Approfondimento meccanicistico sulla neuroprotezione indotta dalla diosmina e sul miglioramento della memoria nel modello di ratto con acido intracerebroventricolare-chinolinico: resurrezione delle funzioni mitocondriali e antiossidanti Parte 3

2. Materiali e metodi

2.1. Animali sperimentali. .questa ricerca è stata autorizzata dall'IAEC ai sensi del protocollo n. ASCB/IAEC/14/20/145. Ratti AlbinoWistar (entrambi i sessi, da 200 g a 250 g, età da 8 a 9 mesi) sono stati mantenuti in recinti cubici di polipropilene di dimensioni tipiche con impostazioni artificiali di temperatura (23 ± 2 gradi), sequenze di buio/luce di 12:12 ore e umidità (40 ± 10%) all'interno del ricovero per animali istituzionale. .e roditori sono stati nutriti con alimenti nutrienti standard (produttori di Ashirwad, Punjab) e acqua purificata a volontà.

Il rapporto tra maschi e femmine e la memoria ha sempre attirato molta attenzione. È noto che gli ormoni maschili svolgono un ruolo importante nello sviluppo fisico, nel mantenimento della salute e nella promozione dello sviluppo e della funzione sessuale. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che gli ormoni maschili sono strettamente correlati alla memoria.

Gli studi hanno dimostrato che gli uomini ottengono risultati migliori delle donne in alcuni compiti di memoria. Ad esempio, gli uomini di solito ottengono risultati migliori delle donne nella memoria spaziale, e il motivo è l’effetto degli ormoni maschili sull’ippocampo. L’ippocampo è l’area del cervello che elabora la memoria spaziale. Gli ormoni maschili possono promuovere la funzione dell'ippocampo, migliorando così la capacità di memoria spaziale degli uomini.

Tuttavia, gli ormoni femminili hanno anche un effetto positivo sulla memoria. Gli studi hanno scoperto che gli ormoni femminili possono promuovere l'espressione dei geni legati alla memoria nel cervello e aumentare il numero e la funzione dei neuroni nell'ippocampo, migliorando così la memoria delle donne. Inoltre, gli ormoni femminili possono alleviare lo stress, inibire la morte delle cellule neuronali, proteggere i neuroni cerebrali e migliorare ulteriormente la memoria delle donne.

Ciò dimostra che sia gli ormoni maschili che quelli femminili hanno un effetto positivo sul miglioramento della memoria. Uomini e donne hanno prestazioni di memoria diverse, ognuno con i suoi vantaggi e svantaggi, ma ciò non significa che gli uomini abbiano una memoria migliore delle donne o che le donne abbiano una memoria migliore degli uomini. Pertanto, non dovremmo usare il genere come misura della memoria. Tutti dovrebbero sfruttare appieno il proprio vantaggio e migliorare costantemente la propria memoria.

Infine, che si tratti di uomini o donne, dovremmo prestare attenzione alla nostra salute fisica e mentale e scegliere il modo giusto per migliorare la nostra memoria. Ad esempio, imparare costantemente cose nuove, sviluppare abitudini di vita regolari e mantenere la stabilità emotiva può avere un impatto positivo sul miglioramento della memoria. Lavoriamo insieme per esplorare e mettere in pratica continuamente metodi per migliorare la memoria e creare un futuro migliore per noi stessi. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché Cistanche è una medicina tradizionale cinese con molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia di Cistanche deriva dai vari principi attivi che contiene, tra cui acido tannico, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello in molti modi.

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Tutte le procedure sugli animali vengono eseguite esclusivamente secondo le linee guida del CPCSEA, GOI, Nuova Delhi. I custodi e gli addetti agli animali erano ciechi riguardo ai diversi regimi terapeutici offerti alle coorti di animali. Sono state eseguite prove sperimentali sugli animali, dopo almeno due settimane di familiarizzazione.

Tutte le indagini sugli animali sono state eseguite tra 0900- e 1600- ore al giorno.2.2. Farmaci e prodotti chimici. Diosmina (DSM: 520-27-4), acido chinolinico (QA: 89-00-9) e analiti standard sono stati acquistati da Merck (India).

