Malattia materna e regolazione epigenetica nello sviluppo renale

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PARTE Ⅱ: Effetti delle condizioni ambientali sul numero di nefroni: modellizzazione della malattia materna e regolazione epigenetica nello sviluppo renale

Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & et al.

Astratto

Un numero crescente di prove suggerisce che un basso numero di nefroni alla nascita può aumentare il rischio di malattie renali croniche o ipertensione più avanti nella vita. I fattori di stress ambientale, come la malnutrizione materna, i farmaci e il fumo, possono influenzare le dimensioni renali alla nascita. Utilizzando colture di organi metanefrici per modellare condizioni ambientali a singola variabile, sono stati valutati modelli di malattia materna per i modelli di compromissione dello sviluppo. Mentre l'ipertermia ha avuto effetti limitati sullo sviluppo renale, la carenza di ferro fetale è stata associata a una grave compromissione della crescita renale e della nefrogenesi con un fenotipo tutto prossimale. La coltura di espianti renali in condizioni di alto glucosio ha portato a cambiamenti cellulari e trascrittomici simili alla nefropatia diabetica umana. Condizioni di coltura ad alto glucosio a breve termine erano sufficienti per alterazioni a lungo termine nella memoria epigenetica associata alla metilazione del DNA. Infine, il ruolo dei modificatori epigenetici nello sviluppo renale è stato testato utilizzando una piccola libreria di composti. Tra gli inibitori epigenetici selezionati, vari composti hanno suscitato un effetto sulla crescita renale, come gli inibitori dell'HDAC (entinostat, TH39), dell'istone demetilasi (deferasirox, deferoxamina) e dell'istone metiltransferasi (ciproeptadina). Pertanto, le colture di organi metanefrici forniscono un valido sistema per lo studio delle condizioni metaboliche e uno strumento per lo screening dei modificatori epigenetici nello sviluppo renale.

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3. Discussione

Lo sviluppo renale avviene principalmente nell'utero ed è soggetto all'interferenza di influenze metaboliche e ambientali. Il numero di nefroni è determinato alla nascita e un numero crescente di prove suggerisce che un basso numero di nefroni sia un fattore di rischio per lo sviluppo di ipertensione e malattia renale cronica più avanti nella vita [2-4,60]. Tuttavia, molti fattori che influenzano il numero di nefroni e le modalità di azione sono ancora sconosciuti. Qui, i reni embrionali di topi reporter a doppia fluorescenza coltivati ​​su inserti Transwell sono stati utilizzati per modellare le condizioni metaboliche materne e schermare gli inibitori epigenetici.

Mentre molti studi ora coinvolgono organoidi renali utilizzando cellule iPS umane [61], le colture renali sono uno strumento prezioso per l'analisi dettagliata dei fenotipi mediati da condizioni metaboliche o agenti inibitori. Sebbene le colture cellulari progenitrici e gli organoidi renali siano alternative con un potenziale significativo per le indagini sulla teratogenicità, sono soggette a limitazioni, come l'elevata variabilità nella differenziazione e nella crescita e la mancanza di una struttura organica convenzionale. Ciò rende la coltura di organi metanefrici una valida alternativa per studiare condizioni che non sarebbero fattibili in vivo.

Pertanto, l'ipertermia e la carenza di ferro forniscono due esempi di studio delle condizioni ambientali con esiti diversi sulla crescita renale e sul numero di nefroni. Sebbene i dati sull'effetto dell'ipertermia sulla crescita renale siano scarsi, l'effetto della restrizione del ferro ex vivo è in linea con precedenti segnalazioni di carenza di ferro materna nei ratti [23.24]sebbene il modello sia limitato nel replicare l'esatto stato in utero in termini di concentrazione e cinetica del ferro. I nostri risultati hanno anche dimostrato che l'attività mitotica è ridotta nella condizione con restrizione di ferro. Il ferro svolge un ruolo essenziale in molti processi cellulari, come il ciclo cellulare [62]. La nostra analisi morfologica ha mostrato un fenotipo di differenziazione del nefrone tutto prossimale, probabilmente come risultato della segnalazione Wnt canonica inibita. Una diffusa downregulation dei geni associati alla segnalazione Wnt è stata precedentemente segnalata in un'analisi di microarray della prole di ratto esposta a carenza di ferro materna [63]. Meccanicamente, è stato dimostrato che la deplezione intracellulare del ferro da parte di agenti chelanti induce la degradazione proteasomica della -catenina, la principale proteina effettrice a valle della via canonica Wnt nel cancro e nelle cellule progenitrici neurali [64,65].

