Macroautofagia e mitofagia nelle malattie neurodegenerative: focus sugli interventi terapeutici, parte 2

2. Mitofagia

I mitocondri ospitano una doppia membrana, composta da una membrana mitocondriale interna (IMM) e una membrana mitocondriale esterna (OMM), separate dallo spazio intramembrana.

La membrana mitocondriale interna è una componente importante della cellula. La sua funzione principale è generare l'energia richiesta dalla cellula e controllare il metabolismo dell'intera cellula. La moderna ricerca biologica mostra che la membrana mitocondriale interna è anche strettamente correlata alle capacità cognitive umane, in particolare alla memoria.

Le molecole della membrana mitocondriale interna contengono anche alcuni componenti legati alla cognizione e al sistema nervoso, come proteine ​​di membrana e sistemi di fosforilazione ossidativa. Questi componenti sono direttamente coinvolti nel processo metabolico delle cellule cerebrali e il loro stato di attività influenzerà la normale funzione dei neuroni, influenzando così la cognizione e la memoria umana.

Inoltre, anche una molecola chiamata trasportatore mitocondriale nella membrana mitocondriale interna svolge un ruolo importante nell'immagazzinamento e nel richiamo della memoria. Questa molecola può aiutare i neuroni a trasmettere segnali chimici tra le sinapsi e rafforzare la connettività delle sinapsi, ottenendo così una conservazione a lungo termine e un accurato richiamo della memoria.

In sintesi, la connessione tra la membrana mitocondriale interna e le capacità cognitive e la memoria è stata verificata scientificamente da tempo. L'ottimizzazione dello stato metabolico della membrana mitocondriale interna aiuta a migliorare l'efficienza lavorativa del cervello e migliora le capacità cognitive e di memoria delle persone. Pertanto, possiamo promuovere la salute della membrana mitocondriale interna adattando adeguatamente la nostra dieta, facendo esercizio fisico e mantenendo un buon atteggiamento, migliorando così la nostra memoria e le capacità cognitive. Si vede che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentando i livelli di acetilcolina e di fattori di crescita, che sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l'apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello ottenga nutrimento ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Questa configurazione di organelli è essenziale per mantenere un gradiente elettrochimico, consentendo ai mitocondri di generare la quantità necessaria di ATP per essere utilizzata dalle cellule [77]. L'eliminazione dei mitocondri difettosi è un meccanismo di controllo di qualità essenziale per sostenere un pool sano di mitocondri e mantenere una vita vitale. rete nelle cellule neuronali [78].

Queste cellule sono più sensibili ai difetti mitocondriali a causa delle loro elevate esigenze metaboliche; pertanto, l'eliminazione selettiva degli organelli disfunzionali è vitale per una neurotrasmissione affidabile.

I mitocondri che sono irreversibilmente danneggiati o diventano non più efficienti vengono eliminati dalla mitofagia, un meccanismo selettivo in cui recettori specializzati riconoscono i mitocondri difettosi e mediano il carico mirato alle vescicole autofagiche [79]. Le cellule utilizzano diversi metodi per riciclare i mitocondri difettosi, vale a dire percorsi ubiquitina-dipendenti e indipendenti.

Principalmente, le cellule neuronali ricorrono al sistema di meccanismi ubiquitina-dipendenti controllato dalla chinasi 1 (PINK1)/Parkin indotta da PTEN per preservare un pool attivo e dinamico di mitocondri.

PINK1 è una proteina amitocondriale il cui accumulo nell'OMM funge da sensore per il mantenimento della funzione mitocondriale poiché segnala la degradazione dei mitocondri danneggiati [80].

PINK1 mostra una sequenza mirata ai mitocondri, quindi viene importato sistematicamente nell'IMM complessandosi con le traslocasi della membrana esterna 20 e 40 (TOM20 e TOM40) [81], dove viene tagliato dalla serina proteasi intramembrana presenilina associata a forma di romboide (PARL) [ 82] e quindi mantenuto a bassi livelli in condizioni sottofisiologiche.