Sodio fosfato monobasico (NaH2PO4), idrossido di sodio (NaOH), potassio fosfato bibasico (K2HPO4), nitroblutetrazolio (NBT), fenazina metosolfato (5-metilfenazinio metilsolfato), acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), albumina bovinese (BSA), {{ Acido 5}}[4-(2-idrossietil)piperazin-1-il]etansolfonico (HEPES), 1,2-bis[2-[bis(carbossimetil) ammino]etossi]etano (EGTA), riboflavina, cianuro di sodio (NaCN), natriumazide (NaN3), pirofosfato tetrasodico, perossido di idrogeno (H2O2), NADH disodico (DPNH), NADPH tetrasodico (sale tetrasodico ridotto del coenzima II), acido fosforico, Reagente fenolo di Folin e Ciocalteu (FCR) e acido solfosalicilico (5-SSA) (HiMedia Laboratories, Maharashtra, India); diglicina, acido acetico glaciale (CH3COOH), reagente di Ellman (3-carbossi-4-nitrofenildisolfuro, DTNB), azabenzene (C5H5N) e laurilsolfato di sodio (SLS) (LobaChemie, Mumbai, India); 4,6-Diidrossi-2-mercaptopirimidina (2-TBA), carbonato disodico (Na2CO3) e (2-mercaptoetil)trimetilammonio ioduro acetato (prodotti chimici TCI, India); solfato di zinco (ZnSO4), sale di Rochelle (L(+)-tartrato di sodio e potassio), 2-(1-Naftilammino)etilammina dicloridrato, acido nitroso sodico (NaNO2) e p-aminobenzenesulfonamide (SiscoResearch Laboratories, India ); è stato utilizzato alcol butilico (Fisher Scientific, India).2.3. Iniezione intracerebroventricolare di acido chinolinico.

Gli animali sono stati sottoposti ad anestesia mediante somministrazione intraperitoneale (ip) di un cocktail di ketamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) utilizzando acqua sterile per preparazioni iniettabili. Il corpo è stato adagiato in posizione prona su un cuscino caldo e riscaldato e la testa è stata posizionata sul supporto di uno strumento per chirurgia stereotassica. .e il cuoio capelluto è stato inciso nel punto themidsagittale e il cranio è stato scoperto retraendo la pelle.

Uno qualsiasi dei due ventricoli laterali è stato scelto arbitrariamente e nel cranio l'osso parietale è stato perforato (coordinate stereotassiche -0,8 mm anteroposteriore dal bregma, ±1,5 mm mediolaterale dalla sutura sagittale media e ±3,6 mm dorsoventrale dalla superficie ossea parietale ) per realizzare un foro di bava [21].

Il primo giorno, la soluzione di acido chinolinico (QA) è stata appena costituita (240 nmol) in PBS (Na+-K+ [PO4]2- soluzione salina tamponata, pH 7,4) ed è stata gradualmente iniettata utilizzando una microsiringa Hamilton a una portata di 1 µl/minuto nel ventricolo cerebrale sinistro o destro dei ratti per una durata di 5-6 minuti con un volume di iniezione di 5 µl di veicolo ICV [22].

Dopo l'inoculazione dell'intero farmaco, il microago non è stato rimosso per 4-5 minuti per consentire la diffusività del farmaco nel liquido cerebrospinale e contrastarne il rigurgito. Al volume equivalente (10 µl) di veicolo PBS è stato somministrato ICV in shamrat che erano stati operati in modo identico, tuttavia, QA non è stato iniettato.

Dopo le iniezioni di farmaci, i fori sono stati ripristinati utilizzando un agente adesivo (fosfato di zinco, PYRAX®) ed è stata eseguita la sutura della pelle. Per evitare la contaminazione (crescita batterica), Neosporin® è stato applicato pro renata.

Per evitare la sepsi postoperatoria, è stato somministrato Orizolin (Zydus Cadila), una dose di 30 mg/kg (ip). Ad ogni ratto è stato fornito un ambiente caldo (37 ± 0,5 gradi) per evitare l'ipotermia postoperatoria. A ciascun ratto è stato concesso cibo semisolido (all'interno della gabbia) e acqua gratuitamente dopo l'intervento chirurgico per sette giorni e alloggiato discretamente in una gabbia distinta (30 × 23 × 14 cm3).

