Attività decolorante della melanina di enzimi antiossidanti, glutatione perossidasi, tiolo perossidasi e catalasi

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Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· Regno Unito Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Astratto

La melanina è il fattore più importante per determinare il colore della pelle. Sono in corso molti sforzi di ricerca per decomporre i composti di melanina già prodotti nella pelle per la bellezza. Questa ricerca ha studiato gli effetti sulla riduzione del colore della melanina dei tre enzimi antiossidanti, glutatione perossidasi (GPX), tiolo perossidasi (TPX) e catalasi, nella frazione lisosomiale. La soluzione di melanina è stata trattata con gli enzimi e il perossido di idrogeno, quindi ha fatto reagire per 48 h. GPX e TPX hanno decolorato la melanina e, tra loro, GPX era più efficiente, ma la catalasi non era efficace. GPX ha anche inibito la produzione di melanina nelle cellule di melanoma B16F10. GPX, che è presente in quasi tutti i microrganismi, svolge un ruolo importante nel meccanismo di difesa cellulare da parte delle specie reattive dell'ossigeno. Inoltre, non era citotossico ma era significativamente efficace nel decolorare il colore della melanina. Pertanto, in campo biologico e microbiologico, la sua possibilità di impiego nei cosmetici sbiancanti per la pelle è elevata.

Parole chiave Melanina · Glutatione perossidasi (GPX) · Tiolo perossidasi (TPX) · Catalasi · B16F10 · Lisosoma

Cistanche è un ingrediente sbiancante per la pelle.

introduzione

Un viso pulito è uno degli elementi essenziali della bellezza per le persone moderne, in particolare gli asiatici sono entusiasti della pelle bianca. Il composto di melanina è il fattore più importante nel determinare il colore della pelle. Si distingue dall'eumelanina di colore nero o marrone e dalla feomelanina, che si traduce in una tonalità dal rosa al rosso [1]. Il composto della melanina è sintetizzato dall'ossidazione della tirosina nelle cellule dei melanociti, che si trovano nello strato basale dell'epidermide; e il ruolo principale di questo pigmento nella pelle è quello di proteggere il derma bloccando le radiazioni ultraviolette dannose [2, 3]. Tuttavia, se nella pelle sono presenti troppi composti di melanina, la pelle diventa scura e sporca e può causare iperpigmentazione, come il melasma [4].

Ci sono stati molti studi relativi ai cosmetici per la cura della pelle che risolvono questi problemi, ma la maggior parte dei cosmetici sbiancanti per la pelle attualmente sviluppati hanno una funzione per inibire la sintesi di melanina attraverso diversi meccanismi, come bloccare l'ossidazione della tirosina o i raggi UV che possono favorire sintesi di melanina [5]. Questi prodotti richiedono molto tempo per essere efficaci e non sono efficaci per sintomi specifici, come un'iperpigmentazione [6]. Attualmente, un tipico metodo di rimozione della melanina che è già stato realizzato è il trattamento laser [7]. Se vengono sviluppati materiali in grado di risolvere questi problemi senza tali procedure, avranno grande utilità in campo biologico e cosmetico.

In ricerche precedenti, abbiamo cercato di trovare un modo per decolorare i composti di melanina già prodotti. Ci sono stati rapporti di ricerca sulla correlazione tra lisosoma e melanina. È molto probabile che i cheratinociti differenziati degradino in particolare i melanosomi estrinseci secondo il tipo di funzioni autofagiche di base che controllano la quantità di organelli cellulari, o rimuovono gli organelli difettosi, come il perossisoma [8]. La via autofagica, dal citoplasma ai lisosomi, gioca un ruolo sostanziale nella degradazione dei melanosomi negli epidermalceratinociti umani [9]. Questi dati forniscono la prova che gli enzimi lisosomiali specifici contribuiscono alla degradazione della melanina. In precedenza, abbiamo trovato l'attività di riduzione del colore della melanina dell'enzima nella frazione lisosomiale, un complesso contenente idrolizzati per abbattere il materiale di scarto e i detriti cellulari nei perossisomi e nei lisosomi [10, 11]. Questo documento ha studiato gli effetti dei tre enzimi selezionati, glutatione perossidasi, tiolo perossidasi, catalasi, nella frazione lisosomiale per ridurre il colore della melanina. Queste perossidasi agiscono per difendersi dai danni cellulari causati dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e sono presenti in tutti gli eucarioti [12].

