bloccava il meccanismo di fuga immunitaria in vivo, che non era disponibile in vitro.

Tabella 2. Dati relativi al peso del tumore e all'inibizione della crescita tumorale (TGI) di vari gruppi di trattamento.

2.7. I CILP hanno aumentato l'infiltrazione di cellule T e la secrezione di IFN

Per esplorare l'ambiente delle cellule immunitarie dei tumori, la cellula immunitaria indotta dai CILP è stata analizzata immunoistochimicamente alla fine del test antitumorale. Le cellule T CD4+ e CD8+ erano aumentate nelle sezioni tumorali dei gruppi CILP (Figura 7). La co-somministrazione di Fc-CV1 e della terapia con imiquimod ha comportato una significativa infiltrazione di cellule T CD4+ e CD8+. Inoltre, si è verificata una significativa secrezione di IFN nei tumori sottoposti a trattamento con CILP, poiché i CILP hanno attivato il recettore Toll-like 7 e attivato la risposta immunitaria.

Figura 7. Immunoistochimica dei tessuti tumorali del topo; le cellule positive sono colorate di marrone. Barra della scala, 50 µm (n=5).

2.8. Valutazione della biosicurezza dei CILP

Anche la biosicurezza della terapia mediata dai CILP è stata un indice importante in termini di accesso alla valutazione terapeutica. Durante lo studio di inibizione del tumore in vivo, i CILP non hanno indotto una significativa perdita di peso nel periodo di trattamento (Figura 6D). I parametri biochimici del fegato e dei reni erano tutti nell'intervallo normale secondo l'intervallo di riferimento standard dei topi (Tabella 3) e l'istologia dell'organo non mostrava cambiamenti significativi, indicando che i CILP possedevano un'eccellente biosicurezza (Figura 8). Questi risultati sono cruciali per valutare il potenziale dei CILP come agente immunoterapeutico sicuro ed efficace per il trattamento del cancro.

Tabella 3. Parametri biochimici del fegato e dei reni

Figura 8. Colorazione H&E (ematossilina ed eosina) degli organi principali. Barra della scala, 50 µm (n=3)

3. Materiali e metodi

3.1. Materiali

Imiquimod è stato acquistato da MedChem Express (Shanghai, Cina). Fc-CV1 è stato fornito dal Laboratorio statale di farmaci anticorpali e terapie mirate. Colesterolo, lecitina idrogenata (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS e DSPE-PEGCy5 sono stati acquistati da Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Cina). Il 40,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) è stato ottenuto da Keygen Biotech (Nanjing, Cina). Il solfato di ammonio è stato ottenuto da Sinopharm (Shanghai, Cina). Il metanolo (grado cromatografico) e l'acetonitrile (grado cromatografico) sono stati acquistati dalla Aladdin Reagent Company (Shanghai, Cina). Gli altri reagenti sono tutti di grado analitico domestico. Linea cellulare di cancro al colon di topo CT26. WT è stato fornito dalla Banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze. Le cellule sono state coltivate in un incubatore cellulare nel terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) al 5% di CO2 e al 95% di aria. Topi BALB / c femmine di 4-6 settimane sono stati forniti dal Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Cina).

3.2. Preparazione dei liposomi bianchi

Innanzitutto, 13,455 mg di HSPC, 4,3595 mg di DSPE-PEG2000 e 4,7095 mg di colesterolo sono stati pesati con precisione e sciolti in 0,1 ml di etanolo (HSPC: DSPE-PEG2000:colesterolo=55.5: rapporto molare 5,05:39,3). In secondo luogo, la soluzione di etanolo è stata rapidamente iniettata in una soluzione preriscaldata di solfato di ammonio (250 mM, 1 mL, 65 ◦C) tramite una siringa e quindi incubata per 30 minuti a 65 ◦C con agitazione magnetica. Successivamente, la soluzione preparata è stata successivamente estrusa attraverso le membrane di policarbonato (Avanti, Alabaster, AL, USA); la dimensione era rispettivamente di 200 nm, 100 nm e 50 nm. Infine, la soluzione risultante erano i liposomi bianchi (LP) con una concentrazione lipidica di 22,5 mg/mL.

3.3. Preparazione di liposomi incapsulati con imiquimod mirati al CD47

Innanzitutto, DSPE-PEG2000-NHS è stato sciolto in ddH2O (60 ◦C) e quindi miscelato con Fc-CV1 e incubato su una tavola vibrante a temperatura ambiente per 5 ore (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 rapporto molare). Il meccanismo di reazione chimica della connessione tra Fc-CV1 e DSPE-PEG2000-NHS prevedeva che l'estere NHS reagisse con l'ammina primaria su Fc-CV1 e formasse un coniugato di legame amminico da tavola. La soluzione preparata è stata miscelata proporzionalmente con LP e incubata a 60 ◦C per 1 ora per inserire Fc-CV1 nei liposomi, operazione denominata "post inserimento" [38]. Le proporzioni della miscela erano che 2,25 mg di Fc-CV1 venivano modificati per 22,5 mg di liposomi. Sono stati quindi ottenuti i liposomi mirati al CD47 (CLP).