2.4. Protocollo sperimentale. Il DSM è stato iniettato a dosi di 50 e 100 mg/kg per peso corporeo (pc) nei ratti attraverso la via intraperitoneale (ip) utilizzando un veicolo di dimetilsolfossido allo 0,5% in soluzione salina (dose-volume 5 ml/kg) [17].

Gli animali sono stati assegnati casualmente in 5 cluster in modalità in cieco singolo (n=5): (i) sham (S), (ii) QA, (iii) QA + DSM50, (iv) QA + DSM100 e (v) QA +DNP. I ratti sono stati sottoposti alla somministrazione intracerebroventricolare di QA (QA-ICV) o ad un intervento chirurgico fittizio il primo giorno.

Il DSM è stato somministrato per 21 giorni consecutivi ogni giorno 120 minuti dopo il QA-ICV dal primo giorno in poi. Il donepezil (DNP) è stato impiegato come farmaco standard in questo studio e iniettato (dose 3 mg/kg, ip) in ratti a cui era stato iniettato QAICV per 21 giorni consecutivi.

Agli animali dei gruppi di controllo fittizio e QA è stato somministrato un veicolo (0,5% dimetilsolfossido sterile in soluzione salina normale in dose-volume 5 ml/kg) dal giorno 1 al giorno 21. L'intero studio è stato eseguito secondo lo schema illustrato in Figura 1.2.5. Attività locomotoria.

In tutti i gruppi di ratti, l'attività locomotoria media è stata documentata utilizzando un dispositivo attofotometro per 5 minuti. Un animale separato è stato posizionato nell'attofotometro per 3 minuti di acclimatazione. Ai ratti sono stati poi concessi 5 minuti e i risultati sono stati dichiarati come conteggi per 5 minuti [11].2.6. Prova del Rotarod.

In rodents, the rotarod test typically evaluates the equilibrium and muscle synchronization facets of sensorimotor functions. .e rats were presented to acquisition trials until their ability to run reached >60 secondi sull'asta che gira a nove rotazioni al minuto (rpm).

Dopo le prove di acquisizione, un ratto separato è stato posizionato sull'albero cilindrico e la velocità di rivoluzione è stata aumentata ad un intervallo costante di 10 secondi da 6 giri al minuto (velocità preliminare) a 30 giri al minuto (velocità conclusiva), per un periodo di oltre 50 secondi. .nei risultati è stata indicata la latenza media di caduta (in secondi) dell'albero cilindrico rotante.2.7.

Analisi dell'impronta. Il principio alla base dell'esecuzione dell'analisi dell'impronta nei ratti è la valutazione delle anomalie dell'andatura.

Per quanto riguarda le impronte, i piedi dei ratti sono stati immersi in quattro coloranti alimentari non tossici di diversi colori e gli è stato permesso di correre su una passerella inclinata (70 cm × 10 cm × 8 cm). La base della pista era racchiusa da un foglio di cellulosa di colore bianco. .I ratti sono stati motivati ​​a raggiungere una sezione in salita poco illuminata alla fine della pista per ottenere impronte chiare. .e il colorante è stato rimosso delicatamente da ciascun animale utilizzando acqua tiepida dopo le prove. Le impronte sono state scansionate e la "lunghezza del passo" è stata misurata utilizzando un righello standard. La lunghezza del passo è stata quantificata calcolando la distanza tra i posizionamenti sequenziali della zampa identica del ratto [11].

2.8. Compito di riconoscimento di oggetti nuovi (NORT). È stato seguito il protocollo standard fornito da Kumar e Bansal [23].

ORT è un archetipo esterocettivo non redditizio e non ostile impiegato per valutare la memoria collettiva di tipo lavorativo sfruttata attraverso la condotta impulsiva di sondaggio dei roditori. L'indagine viene eseguita in un'imbarcazione cubica in compensato aperto sul tetto (80 cm × 42 cm × 62 cm), posizionata in un'area tranquilla, illuminata da un LED da 60 W per gestire una luminosità costante nell'imbarcazione.

