La melatonina previene l'infiltrazione dei linfociti T nei reni dei ratti ipertesi, indotta da una dieta ricca di sale, prevenendo l'espressione delle chemochine del ligando CXCR3
Mar 14, 2022
Per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com
Ariel Birer1, Rawan Khashab2, Yehonatan Sharabi1,2,3, Ehud Grossman1,2,3e Avshalom Leibowitz1,2,3,*
1Medicine D, The Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israele; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (ES)2 Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com3Facoltà di Medicina Sackler, Università di Tel-Aviv, Tel-Aviv 6997801, Israele*
Riassunto: In uno studio precedente, lo abbiamo dimostratomelatoninaprevienerenedanno in un modello di ipertensione indotta da sale diminuendo lo stress ossidativo. Abbiamo ipotizzato che questo effetto coinvolga le proprietà immunomodulatorie della melatonina. In vivo Study-Dahl ratti sensibili al sale (DSS) sono stati nutriti con cibo normale, una dieta ricca di sale (HSD) o un HSD emelatonina(30 mg/kg/giorno) nella loro acqua per otto settimane.Renisono stati raccolti per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti immediati mediante citometria a flusso (CD3 più CD4 plus e CD3 più CD8 plus) e per chemioattrattivo linfocitario (principalmente CXCLchemochine) studi sull'espressione genica. Studio in vitro su ratto, cellule mesangiali (RMC) sono state coltivate in un mezzo ad alto contenuto di sale senza e conmelatonina. Un HSD è stato associato a una significativa infiltrazione renale di linfociti T CD4 plus e CD8 plus rispetto al controllo. La melatonina ha ridotto significativamente l'infiltrazione dei linfociti renali. Un HSD ha aumentato significativamente l'espressione dell'mRNA di CXCLchemochine.L'aggiunta di melatonina all'HSD ha abolito questo effetto. Il trattamento delle cellule RMC con sale ha aumentato l'espressione di CXCL10 e CXCL11 ma non di CXCL9. Aggiuntamelatoninaai media della cultura ha impedito questo aumento. Il trattamento di ratti alimentati con HSD con melatonina ha ridotto l'espressione dell'mRNA chemioattrattore dei linfociti renali ed è associato a una riduzione significativa dell'infiltrazione dei linfociti T renali. Il sale può avere un effetto diretto sulle cellule renali che producono chemochine, che viene attenuato dal trattamento con melatonina.
Parole chiave:melatonina; sale; linfociti T; ipertensione;rene; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11
1. Introduzione
L'ipertensione (HTN) è un importante fattore di rischio cardiovascolare modificabile. A causa dell'invecchiamento della popolazione, la prevalenza di HTN è in costante aumento, raggiungendo fino al 30 per cento in età avanzata [1]. Nonostante le varie opzioni terapeutiche mediche, il controllo mondiale dell'HTN è scarso. Le conseguenze dell'HTN incontrollato sono devastanti, creando un enorme impatto negativo sulla salute pubblica [2].
Vari fattori comportamentali, ambientali e genetici sono coinvolti nella patogenesi dell'HTN. L'alto contenuto di sale nelle diete occidentali è stato implicato come un importante contributo all'HTN ed è associato ad un aumento della morbilità e della mortalità. Linee guida e iniziative pubblicitarie raccomandano di ridurre l'assunzione di sale per la popolazione generale. Tuttavia, non tutti gli individui possono trarre beneficio da questa restrizione, poiché la fisiopatologia che collega la sensibilità al sale all'HTN non è completamente compresa e necessita di una migliore comprensione meccanicistica [3]. Pertanto, nuove strategie sono cruciali per una migliore comprensione e controllo HTN, rendendo i nuovi paradigmi di ricerca una necessità immediata.
È stato scoperto che l'infiammazione e lo stress ossidativo sono coinvolti nella patogenesi dell'HTN essenziale. Durante la ricerca per i trigger che avviano e continuano questi processi, molti modelli sperimentali HTN suggeriscono il coinvolgimento della risposta immunitaria adattativa [4].