A un dato danno, le interazioni molecolari tra TOM20/40 e PINK1 diminuiscono e PINK1 si raggruppa nell'OMM dei mitocondri danneggiati, promuovendo la fosforilazione di Parkin e il suo successivo reclutamento [83].

La parkina, un'ubiquitina ligasi citosolica E3, ubiquitina una miriade di proteine ​​dell'OMM, riconosciute da recettori come p62, denominato anche sequestosoma 1 (SQSTM1). p62/SQSTM1 è il recettore legante l’ubiquitina responsabile del trasporto dei mitocondri ubiquitinati al sito di assemblaggio dell’autofagosoma interagendo con i recettori LC3/GABARAP della famiglia ATG8 [84].

Questi recettori riconoscono anche i motivi LIR di molte proteine ​​OMM per il targeting specifico dei mitocondri danneggiati nel sito di assemblaggio dell'autofagosoma [85]. Nelle cellule neuronali, la mitofagia ubiquitina-indipendente è orchestrata da due proteine ​​bifunzionali, BCL2 e la proteina 3 interagente con l'adenovirus E1B da 19 kDa. (BNIP3L) e BNIP3-come la proteina X (NIX), è anche responsabile della differenziazione delle cellule gangliari della retina (RGC). BNIP3 e NIX contengono un dominio BH3 e si trovano principalmente nell'OMM.

Queste proteine ​​hanno un motivo simile a WXXL con un'affinità per LC3 e il suo omologo GABARAP, guidando i mitocondri verso le vescicole autofagiche. Durante la neurogenesi retinica avviene uno spostamento metabolico, accompagnato da un aumento dell'espressione di entrambe le proteine ​​[86].

L'attività NIX può essere mediata aumentando i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in diverse linee cellulari [87], aggiungendo un nuovo livello di complessità oltre alle funzioni di sviluppo. Infatti, la produzione di ROS aumenta come conseguenza dei mitocondri danneggiati [88] e può indurre mitofagia [88]. NIX può anche regolare la traslocazione di Parkin nei mitocondri dopo uno stimolo depolarizzante, come CCCP [87].

Inoltre, la mitofagia regolata da BNIP3L e NIX hanno funzioni neuroprotettive. In un modello di ischemia cerebrale, la degradazione selettiva dei mitocondri mediata da queste proteine ​​era cruciale per la sopravvivenza e la funzione neuronale [89]. Inoltre, la sola sovraespressione di NIX è sufficiente a ripristinare i difetti mitofagici osservati nelle linee cellulari derivate da pazienti con PD [90].

La proteina 1 contenente il dominio Fun14 (FUNDC1) è una proteina OMM che interagisce con LC3 e GABARAP e media la mitofagia in condizioni ipossiche. A livelli omeostatici, la mitofagia dipendente da FUNDC1- è repressa dalla fosforilazione mediata dalla chinasi Src nella porzione del motivo LIR in Tyr18.

In uno stato ipossico, la ridotta attività di Src determina la defosforilazione di FDUNC1 Tyr18, facilitando la sua interazione con LC3 e la successiva mitofagia [91]. Inoltre, la fosforilazione di ULK1 guidata dall’ipossia da parte di AMPK a Ser555 favorisce la traslocazione di ULK1 nei mitocondri, migliorando l’attività di FUNDC1 [92]. Inoltre, l’Optineurina (OPTN) è un recettore citosolico situato nell’OMM che promuove la mitofagia attraverso la sua interazione con LC3 [93].

È interessante notare che la disfunzione di OPTN è associata a malattie neurodegenerative, così come ad altre patologie [94]. Nel complesso, la mitofagia costituisce un meccanismo di controllo di qualità essenziale per il mantenimento del metabolismo neuronale e dell'omeostasi.

Il trasporto dei mitocondri all'interno dei neuroni si basa su movimenti anterogradi e retrogradi ed è essenziale per soddisfare i requisiti energetici e metabolici lungo la struttura neuronale. Questi movimenti sono essenziali anche per la riparazione e la degradazione mitocondriale e sono assistiti da proteine ​​adattatrici di trasporto (Figura 3).