Gli oggetti in legno a forma di cilindro (bianco), piramide (rosso) e cubo (nero) (alti 12 cm) (in triplette identiche) erano solidi e di peso sufficiente da renderli immobili ai roditori. NORT è stato eseguito il 16° giorno in 3 fasi (S): acclimatazione (S1), acquisizione (S2) e fase di esame (ritenzione) del riconoscimento del nuovo oggetto (S3).

Durante S1, tre giorni consecutivi prima delle prove sono state effettuate per scoprire la base del pavimento libera della nave (5 minuti) da parte dei ratti. Al completamento di S1, il singolo animale era abituato a qualsiasi serie di elementi solidi nella fase di apprendimento (S2).

Oggetti simili a gemelli furono posizionati in 2 angoli contrari della nave scelti arbitrariamente (da 9 cm a 11 cm di distanza dai bastioni laterali). Separatamente, un roditore è stato posizionato al centro del recipiente di fronte ai due oggetti solidi e gli è stato permesso di scoprire i due oggetti simili per 5 minuti. Si supponeva che la condotta investigativa fosse quella di guidare il muso vicino all'oggetto a una distanza inferiore o uguale a 2-3 cm o il contatto fisico con l'oggetto con la museruola.

Dopo S2, il roditore è stato alloggiato in una gabbia domestica, trascinato da una pausa intertrial (ITR) di 60 minuti.

Ogni singolo oggetto solido offerto in S2 è stato scambiato con un oggetto solido diverso, e i roditori sono stati presentati nuovamente agli oggetti gemelli, cioè una replica dell'oggetto conosciuto e dell'oggetto diverso. Tutte le fusioni e le posizioni degli oggetti sono state compensate. abbattere i probabili pregiudizi istigati da un debole per determinati ambienti o elementi. Il recipiente e gli oggetti solidi sono stati puliti meticolosamente (alcool etilico al 15% e panno asciutto) dopo ogni indagine per ridurre i segni odorosi. Il periodo trascorso alla scoperta di ciascun elemento in S2 e S3 è stato documentato utilizzando un cronometro. .e la durata spesa per indagare i due elementi corrispondenti in S2 (I1 � Ii1 + Ii2) e la durata spesa per indagare i due elementi dissimili, vale a dire, conosciuti e diversi, in S3 (I2 � Ii3 + Ib) è stato registrato. La variazione nella durata impiegata nell'investigare il diverso elemento e nella durata dell'investigazione dell'elemento conosciuto (Ib-Ii3 - DI) rivela la conservazione della memoria collettiva.

DI (indice di discriminazione)/S3 durata/i dell'indagine sia dell'elemento conosciuto che di quello nuovo (DI modificato) migliora le parzialità mediante varianze nell'indagine completa e denota la propensione per elementi diversi rispetto a quelli conosciuti {DI � (Ib–Ii3 )/(Ii3 + Ib)}. La memoria raccoglitiva è stata valutata quantificando l'abilità dei roditori di individuare elementi familiari/nuovi in ​​S3 ed è stata dichiarata come DI (modificata per il periodo di indagine complessivo in S3) [24].

2.9. MorrisWater Maze (MWM). È stato seguito il protocollo standard, come fornito da Kumar e Bansal [25]. MWM valuta la memoria spaziale mediante prove di nuoto, nelle quali il roditore trova una via di fuga verso un podio nascosto.

Un serbatoio circolare di colore nero (2 m di diametro, 0,6 m di altezza) aveva acqua (25 ± 1 grado) riempita fino a una profondità di 0,3 m. Il serbatoio acquatico è stato separato in senso orario in 4 regioni simili (R1, R2, R3 e R4) utilizzando due fibre di nylon, fissate perpendicolarmente sul perimetro superiore del serbatoio.

Una pedana (10,5 cm x 10,5 cm) è stata posizionata sott'acqua (1 cm sott'acqua) nella regione del serbatoio R4. Il punto della pedana è rimasto intatto per tutto il periodo di acquisizione.