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Gli indizi che collegano l'immunità adattativa all'HTN esistono già dagli anni '60. Tuttavia, solo di recente, con una migliore comprensione del sistema immunitario, è stato possibile ottenere progressi in questa direzione. Uno studio pionieristico di Guzik et al. ha dimostrato che l'angiotensina (Ang) II o il sale di deossicorticosterone (DOC) HTN è stato smussato nei topi rag1-/-, che sono carenti di linfociti T e B, e il trasferimento adottivo di cellule T, ma non di cellule B, potrebbe ripristinare la risposta BP [5]. Da questo documento, vari componenti dell'immunità adottiva sono risultati rilevanti per la patogenesi dell'HTN nella maggior parte dei modelli animali comuni. Anche il ruolo delle cellule T nel modello HTN indotto dal sale è stato ampiamente studiato. Studi in vitro mostrano che il sale può spingere la differenziazione ingenua delle cellule T nelle cellule TH17 [6]. Numerosi lavori in vivo nei modelli HTN indotti da dieta ricca di sale (HSD), come i ratti sensibili al sale Dhal (DSS), mostrano un'estesa infiltrazione di cellule T renali [7-9].
Tra i tanti processi fisiologici,di melatoninail coinvolgimento con la regolazione della pressione sanguigna è alquanto intuitivo. Il modello circadiano della pressione sanguigna ha incoraggiato un'ampia ricerca sulla melatonina e l'HTN. Molti lavori in passato, nell'uomo e in modelli sperimentali, hanno collegato bassi livelli di melatonina all'HTN [10]. Ci sono alcuni dati clinici che suggeriscono che la supplementazione di melatonina può trattare l'HTN, principalmente per i pazienti con HTN notturna [11]. L'incoerenza di questi dati, tuttavia, solleva interrogativi sul fatto che le proprietà della melatonina non circadiane siano coinvolte anche nella regolazione della pressione sanguigna.
Le proprietà antinfiammatorie e antiossidanti della melatonina hanno suggerito che la melatonina interagisce con il sistema immunitario. I dati emergenti hanno implicato il ruolo della segnalazione della melatonina nello sviluppo, nell'attivazione, nella differenziazione e nella memoria delle cellule T. Ci sono prove chemelatoninamembrana e recettori nucleari sono presenti sui linfociti T [12,13].Melatoninainfluenza la produzione di molte citochine coinvolte nella risposta immunitaria, come l'interferone (IFN), che è un regolatore cardine della risposta Th1 [14].
Lo stress ossidativo e la risposta dei linfociti T, secondo alcuni ricercatori, lavorano di concerto favorendo lo sviluppo dell'HTN e del danno ipertensivo d'organo [15]. Nel nostro lavoro precedente, lo abbiamo dimostratomelatoninariduce lo stress ossidativo locale (renale) e previene la fibrosi renale indotta dal sale e la proteinuria in un modello di ratto HTN sensibile al sale (il modello DSS) [16]. Poiché lo stress ossidativo ha un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria adattativa associata all'HTN, abbiamo ipotizzato che le proprietà immunomodulatorie della melatonina siano responsabili del suo ruolo protettivo nell'HTN indotto dall'HSD.
Lo scopo di questo studio è valutare semelatoninadiminuisce la risposta delle cellule T indotta dal sale e per chiarire i meccanismi responsabili di questo effetto.
2. Materiali e metodi
2.1. Animali e protocollo di studio
Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato istituzionale per l'etica degli animali nel centro medico Sheba in Israele. Il loro stato di salute è stato monitorato misurando il peso corporeo e un'osservazione generale quotidiana per il movimento e le condizioni di salute di ciascun animale. I ratti maschi sensibili al sale Dahl, di quattro settimane (RGD Cat# 1582190, RRID: RGD_1582190), erano alloggiato in una struttura per animali in gabbie regolari (due ratti per gabbia) a 22 ◦C con un ciclo di 14 ore di luce/10 ore di buio. I ratti sono stati mantenuti su una normale dieta salata e gli è stata data acqua del rubinetto da bere ad libitum per un periodo di acclimatazione di cinque giorni. I ratti sono stati quindi divisi in tre gruppi (n=8), in base alla dieta, per un periodo di 8 settimane. Secondo il comitato etico, gli animali che mostravano segni di malattia e sofferenza dovevano essere sacrificati.
