L'esaurimento a lungo termine delle cellule B si associa alla rigenerazione della funzione renale

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Susanne V. Fleig, et al

Astratto

Sfondo:Cronicorenepatologia(CKD) è una condizione comune che aumenta la mortalità e il rischio di malattie cardiovascolari e di altro tipo indipendentemente dalla condizione renale sottostante. L'infiammazione cronica favorisce la fibrosi renale. Recentemente, sono stati descritti infiltrati di cellule B renali nella malattia renale cronica di varie eziologie oltre l'autoimmunità.

Metodi:Abbiamo qui studiato le cellule B e gli indicatori della formazione della struttura linfoide terziaria nelle biopsie renali umane. La funzione renale è stata studiata durante la deplezione a lungo termine dei linfociti B in pazienti umani con nefropatia membranosa e con insufficienza renale cronica di origine sconosciuta.

Risultati:I profili delle citochine della formazione della struttura linfoide terziaria sono stati rilevati nell'interstizio renale umano in un intervallo direnemalattie. Strutture complesse di cellule B coerenti con la formazione di organi linfoidi terziari erano evidenti nella nefropatia membranosa umana. Qui, la densità dei linfociti B non si associava significativamente alla gravità della proteinuria, ma a una peggiore funzione renale escretoria. Le risposte della proteinuria si verificavano principalmente entro i primi 6 mesi dall'esaurimento dei linfociti B. Al contrario, il recupero dell'escretorerenefunzioneè stata osservata solo dopo 18 mesi di terapia continua, coerentemente con un processo strutturale. Sono state rilevate anche strutture linfatiche terziarie renali in assenza di autoimmunirenepatologia. Per iniziare a valutare se l'esaurimento dei linfociti B possa influenzare la CKD in una popolazione più ampia, abbiamo valutatorenedivertimentoczione nei pazienti neurologici con insufficienza renale cronica (Cronicorenepatologia)di origine sconosciuta. In questa coorte, l'eGFR è aumentato significativamente entro 24 mesi dall'esaurimento delle cellule B.

Conclusione:Deplezione a lungo termine delle cellule B associata a un significativo miglioramento dell'escrezionerenefunzionenell'insufficienza renale umana (Cronicorenepatologia). La cinetica e i meccanismi di aggregazione dei linfociti B renali dovrebbero essere ulteriormente studiati per stratificare l'impatto dei linfociti B e dei loro aggregati come bersagli terapeutici.

PAROLE CHIAVE:cancro, migrazione cellulare, fegato/epatociti

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1 | INTRODUZIONE

I linfociti B possono infiltrarsi direttamente negli organi non linfoidi, compreso il rene. L'infiammazione persistente può indurre strutture organizzate, che contengono cellule T e vasi linfatici e sono conformi alla definizione di strutture terziarilinfoidi (TLS).1,2 I TLS assomigliano ai linfonodi nella composizione e nell'architettura delle cellule, ma sono confinati dall'organo ospite e spostano il parenchima dell'organo. I linfociti B vengono reclutati dalla chemochina CXCL13 espressa dallo stroma locale (nome alternativo: attrattore dei linfociti B 1).1–3 Essi, a loro volta, secernono linfotossine inclusa la linfotossina B(LTB),4 che promuovono la differenziazione dello stroma perivascolare verso le cellule reticolari fibroblastiche del tessuto linfoide e il dendritico follicolare cellule,5,6 consolidando così la nuova struttura linfoide.7

Nel rene, la TLS è stata segnalata in una serie di malattie autoimmuni tra cui glomerulonefrite associata ad ANCA, lupus eritematoso sistemico renale, glomerulopatia membranosa e IgAnefrite. .13-16 Più recentemente, le TLS renali sono state descritte in assenza di stimolo analloimmune, ad esempio durante il follow-up a lungo termine del danno da ischemia-riperfusione murina1,16 e nella pielonefrite umana grave.17