Ogni singolo ratto è stato sottoposto a quattro cicli di acquisizione seriale (5 minuti ITR) ogni giorno. .Il roditore è stato rilasciato delicatamente nel serbatoio acquatico di fronte alla parete della vasca, con il sito che variava con ogni singola prova da R1-R4, R2-R1, R3-R2 e R{{ 7}}R3 rispettivamente nei giorni da 1 a 4, e sono stati concessi 120 secondi per rilevare il podio sottomarino. .e i roditori hanno continuato a riposare sul podio per 20 secondi.

Un mancato rilevamento della piattaforma entro 120 secondi indicava il posizionamento manuale del ratto sulla piattaforma, quindi gli venivano concessi 20 secondi sulla piattaforma. Il tempo di latenza di fuga (ELT) è la durata (s) della scoperta della pedana nascosta nel serbatoio acquatico.

L'apprendimento spaziale è stato caratterizzato dall'ELT del primo giorno rispetto al quarto giorno. Nella prova con sonda (5° giorno), i roditori hanno esplorato il serbatoio per 120 secondi ma sono stati privati ​​del podio. È stata registrata la durata media spesa nell'intero bacino (4 regioni). .La durata media spesa in R4 (TSTQ: tempo trascorso nel quadrante target) alla ricerca del podio nascosto è stata considerata un indice della memoria di riferimento. .l'impostazione comparativa della vasca rispetto agli elementi del laboratorio che fungono da segnali visivi e la posizione del ricercatore è rimasta indisturbata [26].

2.10. Stima dei parametri biochimici. Dopo aver completato gli esami comportamentali, il cervello completo dei ratti è stato raccolto e posizionato su cubetti di ghiaccio polverizzati, seguito da un bagno con soluzione salina sterilizzata congelante (isotonica 308 mOsmol/l NaCl) per rimuovere i resti e il sangue.

L'omogeneizzazione dell'intero cervello è stata immediatamente ottenuta in un tampone di separazione congelante (pH 7,4) con la composizione 215 mM D-mannitolo, 20 mM 2-[4-(2-idrossietil )acido piperazin-1-il]etansolfonico, 1,2-bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etossi]etano 1 mM, saccarosio 75 mM e BSA 0,1%. L'omogenato è stato centrifugato a 4 gradi utilizzando una forza di 13000 × g per 5 minuti. .e il pellet è stato rifiutato e il surnatante è stato separato in due porzioni ed è stato ricentrifugato (4 gradi) a una forza di 13000 × g per 5 minuti. .Il pellet mitocondriale grezzo è stato separato e nuovamente centrifugato in un tampone di separazione con 1,2-bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etossi]etano a 12.500 × g per 11 minuti (4 gradi ). Il deposito semisolido così ottenuto comprendente mitocondri non contaminati è stato risospeso in un tampone di separazione (pH 7,4) contenente saccarosio 75 mM, 2-[4-(2-idrossietil)piperazina-1- 20 mM. acido il]etansolfonico e D-mannitolo 215 mM [27].

Successivamente, la frazione mitocondriale dell'omogenato dell'intero cervello è stata utilizzata per determinare i marcatori biochimici utilizzando metodi standard.2.11. Stima del complesso mitocondriale.

2.11.1. NADH: attività dell'ubichinone ossidoreduttasi. La quantità di attività del complesso I (NADH deidrogenasi) è stata quantificata (nmol di NADH ossidata/minuto/mg di proteina) seguendo la tecnica di King e Howard [28]. La generazione ossidativa di NAD+ dal NADH è accompagnata dalla riduzione del citocromo c. La miscela del test era costituita da citocromo c (10,5 mM), nicotinammide adenindinucleotide (DPNH) 6 mM disciolti utilizzando tampone diglicina 2 mM e tampone diglicina (0,2 M, pH 8,5).

Una frazione mitocondriale dissolvibile è stata incorporata nella miscela del test per innescare la reazione. .La variazione della densità ottica (OD) a λmax � 550 nm è stata seguita per 120 secondi.