3. Autofagia e malattie neurodegenerative

3.1. Morbo di Alzheimer

L’AD è una malattia neurodegenerativa e la forma di demenza più diffusa nella popolazione anziana, che colpisce quasi 50 milioni di persone in tutto il mondo [95]. La DA familiare a esordio precoce (EOAD, fAD) rappresenta meno del 5% dei casi e si sviluppa prima dei 65 anni.

Mutazioni autosomiche dominanti in tre geni sono state associate all'EOAD: il gene della proteina precursore dell'amiloide (APP) e i geni presenilina-1 (PSEN1) e presenilina-2(PSEN2), subunità del complesso -secretasi [ 95]. Tuttavia, la forma più comune è la forma sporadica di AD a esordio tardivo (LOAD, sAD) con una prevalenza superiore al 95% e con eziologia sconosciuta.

La neuropatologia dell'AD è caratterizzata da un progressivo deterioramento cognitivo e declino della memoria, che è stato correlato con la presenza di deposizione extracellulare di placche amiloidi (A, aggregazione di peptidi β-amiloidi) e grovigli neurofibrillari intraneuronali (NFT, aggregazione della proteina tau iperfosforilata) che compromettono le sinapsi. integrità e omeostasi, portando a danni irreversibili in specifiche regioni del cervello come l’ippocampo e la corteccia [96].

I peptidi A sono generati dall'elaborazione proteolitica sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) da parte dell'enzima 1/-secretasi (BACE1) e della -secretasi che taglia l'APP attraverso la via amiloidogenica. La scissione dell'APP da parte di BACE1, la cui attività è elevata nel cervello di pazienti con AD sporadici [97], si verifica principalmente negli endosomi, fornendo un ambiente acido per un'attività enzimatica ottimale [98].

Il traffico intracellulare di APP avviene attraverso vie secretorie ed endocitiche. L'APP viene secreta nella membrana plasmatica e poi internalizzata mediante endocitosi mediata da clatrina o mediata da caveolina [99].

Negli endosomi, l'APP può essere scissa da BACE1 dando origine al frammento APP N-terminale (sAPP) e al frammento C-terminale; quest'ultimo può subire un'ulteriore scissione da parte della -secretasi, con conseguente formazione di A e del dominio intracellulare APP. Nella via non amiloidogenica, l'APP viene scissa dalla -secretasi al centro del dominio A, prevenendo la formazione dei peptidi A.

La scissione da parte della -secretasi avviene in diverse posizioni del frammento C-terminale, determinando la formazione di peptidi A di diversa lunghezza. I peptidi solubili più comunemente formati sono A 1-38 e A 1-40, seguiti da A 1-42, quest'ultimo essendo più idrofobo e più incline a formare oligomeri trimerici e tetramerici, rappresentando quindi l'isoforma più tossica [100].

Un oligomero tende a formare fibrille A con fogli pieghettati che si assemblano a livello extracellulare in placche amiloidi [101]. A è stato anche associato all'iperfosforilazione e all'aggregazione della tau, una proteina associata ai microtubuli che normalmente assiste nella polimerizzazione e nell'assemblaggio dei microtubuli assonali e nel trasporto delle vescicole.

Lo stato di fosforilazione del tauis è regolato da distinte chinasi e fosfatasi che sono modulate in presenza di oligomeri A; ad esempio, la glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK3) e la proteina fosfatasi 2A (PP2A) regolano direttamente lo stato di fosforilazione della tau [102]. Lo stato iperfosforilato della tau inibisce la sua associazione con i microtubuli, influenzandone la stabilizzazione e portando al disassemblaggio della rete di microtubuli [103,104].

La scissione proteolitica della tau iperfosforilata innesca la formazione di oligomeri di tau [105] che sono più tossici degli aggregati, portando alla progressiva morte neuronale [106].