Il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard di cibo per topi (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) e acqua di rubinetto; il gruppo della dieta ricca di sale (HSD) è stato alimentato con una dieta salata arricchita abbinata (4 percento) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) e acqua del rubinetto, e ilmelatoninagruppo è stato alimentato con la stessa dieta salina arricchita (4%) con melatonina (M5250; Sigma, Rehovot, Israele) (30 mg/kg/giorno) nell'acqua da bere. Il peso corporeo e il consumo di acqua sono stati misurati periodicamente. La corretta quantità di melatonina è stata disciolta nel fabbisogno idrico della partita per ciascuna gabbia al fine di fornire la dose corretta per ciascun animale. Il giorno zero è definito come il giorno di inizio del consumo di HSD e melatonina. Al termine dello studio, i ratti sono stati sacrificati mediante profonda anestetizzazione con isoflurano al 3% (profondità dell'anestesia confermata dalla spremitura del piede posteriore) e ilrenisono stati raccolti. Entrambi i reni sono stati rimossi e sezionati. I reni sono stati prelevati per l'analisi della citometria a flusso ad eccezione di diverse porzioni che sono state rapidamente rimosse e congelate a scatto in N2 liquido e conservate a -80 ◦C. I tessuti congelati sono stati utilizzati per l'estrazione dell'RNA.
Sintomi della malattia renale-cistanca
2.2. PCR quantitativa in tempo reale della trascrizione inversa
I livelli di espressione di mRNA dei geni sono stati accertati nelrenetessuto mediante PCR quantitativa in tempo reale della trascrittasi inversa (qRT-PCR). L'RNA totale è stato estratto dal tessuto renale utilizzando un kit di RNA NucleoSpin (MACHERY-NAGEL, Düren, Germania). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando un kit di trascrizione inversa cDNAReverse ad alta capacità di Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Le reazioni qRT-PCR sono state eseguite utilizzando il Master Mix Power SYBR Green PCR (Applied Biosystems, Warrington, Regno Unito) e il sistema PCR in tempo reale Applied Biosystems 7500. Le condizioni di ciclo erano: una prima fase singola di 95 ◦C per 0.20 min e poi 40 cicli di fase di fusione per 3 s a 95 ◦C e una fase estesa di 30 s a 60 ◦C. Al termine dei 40 cicli, è stata eseguita una fase curva di fusione. L'mRNA della subunità del gambo laterale della proteina ribosomiale P0 (Rplp0) è stato utilizzato come controllo interno. I primer sono elencati nella tabella 1.
Tabella 1. Elenco dei primer per ratti utilizzati in questo studio.
2.3. Isolamento dei linfociti T dai reni
Dopo aver rimosso la capsula renale, i duerenisono stati tritati e presi in giro con lo stantuffo di una siringa da 2 ml attraverso un colino cellulare da 100 µm in RPMI 1640 contenente 2 mML-glutammina, 10% FBS, 10 ug/mL DNasi 1 (tecnologie staminali, Cambridge, MA , USA) e 0,1% di collagenasi di tipo IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, USA). La soluzione è stata incubata per 25 minuti a 37 ◦C. La soluzione di lavaggio (DPBS/2 percento FBS/2 mM EDTA) è stata quindi aggiunta all'omogenato di rene fino a raggiungere 45 mL ed è stata filtrata attraverso un trainer cellulare da 70 µm. La soluzione è stata centrifugata a 400 x g/7 min. e il pellet è stato sospeso in una soluzione di lavaggio da 5 mL e filtrato attraverso un colino cellulare da 40 µm e recentifugato a 400 × g/7 min. Il pellet è stato risospeso in 3 ml di FBS (10 mM EDTA) e stratificato su Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Israele) e centrifugato a 20 °C a 400 × g/30 min con il freno disattivato. Lo strato di cellule mononucleate che riposava sopra l'Histopaque è stato rimosso, lavato con soluzione di lavaggio due volte e sospeso in una soluzione di lavaggio da 5 mL per l'analisi citofluorimetrica.
2.4. Citometria a flusso
Da ogni gruppo,renisono stati analizzati da 5 a 7 ratti. Per ogni campione sono state prelevate 1 × 106 cellule. Le cellule mononucleate isolate sono state incubate con marcatori extracellulari: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) e il suo controllo isotipico (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) e il suo controllo isotipico (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) e relativo controllo isotipico (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRD: AB_657914). Tutte le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) utilizzando il software FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).
Funzione Cistanche-rene
2.5. Coltura cellulare
La linea cellulare di ratto mesangiale, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), è stata ottenuta da ATCC®. La cellula è stata coltivata nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco (01-055-1A, industrie biologiche, Beit HaEmek, Israele) con L-glutammina 4 mM regolata per contenere 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 4,5 g/L di glucosio e integrata con 0,4 mg/mLG418 e 15% di siero bovino fetale. La melatonina è stata ottenuta da Sigma (M5250 Rehovot, Israele). A 250 mmmelatoninail brodo è stato prodotto in etanolo. Le cellule sono state coltivate in condizioni normali o ad alto contenuto di sale (aggiungendo 80 mM NaCl al mezzo) senza o con melatonina (0,5 mM). Il trattamento con melatonina è stato temporizzato 45 minuti prima di aggiungere NaCl al mezzo. Tutti gli esperimenti erano in piastre da 6 pozzetti con 3 × 105 cellule per pozzetto e sono stati eseguiti da 6 prove indipendenti.