La deplezione terapeutica dei linfociti B ha successo clinicamente in una serie di anticorpi mediatirenemalattiecompreso il rigetto dell'allotrapianto renale e le fritidi glomerulari. Ad esempio, nella nefropatia membranosa, una causa comune della sindrome nefrosica, la deplezione dei linfociti B da parte di rituximab raggiunge livelli di remissione simili a quelli dei protocolli precedenti come il regime di Ponticelli e gli inibitori della calcineurina.18-20 L'evidenza attuale comprende diversi studi controllati21,22 e una gamma di serie di casi. Attualmente, l'esaurimento degli anticorpi auto-orali e quindi l'abrogazione dell'attivazione immunitaria a valle e della distruzione dei tessuti è considerato il principale meccanismo d'azione. L'esaurimento delle cellule B da parte di rituximab ha anche dissolto gli infiltrati diffusi di cellule B negli allotrapianti di rene umano,14 mentre l'esaurimento a breve termine delle cellule B era apparentemente inefficace per la dissoluzione del TLS, sebbene in un numero molto limitato di pazienti.23 Al contrario, il TLS è scomparso in un modello murinoSLE dopo B a lungo termine terapia di deplezione cellulare.24

È ipotizzabile che l'infiltrazione diffusa di cellule B e TLS possa compromettere la funzione d'organo anche in assenza di immunità mediata da anticorpi. Se il TLS renale si forma incronicorenepatologia(CKD) di varie eziologie, la deplezione a lungo termine dei linfociti B dovrebbe giovare anche ai pazienti senza una diagnosi di malattia renale mediata da anticorpi. Abbiamo studiato l'infiltrazione dei linfociti B e i marcatori della formazione di TLS nella glomerulonefrite umana e abbiamo valutato lo sviluppo direnefunzionedurante la deplezione a lungo termine dei linfociti B nella glomerulonefrite membranosa e CKD di origine sconosciuta.

2|MATERIALE E METODI

2.1|Studiare le popolazioni

Le analisi dei dati sono state effettuate dopo l'approvazione del comitato etico (MHH 2018-8172 e 2019-8275) in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Nel reparto di nefrologia, i pazienti con diagnosi istologica di glomerulopatia membranosa sono stati identificati dalle cartelle elettroniche utilizzando i codici di fatturazione del degenza "glomerulonefrite membranosa" e "sindrome nefrosica da nefropatia membranosa"2015-2019 e dalle cartelle degli ambulatori specialisti in nefrologia. La mancanza di un follow-up più lungo tra i responder era dovuta al recente inizio della terapia (n=6), alla perdita del follow-up (n=3), alla mancanza di dati sul follow-up per il mese 18 (con buoni risposta al mese 24, n=1) e l'inizio dell'emodialisi (n=1). Almeno una misurazione dei linfociti B è stata eseguita in ogni paziente dopo l'esaurimento dei linfociti B e questi sono risultati negativi. I record del dipartimento di neurologia dell'Hannover Medical School sono stati sottoposti a screening per i pazienti trattati con deplezione dei linfociti B con rituximab dal 2012 per 24 mesi o più. Sono stati esclusi i pazienti con reperti di biopsia renale indicativi di vasculite(n=2). Dei 65 pazienti identificati, 13 avevano una velocità di filtrazione glomerulare stimata (eGFR) di 70 ml/min/1,73 m2 o meno all'inizio della terapia e sono stati inclusi in questa analisi.

I valori di laboratorio ottenuti presso la Hannover MedicalSchool sono stati registrati prima dell'inizio del trattamento con rituximab e successivamente agli intervalli indicati. L'eGFR è stato calcolato utilizzando il ChronicRenePatologiaFormula Epidemiology Collaboration (CKD-EPI),25 le proteinuria sono state misurate mediante analisi con dipstick nella coorte neurologica e come rapporto proteine/creatinina in campioni di urine spot nei pazienti nefrologici.

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2.2|Analisi dei dati dell'array genico

L'espressione tubulointerstiziale di LTB e CXCL13 è stata analizzata in set di dati pubblici dalla coorte europea di cDNAbank, dalla rete di studio sulla sindrome nefrosica e dal consorzio di ricerca clinica sulla vasculite26 ottenuti presso l'NCBI (GSE104948 e GSE104954).