3.1.1. Compromissione dell'autofagia nell'AD

Nell'AD sono stati segnalati distinti meccanismi patogeni molecolari derivanti dall'accumulo di oligomeri A e dall'iperfosforilazione di tau, vale a dire disfunzione mitocondriale [107,108] e interruzione dei sistemi di proteostasi, come la risposta proteica non ripiegata e l'autofagia [109].

Sebbene i peptidi A presentino un motivo correlato a KFERQ, che è importante per il normale processamento e la degradazione dell'APP, questi frammenti non sono substrati per la degradazione del CMA [110] e la macroautofagia assiste nella loro eliminazione [111].

In effetti, la macroautofagia svolge un ruolo importante nel metabolismo A perché è coinvolta nella degradazione e nell’eliminazione dell’APP [112] e dei suoi prodotti di scissione, tra cui A [113] e APP-CTF (frammento C-terminale clivato della proteina precursore dell’amiloide) [114].

La disfunzione dell'autofagia è stata dimostrata sia nei pazienti con AD che nei modelli animali. Nel cervello dei pazienti con AD, è stato osservato un accumulo di vescicole autofagiche immature contenenti tau filamentosa nei neuriti distrofici [115].

Queste vescicole autofagiche si trovano spesso nelle regioni prossimali delle placche amiloidi nel cervello dei pazienti e dei modelli di roditori [116]. Curiosamente, l’accumulo di autofagosomi è stato osservato anche nei dendriti e nel soma dei neuroni di topo transgenico APP/PS1 anche prima della comparsa delle placche A [117]. Inoltre, è stato osservato un accumulo di vescicole autofagiche immature prima della perdita neuronale nell’ippocampo del modello murino PS1M146L/APP751SL [118].

L’accumulo anomalo di autofagosomi nei neuroni suggerisce che il difetto della via autofagico-lisosomiale contribuisce all’accumulo di oligomeri A e tau nell’AD [117]. APP e PSEN1 si localizzano negli autofagosomi; quindi, un accumulo di questi organelli è associato ad un aumento della generazione A, che a sua volta disturba le membrane degli autofagosomi [115].

Di conseguenza, gli autofagosomi immaturi descritti nel cervello di AD e nei topi transgenici APP/PS1 possono costituire un'altra fonte per la generazione A. I cervelli dei pazienti PSEN1-EOAD mostrano un danno lisosomiale associato alla patologia amiloide e alla neurodegenerazione [119].

È stato suggerito che l'accumulo di autofagosomi potrebbe derivare da una compromissione della fusione autofagosoma-lisosoma o da una digestione difettosa dei lisosomi [120]. Gli studi hanno mostrato un'alterazione dell'inizio dell'autofagia, in particolare una diminuzione dell'espressione di Beclin 1 nella corteccia di pazienti con AD e modelli murini [121] . L’aumentata attività della caspasi 3 nei pazienti con AD potrebbe spiegare l’eccessiva scissione di Beclin 1 [122].

La riduzione genetica di Beclin 1 in un modello murino transgenico di AD che esprime APP umana ha aumentato l'accumulo di A, mentre la sovraespressione di Beclin 1 ha ridotto significativamente i livelli di A [113]. Oltre a Beclin-1, altre proteine ​​ATG sono state sottoregolate in un'età- modo dipendente, con conseguente accumulo di A [123]. ATG7, una proteina chiave nella regolazione dell'autofagia, era implicata nella patologia dell'AD.

Si è scoperto che i livelli di ATG7 erano ridotti nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo di un modello murino di AD, ma non sono stati rilevati cambiamenti nelle cortecce temporali dei pazienti con AD [124]; I topi knockdown ATG7 hanno mostrato una riduzione della secrezione di A accompagnata da un aumento di A intracellulare [125], che supporta ulteriormente un ruolo di ATG7 nel trasporto dei peptidi A ai corpi multivescicolari da secernere.