2.11.2. Succinato: attività dell'ubichinone ossidoreduttasi. Il tasso di attività della succinato deidrogenasi (complesso II) è stato quantificato (nmol succinato ossidato/minuto/mg di proteina) seguendo la tecnica di King [29].

L'ossidazione dell'acido succinico è innescata da un finto ricevitore di elettroni, il cianoferrato di potassio (K3Fe(CN)6). .e miscela di analisi composta da acido succinico (0,63 M), 1% BSA, K3Fe(CN)6 (0,036 M) e Na+-K+ Tampone [PO4]2- (0,23 M, pH 7,6). Una frazione mitocondriale dissolvibile è stata incorporata nella miscela del test per innescare la reazione. .la variazione della densità ottica aλmax � 420 nm è stata seguita per 120 secondi.2.12. Determinazione dei biomarcatori dello stress ossidativo2.12.1. Sostanze reattive dell'acido iobarbiturico (TBARS).

Per valutare TBARS (nmol per mg di proteine) [30], la combinazione da analizzare (quantità finale ∼4 ml) comprendente0,10 ml di cervello omogeneizzato, 1,51 ml 4,{{ 7}}diidrossi-2-mercaptopirimidina (0,8%), 200 µl di SLS (8,18%), 1,49 ml di acido glacialacetico (21%, pH 3,51) e 0,71 ml di acqua deionizzata sono stati sottoposti a riscaldamento in bagnomaria a 96 gradi per 60 minuti.

Un rapporto 15:1 di alcol butilico/azabenzene (5,1 ml) è stato aggiunto a una miscela di analisi che è stata centrifugata a 4,000 × gpower (10 minuti) e il surnatante è stato isolato.

Con uno spettrofotometro UV1700 a doppio raggio (Shimadzu, Giappone), la densità ottica del cromoforo malondialdeide-4,6-diidrossi-2-mercaptopirimidina è stata valutata a una lunghezza d'onda (λmax � 532 nm) e ε � 1,56 × 105/M/cm (coefficiente di estinzione molare) è stato applicato per calcolare gli addotti 4,6-diidrossi-2-mercaptopirimidina.

2.12.2. Livelli ridotti di glutatione (Lc-glutamil-L-cisteinil-glicina). La procedura di Ellman [31] è stata implementata per valutare il contenuto di L-glutatione (GSH). .La miscela di prova comprendente omogenato (1,1 ml) e 1 ml di acido 2-idrossi-5-solfobenzoico al 4% (5-SSA) è stata centrifugata (4 gradi) per 11 minuti a una potenza di 2.500 × g .

Successivamente, 2,8 ml di tampone Na+-K+[PO4]2- (51,2 mM, pH 7,77) e {{10}},21 ml di 3-carbossi{{13 }}nitrofenildisolfuro (0,12 mM, pH 7,89) sono stati miscelati con il surnatante sopra separato (0,12 ml).

Il tripeptide (μmolGSH per mg di proteina) è stato quantificato con lo spettrofotometro UV1700 a doppio raggio (λmax � 412 nm). applicandoε � 1,36 ×104/M/cm.2.12.3.

Attività della glutatione perossidasi. .l'attività della glutatione perossidasi (GPx) (EC 1.11.1.9) è stata valutata implementando la tecnica di Mohandas et al. [32]. .analizzare la miscela composta da 100 µl di omogenato all'10%, 100 µl di sodio azide (1,11 mM), 100 µl di EDTA (1,13 mM), 40 µl di glutatione-disolfuro reduttasi (GSR, 1 UI/ml) (EC1.8.1.7), 10 µl H2O2 (0,28 mM), 40 µl Lc-glutamil-L-cisteinil-glicina (1,2 mM), 100 µl sale tetrasodico ridotto del coenzima II (0,22 mM ) e 0,12 M 1,49 ml di tampone Na+-K+ [PO4]2-(pH 7,4) in una quantità intera di 2000 µl. .La perdita di tetrasodio ridotto con coenzima II a λmax � 340 nm è stata documentata ad una temperatura di 25 gradi. La velocità GPx è stata calcolata come nmol NADPH ossidato/minuto/mg di proteina utilizzando ε � di 6,22 ×103/M/cm.

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