2.3|Immunocolorazione, analisi confocale e quantificazione dell'infiltrato di cellule B nella glomerulopatia membranosa

In tutte le biopsie disponibili e in un campione di nefrectomia da un paziente con ossalosi, è stata eseguita l'immunocolorazione con anti-CD20 (1:50; clone L26; Agilent) di sezioni di biopsia renale da 3 µm decerate e reidratate e incluse in paraffina condotto per 90 minuti dopo il recupero dell'epitopo indotto dal calore con tampone di acido T-etilendiamminotetra-acetico (pH 9,0, sistemi Zytomed), attività della perossidasi endogena (3% H2O2) e blocco delle proteine ​​(Zytomed). I controlli negativi che omettevano gli anticorpi primari sono stati inclusi in tutti i protocolli di colorazione. Per il rilevamento, il sistema polimerico di perossidasi di rafano ZytoChem Plus (topo/coniglio; Zytomed) è stato utilizzato prima del cromogeno 3,3'-diaminobenzidina (Zytomed) e la colorazione di contrasto mediante emalum. I vetrini in campo chiaro colorati per CD20 sono stati scansionati con un ingrandimento originale di 40× (Aperio CS2, LeicaMicrosystems). L'area immunocolorata è stata quantificata con un approccio basato su apixel con una soglia impostata in modo interattivo utilizzando una piattaforma di analisi delle immagini open source (QuPath, versione 0.1.2, https://qupath.github.io/).27 La stessa soglia è stata utilizzata per tutti sezioni. Ciascuna sezione è stata controllata per la qualità della colorazione, la soglia e la correttezza dell'annotazione da due patologi in cieco per la colorazione, la diagnosi e il caso. Gli artefatti (p. es., pieghe dei tessuti, irregolarità cromogeniche) sono stati esclusi dall'analisi. I gruppi sono stati divisi per densità delle cellule B sopra e sotto la mediana all'inizio della terapia.

I campioni selezionati sono stati colorati per l'imaging confocale utilizzando l'antitopo di capra secondario AF488 (Invitrogen) e l'anti SMA coniugato con Cy3 (1A3, Sigma). È stato applicato il controcolorante nucleare 4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, Invitrogen) e i vetrini sono stati montati su supporti di montaggio immunoselectantifading (Dianova). Le immagini sono state ottenute con un microscopio laser confocale Leica TCS SP8 e un obiettivo multi-immersione 20× (Leica). L'analisi è stata condotta con NIH ImageJ e GIMP (versione 2.8)

2.4|Statistiche

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando Prism 8. I dati sono espressi come media ± SEM. Il test per la distribuzione gaussiana è stato eseguito utilizzando il test di D'Agostino e Pearson. Due variabili sono state confrontate utilizzando t-test o Kruskal-Wallistest per campioni non distribuiti normalmente. I confronti multipli sono stati eseguiti utilizzando l'ANOVA a una via con i test di confronto multiplo di Dunn o Dunnett come indicato. La regressione multivariata è stata eseguita utilizzando SAS 9.4 (SAS Institute). valori di p inferiori a .05 sono stati considerati significativi, i valori di p sono indicati come segue:*p < .05,="" **p="">< .01,="" ***p=""><>

3|RISULTATI

3.1|Infiltrati delle cellule B e mediatori dell'organizzazione dei tessuti linfoidi nella malattia del rene umano

L'immunocolorazione per il marcatore delle cellule B CD20 e il marcatore strutturale SMA è stata valutata in biopsie renali umane con nefropatia membranosa (Figura 1A). Confermando i risultati precedenti di infiltrati di cellule B,9,10 ha inoltre rivelato strutture organizzate, che sono conformi alla definizione di TLS.

Per affrontare una gamma più ampia di malattie renali, i mediatori della formazione di TLS CXCL131,8 e la linfotossina B (LTB)7,9 nell'interstizio renale sono stati analizzati in set di dati di espressione genica da 195 biopsie umane (Figura 1B, C26). Prevedibilmente, entrambi sono aumentati in condizioni altamente infiammatorie come glomerulonefrite a mezzaluna, lupus eritematoso sistemico renale e nefropatia da IgA rispetto ai reni sani di donatori di organi viventi. Inoltre, c'è stato anche un aumento significativo di condizioni più croniche tra cui la nefropatia diabetica e la glomerulopatia membranosa.