È stato dimostrato che l'espressione di p62 è diminuita in un modello di topo transgenico triplo, compromettendo le fasi iniziali dell'autofagia selettiva nell'AD [126]. Tuttavia, un'analisi dell'intero genoma ha rivelato una sovraregolazione trascrizionale dei regolatori positivi dell'autofagia nell'AD.

Coerentemente con l’attivazione dell’autofagia, nelle fasi iniziali dell’AD sono stati osservati una sovraregolazione dei livelli della proteina ATG e un tasso più elevato di formazione di autofagosomi e di biogenesi lisosomiale [127]. Questa controversia suggerisce un'autofagiregolazione differenziale nelle fasi iniziali e tardive dell'AD, che dovrebbe essere considerata quando si valuta il meccanismo in diversi modelli e quando si cercano strategie terapeutiche.

La presenza di autofagosomi immaturi nei neuriti distrofici suggerisce che il trasporto retrogrado delle vescicole correlate all'autofagia e la loro maturazione sono compromessi nell'AD [128]. A sostegno di ciò, l’inibizione del rilascio degli autofagosomi ai lisosomi porta al loro accumulo in neuriti con morfologia simile, come descritto nell’AD [64].

Gli oligomeri A possono interrompere il complesso dineina-snapina, compromettendo il trasporto delle vescicole assonali, il che potrebbe contribuire al rilascio difettoso degli autofagosomi alla lisosoma AD [129]. La degradazione del tau, che è localizzato principalmente negli assoni e meno negli inneuriti e nel soma, avviene attraverso il proteasoma o la macroautofagia, a seconda del suo stato di soligomerizzazione.

Le modificazioni tau associate all'AD guidano la sua degradazione attraverso la macroautofagia quando la proteolisi mediata dal proteasoma viene compromessa dalla progressione della malattia [130]. È rilevante notare che la degradazione della tau può produrre diversi frammenti che si legano all'Hsc70 che viene indirizzato alla LAMP-2A dalla CMA [131,132].

Tuttavia, l’accumulo di questi frammenti nella membrana lisosomiale provoca l’aggregazione di tau, che compromette l’integrità lisosomiale e blocca l’APLV [132]. La compromissione della via autofagico-lisosomiale determina l’aggregazione degli oligomeri tau, che, a loro volta, vengono degradati quando la macroautofagia viene indotta con la rapamicina [132,133].

Tau è essenziale per il movimento retrogrado degli autofagosomi verso i lisosomi attraverso la stabilizzazione dei microtubuli, un ruolo compromesso nell'AD [134]. L'iperfosforilazione della tau e la sua oligomerizzazione determinano lo spostamento del meccanismo dei microtubuli e di conseguenza la compromissione del movimento e della maturazione dell'autofagosoma, che contribuisce anche alla disfunzione dell'autofagia.

Oltre ai difetti nel trasporto autofagosoma, nell'AD è stata descritta anche una compromissione della funzione lisosomiale. PSEN1 è un regolatore della funzione lisosomiale che agisce come chaperone per l'ATPasi vacuolare che acidifica il lume lisosomiale. Mutazioni nell'acidificazione lisosomiale ridotta di PSEN1 e nella fusione autofagosoma-lisosoma, con conseguente accumulo di autofagosomi caricati con A [135].

Inoltre, è stato suggerito che la proteolisi lisosomiale sia influenzata nell'AD; alti livelli di proteine ​​A, LC3-II e proteine ​​ubiquitinate erano presenti sia nelle frazioni lisosomiali che autofagosomiche isolate dal modello murino transgenico AD [136]. Coerentemente con ciò, l’interruzione della proteolisi lisosomiale mediante l’inibizione delle catepsine lisosomiali nei neuroni sani determina l’accumulo di vescicole autofagiche con morfologia simile a quelle presenti nei pazienti con AD e nei modelli murini transgenici [64].

A compromette anche l’integrità della membrana lisosomiale, determinando il rilascio di catepsine nel citoplasma [137,138]. La presenza di catepsina D negli esosomi isolati dal sangue di pazienti preclinici con AD [139] supporta l'ipotesi di una funzione lisosomiale inefficace. Curiosamente, le variazioni genetiche nel gene codificante la catepsina D sono state descritte anche come fattori di rischio per l'AD [140].