Successivamente, i CLP sono stati posti in una sacca per dialisi (300 kDa) e dializzati contro HEPES (10 mM, pH=7.4) per 1 ora per rimuovere il solfato di ammonio e il residuo Fc-CV1 nella fase acquosa esterna. I CLP dializzati sono stati incubati con una soluzione di imiquimod (5 mg/ml) in un rapporto compreso tra 1 mg e 7 µmol di fosfolipidi totali a temperatura ambiente per 24 ore e quindi dializzati contro PBS (300 kDa) tre volte per eliminare l'imiquimod non incapsulato, che si riferiva a la tecnica del gradiente del solfato di ammonio [39]. Sono stati quindi ottenuti i CILP. Inoltre, sono stati preparati i liposomi incapsulati con imiquimod (ILP) non mirati al CD47-. CLP e ILP sono stati considerati come controllo per CILP.

3.4. Caratterizzazione

La morfologia di questi liposomi è stata fotografata con un microscopio elettronico a trasmissione (TEM, Joel, Tokyo, Giappone). La dimensione, il potenziale zeta e l'indice di dispersione del polimero (PDI) di questi liposomi sono stati determinati mediante diffusione dinamica della luce (DLS) e diffusione elettroforetica della luce (ELS) utilizzando il sizer Zeta ZSE di Malvern (Malvern, Regno Unito). Il tasso di legame (BR) di Fc-CV1 inserito nei liposomi è stato misurato mediante elettroforesi su gel di sodio lauril solfato-poliacrilammide al 15% (SDS-PAGE) e software Image J (Bethesda, MD, USA). L'efficienza di incapsulamento (EE) dell'imiquimod è stata rilevata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA).

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3.5. Studio sull'assorbimento cellulare in vitro

L'assorbimento cellulare in vitro di questi liposomi è stato determinato dall'intensità cumulativa della fluorescenza di Cy5 nel CT26. Celle WT. DSPE-PEG-Cy5 è stato incubato con CILP e ILP (DSPE-PEG-Cy5: rapporto di massa CILP o ILP=1:5) a 60 ◦C per 1 ora, rispettivamente, e poi liposomi fluorescenti sono stati ottenuti i nomi CILPs-Cy5 e ILPs-Cy5. Le cellule CT26.WT sono state seminate in piastre a pozzetti 96- e divise casualmente in tre gruppi (1 × 104 cellule/pozzetto, n=3). Dopo che la confluenza cellulare ha raggiunto il 50–70%, ciascun gruppo è stato incubato rispettivamente con Cy5, ILPs-Cy5 e CILPs-Cy5 liberi per 30 minuti a 37 ◦C, in cui le concentrazioni finali di Cy5 erano 1 µg/mL in 0,1 ml di RPMI 1640 medio. Successivamente, le cellule sono state immobilizzate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti dopo essere state lavate due volte con PBS e quindi colorate con 10 µl di DAPI (1 µg/μl) per 10 minuti dopo essere state lavate due volte con PBS. Infine, l'assorbimento di ciascun gruppo di cellule è stato registrato da un sistema di imaging ad alto contenuto (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) dopo aver lavato due volte con PBS.

3.6. Lo studio sul rilascio dell'Imiquimod

Le curve di rilascio di vari liposomi caricati con il farmaco sono state eseguite utilizzando il metodo di dialisi (300 kDa) e i risultati sono stati confrontati con la soluzione di imiquimod libera. In breve, 0,6 mL di ILP, CILP e la soluzione di imiquimod sono stati confezionati separatamente nelle sacche per dialisi e quindi collocati in 500 mL di soluzione PBS (pH=7,4, 37 ◦C). Volumi uguali di campioni sono stati estratti dalle sacche a intervalli di tempo predeterminati (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 e 96 ore) e la velocità di rilascio (RR) di imiquimod è stato calcolato utilizzando la seguente equazione:

dove Sund e Sd rappresentavano l'area del picco HPLC dell'imiquimod in preparazioni pre-dializzate e dializzate in tempi diversi, rispettivamente (n=3).

3.7. La citotossicità dei CILP

Le cellule CT{{0}}.WT sono state seminate in una piastra a pozzetti 96- (1 × 104/pozzetto, n=3) e coltivate in 100 µl di terreno RPMI 1640 fino alla confluenza ha sfiorato il 70%. Per determinare la citotossicità dei CILP, il terreno RPMI 1640 è stato rimosso da ciascun pozzetto e sostituito con una soluzione complessa di CILP e terreno RPMI 1640, con concentrazioni di Fc-CV1 e imiquimod comprese tra 0 e 10 µg/mL. Le cellule sono state incubate con una soluzione complessa per 24 ore. Inoltre, le cellule trattate con Fc-CV1, CLP, soluzione di imiquimod e ILP in una concentrazione simile sono state considerate gruppi di controllo. Le cellule sopravvissute sono state rilevate con un test CCK-8 dopo 24 ore e la vitalità delle cellule non trattate è stata considerata al 100%.