Queste misurazioni sono coerenti con la presenza di strutture linfoidi terziarie nell'uomorenepatologia, vale a dire glomerulopatia membranosa.

3.2|Gli infiltrati dei linfociti B nella glomerulopatia membranosa si associano a una ridotta funzione renale escretoria

Per studiare la rilevanza funzionale dell'infiltrazione delle cellule B nella nefropatia membranosa, abbiamo valutato la loro estensione mediante l'analisi dell'immagine assistita digitalmente (Figura 2A, B). I pazienti sono stati divisi in base all'abbondanza di infiltrati di cellule B all'inizio della terapia di deplezione delle cellule B. La proteinuria, una delle principali manifestazioni della glomerulopatia membranosa, non differiva significativamente tra i gruppi (Figura 2C), nordide lo stadio della glomerulopatia membranosa (2,1 ± 0.8 vs.2.5 ± 0.7, p{{10 }} .3, prova di Mann-Whitney). Tuttavia, infiltrati più abbondanti di cellule B nel tessuto renale sono associati a un escretore significativamente peggiorerenefunzione(Figura 2D).

Ciò suggerisce l'ipotesi che gli infiltrati di cellule B possano essere funzionalmente rilevanti oltre l'induzione della proteinuria.

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3.3|Effetto della deplezione delle cellule B a lungo termine nella glomerulopatia membranosa

Successivamente abbiamo studiato le conseguenze funzionali della deplezione dei linfociti B a lungo termine in questa coorte di nefropatia membranosa. Nel nostro istituto di cure terziarie, 35 pazienti con glomerulopatia membranosa sono stati trattati con deplezione dei linfociti B, hanno avuto un follow-up di almeno 12 mesi e una GFR iniziale superiore 15 ml/min/1,73 m2 e sono stati inclusi in questa analisi. Simile ai rapporti precedenti, l'80% ha ridotto la proteinuria di oltre il 25% entro 12 mesi dalla prima somministrazione di rituximab ed è stato classificato come responder secondo la definizione dello studio MENTOR21 (Tabella 1). La diminuzione della proteinuria nei responder era rilevabile dopo 6 mesi di esaurimento delle cellule B (Figura 3A).

Se l'accumulo di cellule B è fisiopatologicamente rilevante, l'esaurimento a lungo termine dovrebbe migliorare l'eGFR oltre gli effetti sulla proteinuria. Infatti,funzione renalequantificato da eGFR è migliorato, ma ha raggiunto la significatività solo dopo 18 mesi (Figura 3B). Abbiamo ulteriormente affrontato i fattori clinici che possono influenzare il recupero funzionale renale. La sospensione dell'inibitore della calcineurina può migliorare l'eGFR e questi farmaci sono stati prescritti al 54% della nostra coorte diverse volte prima della somministrazione di rituximab. Tuttavia, questa terapia non si associava significativamente al recupero della funzione renale escretoria (Tabella 2). Il marcato ritardo nel miglioramento dell'eGFR contrasta anche con gli effetti emodinamici.

Pregressa immunosoppressione ed età, sia alla diagnosi che alla prima deplezione dei linfociti B, associati negativamente al recupero renale. Miglioramento in eGFR significativamente correlato inversamente con l'età alla diagnosi (Figura 3C). L'età e le terapie precedenti, ma non il tempo dalla diagnosi all'esaurimento dei linfociti B, sono rimasti un fattore significativo nell'analisi di regressione lineare multivariata (Tabella 3).

Questi risultati dimostrano un miglioramento funzionale con l'esaurimento a lungo termine dei linfociti B per la glomerulopatia membranosa nell'uomo.

3.4|Miglioramento della funzione renale con deplezione a lungo termine dei linfociti B in CKD di origine sconosciuta

Infiltrati di cellule B sono stati trovati in una varietà di malattie renali oltre alla nefropatia membranosa. Come esempio di mediato non primariamente da anticorpirene patologia, abbiamo rilevato un grande organo linfoide terziario compreso il centro agerminale in un campione di nefrectomia da un paziente con ossalosi (Figura 4A). Se funzionalmente rilevante, la loro rimozione dovrebbe essere di beneficio oltre la malattia autoimmune ben definita.