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) si formano come sottoprodotto naturale del normale metabolismo dell'ossigeno nelle cellule e possono essere aumentate dallo stress ambientale. I ROS altamente generati possono danneggiare le cellule. Gli effetti dannosi dei ROS sulla cellula sono i seguenti [12, 13]: danno del DNA o dell'RNA, ossidazioni degli acidi grassi polinsaturi nei lipidi, ossidazioni degli amminoacidi nelle proteine ​​e inattivazione ossidativa di enzimi specifici per ossidazione dei cofattori. Le cellule neutralizzano il ROS da un sistema antiossidante per prevenire tale danno tissutale. In questo sistema, il superossidoanione prodotto dal metabolismo è altamente devastante; sebbene sia convertito in perossido di idrogeno dalla Superossido dismutasi (SOD), il perossido di idrogeno è ancora reattivo. Il perossido di idrogeno viene trasformato in H2O dalla catalasi e consumato nella produzione di glutationedisolfuro (GSSG) dal glutatione dalla catalisi del GPX. TPX funziona in modo simile a GPX [13].

Questo studio ha ricercato l'effetto decolorante della melanina di tre enzimi antiossidanti, GPX, TPX e Catalasi. Di conseguenza, GPX e TPX sono risultati efficaci nel ridurre il colore della melanina. Tra questi, GPX non aveva citotossicità alla concentrazione ottimale dell'attività decolorante della melanina e inibiva efficacemente la sintesi della melanina. Pertanto, fornisce la prova che GPX svolge un ruolo importante nel meccanismo di decolorazione della melanina della frazione lisosomiale, non solo attività antiossidante, e offre il potenziale di un nuovo agente cosmetico sbiancante come singolo enzima.

Materiali e metodi

Perossidasi e analisi dell'attività della perossidasi

La concentrazione delle tre perossidasi (glutatione perossidasi, tiolo perossidasi e catalasi) è stata determinata mediante il kit di analisi (kit di analisi della perossidasi, D2PD-100, QuantiChromTM) acquistato da Bioassay Systems. La glutatione perossidasi 2 (GPX2, NBP1-78,824, Novus) e la tiolo perossidasi (TPX, NBP1-78,805, Novus) sono state acquistate da Novus e Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) è stato acquistato da Sigma-Aldrich.

Questo kit di test utilizza H2O2 e un colorante donatore di elettroni che forma la resorufina durante la perossidasi. Il test è stato eseguito a temperatura ambiente (RT) e l'intensità del colore è stata misurata a 570 nm. Le perossidasi sono state fatte reagire con il colorante donatore di elettroni con perossido di idrogeno allo 0,6% per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la reazione, è stato aggiunto il reagente di arresto e l'assorbanza del campione è stata misurata mediante spettrofotometria su micropiastra. L'attività è stata calcolata come segue:

Attività della perossidasi=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Reazione Vol(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Campione Vol(𝜇L)

(U/L). Un'unità (U) di enzima catalizza la formazione di 1 μmole di resorufina al minuto nelle condizioni del test. Qui RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN e RH2O sono rispettivamente l'assorbanza del campione, del bianco del campione, della resorufina e dell'acqua; e n è il fattore di diluizione del campione. Il [Resorufin] per questo test è 50 μM. Il Vol di reazione è 100 μL e il Vol del campione in questo studio è 10 μL.

Decolorazione della melanina da parte di glutatione perossidasi (GPX), tiolo perossidasi (TPX) e catalasi

La soluzione di melanina contiene {{0}}.1 mM PBS (soluzione salina tamponata con fosfato, pH: 7,0) e polvere di melanina (sintetica, Sigma) che è stata preparata mediante ossidazione della tirosina con perossido di idrogeno. Il contenuto di melanina è stato misurato dall'assorbanza a 450 nm. Per determinare la concentrazione di melanina, è stata preparata una curva standard da uno standard autentico di melanina sintetica (R2=0.999, dati non mostrati).

