Effetti antietà mediati dell'estratto di cistanche
Mar 29, 2023
ASTRATTO:Cistancheè un'erba ampiamente utilizzata nella medicina tradizionale asiatica come ingrediente in prescrizioni complesse.Cistancheè noto per il suoantileucemico,antiossidante, Eproprietà antinfiammatorie. Tuttavia, il suoantivascolarel'efficacia dell'invecchiamento endoteliale e i meccanismi sottostanti non sono completamente compresi. In questo studio, abbiamo studiato gli effetti anti-invecchiamento di Cistanche nel modello di invecchiamento delle cellule endoteliali (CE) indotto da glucosio alto (HG). Trattamento conCistanche(40 g/mL) ha aumentato la migrazione delle EC e ha aumentato la fosforilazione delle chinasi regolate dal segnale extracellulare e p38 in modo dose-dipendente. Dopo il trattamento con HG (30 mM),Cistanche diminuito significativamente il numero di cellule galattosidasi-positive associate alla senescenza, che sono i biomarcatori dell'invecchiamento, in modo dose-dipendente. Sulla base dei livelli di fosforilazione, Cistanche (40 ug/mL) ha dimostrato di aumentare l'espressione di sirtuina1 (Sirt1) e di ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS) rispettivamente del 74,4% e del 328,2%. Inoltre, il trattamento delle EC senescenti indotte da HG con Cistanche (40 g/mL) ha aumentato significativamente la produzione di ossido nitrico (P<0.05). Questi risultati dimostrano che Cistanche aumenta la migrazione delle EC e regola il percorso Sirt1/eNOS, suggerendo che Cistanche ha il potenziale per proteggere le EC dall'invecchiamento indotto da HG.
Parole chiave: anti età, cellula endoteliale,Cistanche, Sirt1/eNOS
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ossido sintasi (eNOS), NOS neuronale e NOS inducibile (iNOS). Ad esempio, è stato dimostrato che eNOS svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo delle complicanze cardiovascolari diabetiche esacerbando lo stress ossidativo (Kayama et al., 2015). Inoltre, sirtuin1 (Sirt1), un'istone deacetilasi dipendente dalla nicotinammide adenina dinucleotide (NAD plus) è coinvolta nella regolazione del metabolismo, della sopravvivenza cellulare, della differenziazione e dell'invecchiamento. Sirt1 è un regolatore chiave dell'invecchiamento della CE vascolare. Precedenti studi hanno dimostrato che l'attivazione di Sirt1 può proteggere dalle disfunzioni endoteliali vascolari, controllando al contempo la generazione di eNOS (Hu et al., 2017).
cultura CE
Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (Manassas VA, USA). Le cellule sono state coltivate a 37'C con mezzo di crescita endoteliale CO2 al 5%-2 (EGM-2; Lonza, Walkerville, MD, USA) integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%. Le EC sono state coltivate per 48 ore a 37'C con il 5% di CO, in mezzo EGM-2 (controllo) o HG 30 mM, con o senza l'aggiunta di diverse concentrazioni di Cistanche (1040 ug/mL).
Saggio di vitalità cellulare
Le cellule sono state coltivate a 37'C per 72 ore in un terreno EGM-2 integrato con FBS al 2% e varie concentrazioni di Cistanche, e sono state trattate con soluzione MTT per 4 ore. I depositi di formazan risultanti sono stati sciolti con dimetilsolfossido, dove l'assorbanza è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre VersaMax ELISA (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA).
Saggio di migrazione scratch-wound
Le cellule sono state ferite e quindi i terreni di coltura sono stati sostituiti con nuovi terreni contenenti varie concentrazioni di Cistanche. Le cellule sono state mantenute per 24-48 ore. Quando a migrazione completa, le cellule sono state riprese utilizzando un microscopio (Olympus Optical Co, Ltd., Tokyo, Giappone). Le cellule migrate sono state contate utilizzando un microscopio ottico a 200 ingrandimenti e quantificate manualmente
Colorazione SA-P-gal
To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 celle contate utilizzando tre campi indipendenti.
Analisi Western blot
Le cellule sono state raccolte e lisate in una soluzione di estrazione proteica (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Corea) contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi (10 min a 4'C). Le concentrazioni proteiche totali nei surnatanti sono state misurate mediante saggi Bradford. Dopo il riscaldamento a 95 gradi per 5 minuti, i campioni proteici (30 ug) sono stati separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide all'8~12%. Le proteine sono state quindi trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene (MilliporeBedford, MA, USA) a 100 V per 60 minuti. Le membrane sono state incubate in 5% di albumina di siero bovino (BSA) in soluzione salina tamponata con Tris (TBS) integrata con 0,05% di TBS con Tween-20 (TBST) (30 minuti a temperatura ambiente), quindi incubate in 5% di BSA in TBST integrato con anticorpi primari (da 1:200 a l,000) (durante la notte a 4'C). Successivamente, le membrane sono state inoculate con anticorpi anti-coniglio o anti-topo di capra coniugati con HRP (1:5, 000) per h e le bande proteiche sono state rilevate utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza potenziato (Intron Biotechnology, Inc. ) e un LAS-1000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Giappone). L'analisi semiquantitativa dei risultati della densitometria è stata eseguita utilizzando l'immagine J (National Institutes of Health, Bethesda, MD USA).