Per iniziare ad affrontare questa ipotesi, abbiamo studiato i pazienti ricoverati eGFR che ricevono deplezione cronica dei linfociti B per condizioni neurologiche con un eGFR di 70 ml/min/1,73 m2 o meno. Come dettagliato nei metodi, sono stati esclusi i pazienti con una diagnosi formale di malattia renale, vale a dire glomerulonefrite. Le caratteristiche cliniche e di laboratorio sono mostrate nella Tabella 4. L'eGFR è aumentato significativamente dopo due anni di terapia (Figura 4B). L'aumento è molto probabilmente anche sottovalutato a causa del miglioramento della funzione neurologica e della massa muscolare.

Questi dati suggeriscono che l'esaurimento cronico dei linfociti B potrebbe conferire un effetto benefico nella CKD (Cronicorenepatologia)indipendente da una specifica entità patologica.

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4|DISCUSSIONE

I nostri dati dimostrano un miglioramento inrenefunzionecon deplezione a lungo termine dei linfociti B. Dato che gli infiltrati di cellule B organizzati si sviluppano in una serie di malattie renali di varie eziologie, questi risultati incoraggiano le loro ulteriori indagini come bersagli terapeutici oltre alle malattie autoimmuni.

Nella glomerulopatia membranosa, abbiamo osservato un miglioramento dell'escrezionerenefunzionedopo 18 mesi di deplezione delle cellule B. Ciò è in accordo con altri rapporti.28-31 Il miglioramento di NoeGFR è stato riportato nei partecipanti allo studio MENTOR trattati con rituximab.21 Tuttavia, questi pazienti hanno ricevuto l'ultimo ciclo di deplezione dei linfociti B nel mese 6 dello studio. Considerazioni simili valgono per lo studio GEMRI TUX, che ha riportato una funzione renale escretoria stabile dopo 6 mesi22 e la dose singola di rituximab somministrata nello studio STARMEN.32 Ciò sottolinea la necessità di osservazioni estese del successo terapeutico nella nefropatia membranosa dopo la deplezione dei linfociti B. I nostri dati da pazienti con insufficienza renale cronica (Cronicorenepatologia)di origine sconosciuta propongono che ciò possa applicarsi anche ad altre forme di malattia renale, come suggerito da modelli sperimentali murini. Per estendere gli approcci terapeutici oltre l'esaurimento dei linfociti B è necessaria una migliore comprensione dei meccanismi di formazione dei TLS, inclusa l'interazione con i vasi sanguigni e i segnali organo-specifici1,9,16.

I regimi terapeutici nella nefropatia membranosa si sono sviluppati rapidamente negli ultimi anni.20,33 Il tasso di risposta della proteinuria nella nostra coorte di cure terziarie corrisponde a rapporti simili28,29,34 ed era più alto che in altri, che hanno ricevuto dosi inferiori di rituximab.30,35 In accordo con i precedenti studi, nessuna singola caratteristica clinica è associata alla risposta della proteinuria al rituximab. È importante sottolineare che, simile alla maggior parte dei rapporti36 ma non a tutti i rapporti,35 un GFR più basso non ha influenzato negativamente la risposta alla proteinuria, età nordide avanzata.37 La nostra attuale analisi è limitata da misurazioni PLA2R incomplete, che sono state associate alla risposta della proteinuria nella glomerulonefrite membranosa.22,35,38 I farmaci concomitanti, inclusi i corticosteroidi somministrati anche con le infusioni di rituximabin, possono aver influenzato la risposta. La sospensione dell'inibitore della calcineurina può migliorare in modo acuto la funzione renale, come riportato per la nefropatia membranosa nel MENTORtrial e altri.21,31,39 Gli inibitori della calcineurina fanno parte di approcci immunosoppressivi combinati anche nella nefropatia membranosa grave.31,32 Sono noti per promuovere la fibrosi renale.40,41 È rassicurante che non abbiano precluso il recupero renale a lungo termine nei pazienti della nostra coorte. Nel complesso, le nostre osservazioni rafforzano ulteriormente l'evidenza di un'efficace riduzione della proteinuria e di un basso tasso di eventi avversi durante l'esaurimento dei linfociti B per la glomerulopatia membranosa primaria.