Per verificare la decolorazione della melanina, una soluzione di melanina da 100 ppm contenente (da 50 a 1000) μU/L di perossidasi (GPX, TPX, catalasi) con perossido di idrogeno 1 mM è stata fatta reagire a temperatura ambiente e misurata ogni giorno. Il valore di decolorazione della melanina è stato determinato sottraendo la concentrazione di melanina dopo la reazione, dal valore iniziale.

Cistanche inibisce la sintesi della melanina.

Coltura cellulare

Le cellule di melanoma dei topi B16F10 (KCLB 80008) sono state acquistate dalla Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Le cellule sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenente 4500 mg/L di glucosio, 4 mM di l-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, a cui è stato aggiunto il 10 percento di siero bovino fetale (FBS), 20 mM di HEPES, 1 percento di penicillina, e le cellule sono state incubate in una condizione umidificata contenente il 5% di CO2 a 37 gradi. Il mezzo è stato scambiato ogni 2 giorni (d) e le cellule sono state raccolte utilizzando una soluzione di tripsina/EDTA.

Test di vitalità cellulare (test MTT)

L'effetto tossico della glutatione perossidasi sulla cellula di melanoma B16F10 è stato confermato dal test MTT, un metodo generale utilizzato per determinare l'effetto di un campione sulla vitalità della cellula aderente. Questo test utilizza 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) che può essere ridotto a formazano dal mitocondriale enzima in cellula vitale. Le 3 × 103 cellule sono state seminate per pozzetto in una 96-piastra a pozzetti e incubate per 24 h. Quindi un campione è stato aggiunto a ciascun pozzetto e incubato per 72 ore. Successivamente, il mezzo è stato scambiato con uno contenente 0,5 mg/mL di MTT e incubato per 2 ore. Successivamente, il reagente colorante MTT è stato rimosso e il formazan generato è stato sciolto da DMSO per 30 minuti. Infine, le concentrazioni di formazan sono state misurate a 570 nm utilizzando la spettrofotometria su micropiastra. La vitalità cellulare è stata calcolata come segue: vitalità cellulare (percentuale)=(campione - vuoto)/(controllo A - vuoto)*100.

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Test del contenuto di melanina

Le cellule 3 × 105 B16F10 sono state seminate per pozzetto in una 6-piastra a pozzetti e incubate per 24 h per far aderire. Il mezzo di ciascun pozzetto è stato scambiato con uno contenente varie concentrazioni di enzima e 10 nM -MSH, quindi incubato per 72 ore. Successivamente, i pozzetti sono stati tutti lavati con tampone DPBS e raccolti utilizzando una soluzione di tripsina/EDTA allo 0,5%. I pellet di cellule ottenuti mediante centrifugazione sono stati lisati con 200 μL di NaOH 1 N contenente il 10 percento di DMSO per 1 ora a 80 gradi. Infine, il contenuto di melanina lisata è stato misurato mediante l'assorbanza a 450 nm. L'efficienza di inibizione della produzione di melanina dell'enzima è stata determinata mediante confronto con il controllo positivo utilizzando 100 mg/mL di arbutina.

Risultati

Attività perossidasica di glutatione perossidasi (GPX), tiolo perossidasi (TPX) e catalasi

Questo studio è una ricerca di estensione dell'applicazione del trattamento della frazione lisosomiale per decolorare i composti della melanina in vitro e in vivo. In uno studio precedente, abbiamo scoperto che la frazione lisosomiale isolata dalle cellule Hela, S. cerevisiae, uovo di gallina ha l'effetto di ridurre il colore della melanina e ill'efficienza della decolorazione della melanina era associata all'attività perossidasica della frazione microsomiale non legata alla membrana della frazione lisosomiale, inclusi lisosomi e perossisomi. Per confermare l'effetto di riduzione del colore della melanina delle perossidasi, sono state selezionate tre perossidasi, glutatione perossidasi (GPX), tiolo perossidasi (TPX) e catalasi. Questi enzimi svolgono un ruolo importante nel ridurre lo stress ossidativo causato dalle specie reattive dell'ossigeno nelle cellule [14].