3.8. Studio sulla biodistribuzione

Nove topi BALB/c femmine sono stati iniettati per via sottocutanea con CT26. Le cellule WT (5 × 105) nel fianco destro e questi topi portatori di tumore sono stati divisi casualmente in tre gruppi (n=3). I volumi del tumore sono stati misurati utilizzando un calibro e sono stati calcolati con la seguente formula:

Quando il volume del tumore ha raggiunto 100 mm3, Cy5, ILP-Cy5 e CILPs-Cy5 liberi sono stati iniettati per via endovenosa ad una dose di Cy5 di 0,4 mg/kg. Ventiquattro ore dopo l’iniezione endovenosa, furono asportati il ​​tumore, il cuore, il fegato, la milza, il polmone e il rene. I segnali di fluorescenza dei tumori e degli organi principali sono stati rilevati dal sistema di imaging ottico IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. Studio sull'inibizione del tumore in vivo

Trentacinque topi BALB/c femmine sono stati divisi casualmente in sette gruppi (n=5) e 5 × 105 CT26. Le cellule WT sono state iniettate per via sottocutanea nel fianco destro di ciascun topo. Quando la dimensione del tumore nel topo raggiunse circa 100 mm3, fu iniziato il trattamento. PBS, LP, imiquimod, Fc-CV1, ILP, CLP e CILP sono stati iniettati per via endovenosa nei giorni 0, 4, 8 e 12. La dose di imiquimod era di 2,5 mg/kg nella prima e nella seconda iniezione e di 5 mg/kg nella terza e quarta iniezione. In tutte le iniezioni, la dose di Fc-CV1 era di 5 mg/kg. A questa dose, la concentrazione del farmaco nel corpo era di 2,5–5 µg/mL, che ha esercitato citotossicità sulle cellule in un esperimento in vitro. Il diametro del tumore e il peso corporeo sono stati misurati ogni giorno durante il trattamento. Il giorno 17, i tumori dei topi sono stati prelevati e il loro peso è stato misurato. L’inibizione della crescita tumorale (TGI) è stata calcolata secondo la seguente formula:

3.10. Immunoistochimica

La colorazione immunoistochimica di CD4, CD8 e IFN è stata eseguita nei tessuti tumorali secondo un protocollo standard. Dopo aver deparaffinato e reidratato la sezione in paraffina delle sezioni dei tessuti tumorali, al cerchio è stato aggiunto il 3% di BSA per coprire il tessuto ed è stato quindi sigillato per 30 minuti a temperatura ambiente. Le sezioni sono state colorate con gli anticorpi CD4, CD8 e IFN (Servicebio, Wuhan, Cina) durante la notte a 4 ◦C, e quindi incubate con un anticorpo secondario (marcato con HRP, Servicebio, Wuhan, Cina) a temperatura ambiente per 50 minuti dopo due lavaggi con PBS. Alla fine, le sezioni sono state visualizzate al microscopio (Nikon, E100, Tokyo, Giappone) dopo aver reagito con l'agente cromogenico DAB.

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3.11. Valutazione della biosicurezza dei CILP

Alla fine dello studio di inibizione del tumore, tutti i tumori sono stati raccolti ed è stato misurato il peso di questi tumori. I parametri biochimici, tra cui alanina transaminasi (ALT), aspartato transaminasi (AST), creatinina (CREA) e urea (UREA), sono stati rilevati nel sangue dei topi. I tessuti tumorali freschi e gli organi principali sono stati fissati con paraformaldeide al 4% e incorporati in paraffina utilizzando una macchina per l'inclusione (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, Cina). Fette di tessuto con uno spessore di 5 µm sono state tagliate attraverso il microtomo (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, Cina) e quindi colorate con ematossilina ed eosina (H&E) secondo il protocollo. Successivamente, le fettine colorate sono state osservate al microscopio (Nikon, E100, Tokyo, Giappone).

3.12. Analisi statistica

Tutti i dati sono espressi come media ± DS. Il livello di significatività tra i gruppi è stato testato mediante ANOVA unidirezionale utilizzando Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 è stata definita come una differenza significativa.

3.13. Etica degli animali

Tutte le procedure e raccomandazioni riguardanti gli animali sono state approvate dal Comitato speciale di etica della ricerca scientifica dell'Università di Liaocheng seguendo le linee guida nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Codice di approvazione: 2022111010; Data di approvazione: 1 novembre 2022).

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

4. Conclusioni

In sintesi, i liposomi mirati al CD47-incapsulati con imiquimod sono stati sviluppati con successo e i risultati in vitro hanno dimostrato che i CILP possedevano un rilascio più sostenuto e un effetto di targeting specifico. I risultati in vivo hanno mostrato che il preparato poteva essere assorbito efficacemente dalle cellule tumorali e che presentava un’eccellente efficienza nel trattamento del tumore e biosicurezza grazie alla duplice funzione della risposta immunitaria e del blocco del checkpoint immunitario innato. Pertanto, i liposomi incapsulati con imiquimod accoppiati a Fc-CV1 sembrano essere promettenti per una nuova nanomedicina per migliorare il trattamento del tumore con espressione di CD47. L’immunoterapia basata sull’immunità innata potrebbe servire come strategia generale contro la crescita del tumore per combinazioni sinergiche con ICB in futuro.

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