Come un'altra condizione metabolica, la modellazione dell'elevata esposizione al glucosio ha prodotto effetti simili a quelli del diabete materno in vivo indotto da streptozotocina[10,26,27,{4}}]. Sebbene il nostro modello non sia in grado di riprodurre gli effetti delle condizioni di glucosio a 30 mM, probabilmente a causa dell'influenza precedentemente riportata del background del topo [28,72], le condizioni di glucosio a 55 mM hanno comportato una riduzione della crescita e una diminuzione del numero di nefroni. Cambiamenti pronunciati erano visibili istologicamente e ultrastrutturalmente nei glomeruli, con l'espansione della matrice basale glomerulare simile alla nefropatia diabetica umana. Le somiglianze tra la risposta renale del feto murino e dell'adulto umano al glucosio elevato con espansione ECM distinta e downregulation dei geni chiave dei podociti sono state sorprendenti e hanno rivelato molti geni noti associati al diabete, indicando l'uso di meccanismi simili nei podociti e nei tubuli. Tuttavia, non è noto se le stesse vie sottostanti portino alla dedifferenziazione nella nefropatia diabetica e alla diminuzione della differenziazione durante la differenziazione fetale. È interessante notare che anche le alterazioni dell'ambiente diabetico non glucidico, come l'iperchetonemia, hanno dimostrato di mediare la teratogenesi ma non sono state replicate nel modello di coltura renale [73,74]. Anche gli effetti a lungo termine dell'iperglicemia erano riproducibili nel nostro modello, mostrando un ritardo della crescita continuo dopo la normalizzazione della glicemia simile ai precedenti rapporti [10]. Inoltre, l'analisi della metilazione del DNA ha rivelato una prolungata ipometilazione del DNA nelle regioni ripetitive e un'ipermetilazione nel locus Ppargcla dopo l'inversione a un mezzo a basso contenuto di glucosio, indicando la formazione di memoria metabolica dopo un periodo di stress metabolico [30]. In precedenza è stato anche dimostrato che molti altri geni regolati in modo differenziale sono regolati epigeneticamente nel diabete. Ad esempio, il gene sovraregolato MEST è impresso maternamente e ipometilato nel diabete mellito gestazionale[75]. S100A4 è un marker differenzialmente metilato di insulino-resistenza nei bambini obesi [76]. Dei geni sottoregolati, ESM1 e RASGRP3 sono esempi di geni differenzialmente metilati nel diabete gestazionale [77,78], che mostrano la crescente emergenza di legami tra diabete e regolazione epigenetica. Pertanto, il nostro sistema evidenzia la modifica epigenetica o la programmazione fetale come un importante meccanismo di regolazione.

È noto che diversi enzimi regolatori epigenetici sono coinvolti sia nella morfogenesi renale che nella regolazione trascrizionale nella funzione e nella malattia degli organi adulti [30,40,{2}}]. Utilizzando le colture renali come strumento di screening, abbiamo cercato ulteriori modificatori epigenetici che svolgono un ruolo nello sviluppo renale e nella morfogenesi del nefrone. Entinostat (MS-275) ha ridotto le dimensioni del rene in accordo con la delezione genetica precedentemente segnalata di HDAC1 e HDAC2 nelle cellule progenitrici del nefrone o nelle cellule gemmatiche ureteriche[44,82,83]. Sebbene l'inibizione dell'HDAC8 da parte di TH39 abbia anche indotto una grave riduzione della crescita dell'espianto e la mancanza di differenziazione, l'inibitore altamente specifico dell'HDAC8 PCI-34051 non ha mostrato alcun effetto, indicando così gli effetti fuori bersaglio del TH39, come altri HDAC. Con un fenotipo simile a quello dei reni coltivati ​​in condizioni carenti di ferro, deferasirox e deferoxamina, gli inibitori pubblicati delle demetilasi dell'istone demetilasi ferro dipendenti dal dominio JumonjiC contenenti il ​​dominio JumonjiC [50], possono mostrare effetti fuori bersaglio dovuti alla chelazione del ferro. Mentre la ciproeptadina, un antagonista dell'istamina e inibitore pubblicato dell'istone metiltransferasi Set7/9, ha mostrato un fenotipo unico portando alla diffusione della popolazione di cellule progenitrici, ulteriori risultati hanno indicato effetti fuori bersaglio che coinvolgono la via di segnalazione Wnt [48]. Complessivamente, questa libreria di inibitori approvati dalla FDA mostra il potenziale per uno screening rapido ed efficace per i modulatori epigenetici. A causa del periodo di tempo limitato utilizzato, gli inibitori che richiedono un'esposizione prolungata per esercitare un effetto potrebbero non essere stati rilevati in questa configurazione. Pertanto, l'azacitidina non ha mostrato un effetto nonostante il fenotipo pubblicato del knockout Dnmt1 [30].

Sebbene il sistema di coltura renale offra un robusto sviluppo renale, diversi aspetti limitano l'indagine o l'interpretazione dei risultati in questo modello riduzionista. In primo luogo, gli studi hanno mostrato differenze nello sviluppo del topo e nell'uomo e nell'espressione genica, limitando l'uso del modello murino. Successivamente, i limiti di tempo in questo sistema potrebbero non consentire lo svolgimento di tutti i processi complessi. Ciò potrebbe spiegare alcune delle condizioni ambientali e degli inibitori epigenetici che non hanno avuto un impatto sullo sviluppo renale in questo studio. Inoltre, alcuni degli inibitori mostrano effetti non specifici che possono contribuire all'inibizione di altre vie, come nel caso della ciproeptadina, che sembra mostrare i suoi effetti tramite l'attivazione di GSK3-beta, o nel caso della chelazione del ferro da parte di deferasirox/deferoxamina. Al di là di questo studio proof-of-concept, lo schermo dell'inibitore epigenetico potrebbe essere esteso a inibitori più (specifici); periodi di tempo prolungati; criteri di studio aggiuntivi, come il numero di nefroni e la ramificazione delle gemme ureteriche; e studi trascrittomici ed epigenetici.

Per riassumere, le colture renali consentono la caratterizzazione di una serie di modelli di malattia materna, come l'ipertermia, la carenza di ferro e il diabete materno, e lo screening di composti farmacologici, fornendo una piattaforma adatta per studiare il crosstalk tra le influenze ambientali dello sviluppo rene e sua programmazione epigenetica.

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