L'attività di questi enzimi è stata determinata mediante kit di analisi (kit di analisi della perossidasi, D2PD-100, QuantiChrom™). Questo metodo si basava sull'ossidazione del colorante donatore di elettroni che forma un colore rosa durante la reazione della perossidasi [15]. L'attività della perossidasi è stata espressa utilizzando le seguenti unità: 1 unità=1 U=la formazione di 1 µmole di resorufina al minuto nelle condizioni del test. La tabella 1 riassume l'attività e la concentrazione delle tre perossidasi, GPX, TPX e Catalasi.

Attività di decolorazione della melanina di glutatione perossidasi (GPX), tiolo perossidasi (TPX) e catalasi

Per confermare l'effetto di decolorazione della melanina delle perossidasi, una soluzione di melanina a 100 ppm è stata trattata con perossido di idrogeno 1 mM e una concentrazione (da 50 a 1000) µU/L di ciascuna perossidasi. I campioni sono stati fatti reagire per 2 giorni a temperatura ambiente, quindi confrontati con la concentrazione iniziale. La figura 1 mostra la diminuzione della melanina dopo 48 h. La figura 1 mostra l'evidenza che TPX e GPX hanno attività di decolorazione della melanina. La catalasi non ha avuto alcun effetto sulla riduzione del colore della melanina (Fig. 1a). Il TPX era efficace nel decolorare i composti di melanina e l'efficienza era migliore se trattata a una concentrazione di 1 µU/mL (Fig. 1b). Il GPX aveva anche un'attività di riduzione del colore della melanina, che era migliore alla concentrazione di 0,2 µU/mL, e diminuiva gradualmente a concentrazioni più elevate (Fig. 1c). Questo valore rappresenta una riduzione del colore della melanina migliorata del 175%, rispetto al controllo trattato solo con perossido di idrogeno. Il GPX era più efficiente in termini di concentrazione e attività della perossidasi, rispetto al TPX. Il trattamento di 0,2 µU/mL GPX e 1 mM di perossido di idrogeno ala soluzione di melanina ha decolorato il 13 percento di 100 ppm di melanina per 4 giorni (Fig.2). Tuttavia, né GPX né TPX hanno mostrato alcun effetto di riduzione del colore in assenza di perossido di idrogeno (dati non mostrati).

Tabella1 Dati specifici degli enzimi, Glutatione Perossidasi 2, Tiolo Perossidasi e Catalasi

Effetto della glutatione perossidasi (GPX) e H2O2 sulla vitalità cellulare B16F10

L'effetto della GPX sulla vitalità dei melanomacellule B16F10 è stato confermato dal test MTT, prima del test di inibizione della sintesi della melanina. Per trovare la corretta concentrazione di perossido di idrogeno da trattare, la citotossicità è stata valutata mediante trattamento con perossido di idrogeno per 72 ore a diverse concentrazioni. Alla concentrazione di 0.1 mM, l'H2O2 non ha avuto tossicità cellulare per le cellule per 72 ore, mentre a una concentrazione superiore a 1 mM è stata osservata una grande tossicità. (Fig. 3a). L'effetto della GPX sulla sopravvivenza cellulare è stato quindi valutato in presenza di 0.1 mM di perossido di idrogeno, che non era citotossico. Il GPX non aveva citotossicità per le cellule B16F10 al di sotto della concentrazione di 0,5 μU/mL, che era efficace negli studi di melanindecolorazione (Fig. 3b).

Fig. 1La relativa riduzione del colore della melanina rispetto al trattamento del solo perossido di idrogeno.