L'invecchiamento ha influenzato negativamente la rigenerazione renale in numerosi studi sperimentali e clinici.42-44 I reni biologicamente invecchiati sono sfidati a fornire sufficienti divisioni cellulari per la rigenerazione funzionale. Inoltre, un aumento dell'invecchiamento glomerulare è stato descritto nella malattia glomerulare, inclusa la glomerulopatia membranosa.42,45 Sebbene non siamo consapevoli del fatto che una correlazione negativa tra età e rigenerazione sia stata segnalata in precedenza nella glomerulopatia membranosa, i nostri dati concordano con i risultati di pazienti con sindrome nefrosica dovuta a altre eziologie tra cui la malattia modificata minima e la glomerulosclerosi focale e segmentale.46 In questo caso, è stato osservato un miglioramento dell'eGFR dopo 1 anno di deplezione dei linfociti B esclusivamente nei pazienti più giovani, principalmente bambini. I nostri dati sostengono un fattore dipendente dall'età nella rigenerazione dopo una terapia di successo anche nella glomerulopatia membranosa. La nostra coorte di responder comprendeva pazienti di età compresa tra 28 e 73 anni alla diagnosi e tra 33 e 77 anni alla prima terapia con rituximab, con un tempo di ritardo tra la diagnosi e la deplezione dei linfociti B di 0-318 mesi (in media 77 mesi). Questi valori sono prevedibilmente fortemente correlati. L'ampia fascia di età ci ha permesso di iniziare a esplorare se un ritardo nella terapia abbia contribuito a un miglioramento alterato della GFR. I nostri dati non indicano un effetto deleterio della terapia ritardata con rituximab.

Il nostro studio è anche limitato dal fatto che c'erano troppo pochi pazienti con materiale bioptico per la colorazione dei linfociti B e il follow-up a lungo termine per un'associazione quantitativa con l'entità della risposta eGFR (n=7). Abbiamo impiegato la quantificazione computerizzata dell'intero vetrino per ottenere le massime informazioni sull'abbondanza di cellule B nel rene. Tuttavia, data la loro natura dispersa, anche un nucleo bioptico completo potrebbe non riflettere l'estensione totale. I progressi nell'imaging e possibilmente nei mezzi di contrasto antigene-specifici potrebbero fornire nuovi approcci per quantificare e monitorare longitudinalmente gli infiltrati di cellule B nella malattia renale in futuro.

In sintesi, i nostri dati propongono un'ulteriore motivazione per l'uso dell'esaurimento a lungo termine dei linfociti Brenemalattiedall'interruzione delle strutture locali dominate dai linfociti B. Per convalidare questo approccio sono necessari studi controllati estesi, comprese valutazioni istologiche seriali. I nostri risultati possono incoraggiare l'analisi sistematica dello sviluppo renalefunzionale in ulteriori coorti.

RINGRAZIAMENTI

Riconosciamo il supporto della preparazione dei dati dell'array di ingene di genomica dell'unità centrale di MHH e della microscopia laser dell'unità centrale, D. Kijas ed E. Christians con immunocolorazione. SvV è stato supportato da Deutsche Forschungsgemeinschaft.

CONTRIBUTI D'AUTORE

Susanne V. Fleig, Christoph Schröder, Hermann Haller, Thomas Skripuletz e Sibylle von Vietinghoff hanno progettato la ricerca. Susanne V. Fleig, Franz Felix Konen, ChristophSchröder, Jessica Schmitz, Stefan Gingele, Jan HinrichBräsen e Svjetlana Lovric hanno acquisito i dati. Franz FelixKonen, Christoph Schröder, BMWS e Sibylle vonVietinghoff hanno analizzato i dati. Susanne V. Fleig, Franz FelixKonen, Christoph Schröder e Sibylle von Vietinghoff hanno scritto il manoscritto con l'aiuto di tutti i coautori, tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto.

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Da: 'L'esaurimento a lungo termine dei linfociti B si associa alla rigenerazione della funzione renale' diSusanne V. Fleig, et al

---Immun Inflamm Dis. 2021;9:1479–1488.

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