Misurazione della produzione di NO Le concentrazioni di NO sono state determinate rilevando la concentrazione di nitrito utilizzando i kit di dosaggio NO, secondo le istruzioni del produttore. Le densità ottiche sono state determinate a 560 nm utilizzando un lettore di micropiastre e le concentrazioni sono state calcolate utilizzando una curva di calibrazione
analisi statistica
I risultati sono espressi come media più deviazione standard (SD) Il significato statistico è stato determinato mediante analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). I confronti post hoc tra i gruppi sono stati eseguiti utilizzando i test di confronto multiplo di Bonferroni. Tutti i calcoli sono stati eseguiti utilizzando SPSS in Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) e valori P<0.05 were considered statistically significant.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Citotossicità di Cistanche
Per determinare la citotossicità di Cistanche su EC, le cellule sono state incubate con varie concentrazioni di Cistanche (da 0 a 100 ug/ml) per 72 ore. Cistanche ha mostrato una significativa citotossicità (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml in tutti i punti di trattamento (Fig. 1). Pertanto, le concentrazioni di Cistanche di<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.
La via della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) regola i processi chiave coinvolti nello sviluppo della CE vascolare, come la proliferazione cellulare, l'invasione, la metastasi e la sopravvivenza e l'angiogenesi (Pišlar et al., 2015). Il MAPK coinvolge ERK, chinasi N-terminale c-Jun e p38 (Kim e Choi, 2010). ERK e p38 sono importanti proteine di segnalazione coinvolte nella guarigione delle ferite, mentre ERK svolge un ruolo importante nel controllo della migrazione cellulare, proliferazione, differenziazione e sopravvivenza (Roskoski, 2012). In uno studio recente, è stato suggerito che la via di segnalazione MAPK p38 sia coinvolta nella guarigione delle ferite (Loughlin e Artlett, 2011; Kim et al., 2019; Wang et al., 2019). Nel presente studio, abbiamo esaminato l'espressione proteica di ERK e p38 per identificare le vie di segnalazione coinvolte nella migrazione EC regolata da Cistanche. Il trattamento con Cistanche (40 g/ml) ha aumentato la migrazione della CE di 1.5- volte rispetto al controllo (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-piega più in alto del controllo (P<0.01) (Fig. 2B). These results show that
Fig. 1.Effetti diCistanche(Cistanche) sulla vitalità cellulare. Le cellule sono state trattate con Cistanche (da 0 a 100g/mL) per 72 ore. Vitalità cellulareè stata calcolata come percentuale di cellule vitali coltivate nelassenza di Cistanche. I risultati mostrano la media ± DS. *P<0.05.
Figura 2.Effetti diCistanche(Cistanche) sulla migrazione cellulare. (A) Le immagini rappresentative mostrano la migrazione del controllo e del trattamento con Cistanchecellule. La migrazione cellulare è stata espressa come percentuale di migrazione osservata per le cellule di controllo. (B) macchie rappresentative dei livellidelle chinasi p-extracellulari regolate dal segnale (p-ERK) e della fosforilazione di p-p38. Analisi quantitativa di p-ERK/-actina e p-p38/-actina. I risultati mostrano la media ± DS. *P<0.05 and **P<0.01.
Cistanche regola la fosforilazione di ERK e p38 in modo dipendente dalla concentrazione. Da questi risultati dell'attivazione di ERK e p38 MAPK, abbiamo concluso che Cistanche induce la migrazione della CE e migliora la sua funzione nella chiusura della ferita.
Per studiare gli effetti inibitori di Cistanche sull'invecchiamento della CE, le cellule sono state trattate con glucosio (30 mM) e varie concentrazioni di Cistanche (da 10 a 40 g/mL). È stata osservata una tendenza all'invecchiamento ritardato in seguito al trattamento con concentrazioni crescenti di Cistanche. In particolare, il trattamento con 40 g/mL di Cistanche ha ridotto significativamente l'abbondanza del biomarcatore di invecchiamento (cellule SA--gal positive) del 10,2% rispetto alle cellule del gruppo di controllo (31,5%) (P<0.01) (Fig.3A). To determine if Cistanche regulates expression of Sirt1, a protein that regulates aging, phosphorylation of Sirt1 and eNOS was investigated following treatment with Cistanche. We showed Cistanche (20 and 40 g/mL) significantly increased the expression of Sirt1 by 58.5% and 74.4%, respectively, compared with cells in the control group (P<0.05). Following treatment with 40 g/mL Cistanche, expression of eNOS was also significantly increased by over 3-fold Cistanche compared with the control group (P<0.01) (Fig. 3B). Moreover, treatment with 40 g/mL Cistanche significantly increased NO production (P<0.05) in HG-induced aged ECs (Fig.3C).
Questo studio è stato finanziato dalla Kyungnam University Foundation Grant, n. 20170139.
L'autore non dichiara alcun conflitto di interessi.
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