L'analisi del processo autofagico nei neuroni dalle fasi iniziali a quelle più recenti dell'AD ha mostrato un'aumentata espressione dei geni dell'autofagia nelle fasi iniziali, ma il difetto di clearance lisosomiale ha comportato l'accumulo di strutture autolisosomiali con la progressione della malattia [141]. Le sirtuine (SIRT) comprendono un gruppo di proteine ​​dipendenti dalla nicotinammide adenina dinucleotide (NAD+) che sono regolatori di molteplici vie cellulari.

Tra questi, Sirt1 è stato associato alla regolazione dell'autofagia. Livelli più bassi di SIRT1 compromettono l'attivazione mediata dalla deacetilazione delle proteine ​​​​dell'autofagia a valle (ad esempio, ATG5, ATG7 e LC3) [142], che può anche contribuire alla compromissione dell'autofagia nell'AD. I livelli di SIRT1 sono diminuiti nella corteccia parietale dei pazienti cerebrali con AD e sono correlati all'accumulo di grovigli A e tau [143].

L'attivazione di mTOR, il coordinatore centrale dell'autofagia, è stata descritta nell'AD in risposta all'accumulo di A [144]. A aumenta l'attività di mTOR, che si traduce anche in un'espressione più elevata di tau e in una fosforilazione mediata da GSK3 - [145], supportando un ruolo per la patogenesi mediata da mTORin tau. Inoltre, nel cervello dei pazienti con AD è stata osservata la secrezione di fosfo-tau attraverso vescicole esocitotiche mediante la segnalazione mTOR [146].

Anche la disregolazione del percorso PI3K/Akt/mTOR è stata implicata nella patogenesi dell'AD [147]. L'attivazione di PI3K da parte di fattori di crescita (ad esempio, fattore di crescita insulino-simile-1, IGF1) promuove la fosforilazione di Akt e l'attivazione indiretta di mTORC1, promuovendo l'autofagia. Nell'AD, A interagisce e inibisce la via PI3K/Akt/mTOR [148], portando all'attivazione di GSK3 e ad un aumento dell'iperfosforilazione di tau.

Inoltre, il fattore di trascrizione EB (TFEB), il principale regolatore della biogenesi dei lisosomi, è un bersaglio a valle di mTORC1. Una diminuzione dell’attività di mTORC1 induce la defosforilazione del TFEB e la sua traslocazione nel nucleo per attivare l’espressione dei geni correlati all’autofagia e alla biogenesi lisosomiale [149].

È stato riscontrato che i livelli di TFEB erano diminuiti nei campioni cerebrali (ippocampo) di pazienti con AD, in particolare i livelli nucleari di TFEB diminuivano negli stadi avanzati della malattia [150].

Inoltre, la traslocazione del TFEB al nucleo è stata attenuata nei fibroblasti con carenza di presenilina e ha indotto neuroni AD umani derivati ​​da cellule staminali pluripotenti, con conseguente ridotta attivazione della rete CLEAR [151].

Tuttavia, in un modello animale APP/PS1 doppio transgenico, sono stati rilevati livelli aumentati di TFEB totale e nucleare nell'ippocampo di topi AD di 8- mesi con un concomitante aumento dei suoi bersagli a valle, suggerendo che il TFEB è coinvolto nei processi lisosomiali progressione mediata dell’AD [152]. La sovraregolazione dei geni bersaglio del TFEB è stata segnalata anche nei topi knockout condizionali PS1 e nei topi 5xFAD [153].

L'attivazione della rete TFEB potrebbe riflettere un tentativo di compensare l'autofagia compromessa nei modelli animali di AD. L’esatto ruolo del TFEB come principale regolatore della funzione lisosomiale nella patogenesi dell’AD è lungi dall’essere pienamente compreso e richiede ulteriori indagini.

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