Effetto della sintesi di glutatione perossidasi (GPX) e H2O2on nelle cellule di melanoma B16F10

Abbiamo studiato l'effetto di GPX, che era più efficace sulla decolorazione della melanina, sulla sintesi della melanina nei mel-anociti. La figura 4 mostra il contenuto di melanina nelle cellule di melanoma B16F10 trattate con ciascun campione per 72 ore. Il trattamento con 0.05 μU/mL di GPX e 0,1 mM H2O2 ha indotto la maggior inibizione della melanogenesi del 43% rispetto al controllo (solo trattamento con -MSH). Questo era il 153 percento in più rispetto al controllo positivo (trattamento con Arbutina e -MSH) e il 22 percento in più rispetto a quello del perossido di idrogeno senza enzima, mentre il trattamento con GPX non ha mostrato una drastica riduzione della melanina in assenza di perossido di idrogeno supporta anche questo punto di vista (dati non mostrati). Di conseguenza, GPX ha inibito la produzione di composti di melanina, ma la sintesi di melanina nelle cellule è stata più influenzata dal perossido di idrogeno che da GPX.

Discussione

In questo studio, i nostri ricercatori hanno trovato la concentrazione ottimale e l'effetto di GPX, TPX e Catalasi, enzimi antiossidanti che riducono lo stress ossidativo nelle cellule, sulla decolorazione dei composti della melanina. Come risultato di esperimenti extracellulari che utilizzano composti di melanina sintetizzati, GPX e TPX hanno un effetto decolorante della melanina, ma Catalasedo no. Ci sono rapporti secondo cui gli enzimi che degradano la lignina in alcuni funghi, come una laccasi, la lignina perossidasi, possono scomporre la melanina in presenza di perossido di idrogeno [16-18]. Attraverso questo studio, è stato confermato che gli enzimi antiossidanti, che sono in tutti gli eucarioti e non enzimi che degradano la lignina, hanno attività decolorante della melanina. Sebbene GPX e TPX possano anche ridurre il colore della melanina in presenza di perossido di idrogeno, questi enzimi hanno la possibilità di agire come un componente importante del meccanismo di decolorazione della melanina della frazione lisosomiale.

GPX, che era più efficace per ridurre la colorazione della melanina in vitro, è stato trattato con cellule di melanoma B16F10 per determinarne l'effetto sulla sintesi della melanina. Nelle cellule di melanoma B16F10, GPX non era citotossico a concentrazioni efficaci nella decolorazione dei composti di melanina e la concentrazione di perossido di idrogeno trattati insieme era di 0,1 mM, senza tossicità. Il trattamento del perossido di idrogeno ha inibito notevolmente la sintesi di melanina e, quando si lavorava con GPX, l'efficienza era migliore, mentre non c'era dipendenza dalla concentrazione del farmaco. Poiché il perossido di idrogeno viene rapidamente consumato dagli enzimi, si può interpretare che maggiore è la concentrazione di enzima da trattare, minore è l'inibizione della sintesi della melanina da parte del perossido di idrogeno. Anche il fatto che il trattamento della GPX non abbia mostrato una drastica riduzione della melanina in assenza di perossido di idrogeno supporta questa opinione (dati non mostrati). Di conseguenza, GPX ha inibito la produzione di composti di melanina, ma la sintesi di melanina nelle cellule è stata più influenzata dal perossido di idrogeno che da GPX. Questi risultati suggeriscono che gli enzimi antiossidanti inducono la degradazione della melanina nei meccanismi dell'autofagia che digeriscono i melanosomi.

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Conclusione

Il nostro studio mostra che la glutatione perossidasi (GPX) e la tiolo perossidasi (TPX) contribuiscono alla decolorazione della melanina e la GPX inibisce efficacemente la sintesi della melanina. I risultati supportano l'ipotesi che gli enzimi antiossidanti inducano la degradazione della melanina nei meccanismi dell'autofagia che digeriscono i melanosomi. Per raggiungere una conclusione definitiva, può essere necessario studiare il meccanismo di digestione dei melanosomi nelle cellule della pelle, nei cheratinociti e nei melanociti.