2.6. Analisi statistica
I dati sono presentati come media ± SEM Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. L'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e il metodo Tukey posthoc hanno esaminato le differenze tra i gruppi. I dati qPCR in tempo reale sono stati analizzati utilizzando DataAssist, RRID: SCR_014969.
3. Risultati
3.1. La melatonina protegge i ratti che consumano un HSD
L'età dei ratti durante questo studio era di 4-13 settimane. A questa età, il benessere dei ratti è indicato dall'aumento di peso che è stato mostrato dal gruppo di controllo [17]. Tuttavia, il gruppo HSD ha raggiunto un plateau al giorno 30 e l'aggiunta dimelatoninaall'HSD ha migliorato questo fenomeno (Figura 1A). Il gruppo HSD ha mostrato un alto tasso di mortalità, in cui il 50 per cento dei ratti è morto o ha avuto una condizione clinica che ha richiesto l'eutanasia secondo le regole del comitato animaletico, durante il periodo sperimentale. Gli integratori di melatonina hanno impedito significativamente la mortalità dei ratti, dove solo un ratto su otto è morto al giorno 58, alla fine del periodo sperimentale (Figura 1B).
Figura 1.Melatoninamiglioramento della pressione sanguigna e sopravvivenza nell'HSD. I ratti DSS sono stati trattati per 9 settimane con HSD con e senza melatonina. Una dieta ricca di sale ha ridotto il peso corporeo dal giorno 36 e la melatonina ha moderato questo effetto (A). L'HSD ha aumentato il tasso di mortalità dal giorno 40. Il trattamento di HSD-fedrat con melatonina migliora la loro sopravvivenza. (B). (n=8) *-p Inferiore o uguale a 0.05 sale e sale più melatonina rispetto al controllo. #-p Inferiore o uguale a 0,05 sale rispetto al controllo e sale più melatonina. HSD: dieta ricca di sale.
3.2. La melatonina previene l'infiltrazione dei linfociti T renali indotta dall'HSD
Abbiamo isolato le cellule dalrenee li ha collegati al marcatore delle cellule T, CD3. Le cellule CD3 plus sono state gated a CD4 e CD8. Sia CD3 più CD4 più che CD3 più CD8 più erano significativamente più alti nell'HSD (5,18 ± 1,62 e 4,6 ± 0,75 percento, rispettivamente) rispetto al controllo (0,16 ± {{18} }.{{20}}2 e 0,95 ± 0,15 percento, rispettivamente) emelatoninal'integrazione con l'HSD ha ridotto entrambe le cellule CD3 più CD4 più e CD3 più CD8 più ai livelli di controllo (0.68 ± 0.21 e 1.37 ± 0.45, rispettivamente) (Figura 2A–D).
Figura 2. La melatonina impedisce l'infiltrazione di cellule T nelrene. Le cellule T sono state isolate dai reni dei ratti e sono state gated per CD3. Le cellule CD3-positive sono state gated per CD4 e CD8. La melatonina (C) ha ridotto sia CD3 più CD4 plus che CD3 più CD8 plus rispetto all'HSD senza melatonina (B) senza differenze rispetto al gruppo di controllo (A). L'analisi per tutti i ratti è mostrata in (D) (n=7–8). HSD: dieta ricca di sale. *-p Minore o uguale a 0.05 rispetto al controllo. #-p Inferiore o uguale a 0,05 rispetto a sale più melatonina.
3.3. La melatonina riduce alcune chemochine renali che erano sovraregolate nell'HSD
Il reclutamento di cellule T nei tessuti infiammatori è regolato dall'espressione locale di chemochine. Pertanto, abbiamo misurato l'espressione di due famiglie di chemochine nei rattireni: la famiglia dei ligandi delle chemochine (motivo CXC) (CXCL) e la famiglia dei ligandi delle chemochine (C-Cmotif) (CCL).
Per la famiglia CXCL, CXCL 9, 10 e 11 che attirano le cellule T al loro tessuto bersaglio utilizzando il recettore CXCR3 sulle cellule T, sono state significativamente sovraregolate nei ratti HSD. L'integrazione dimelatoninaall'HSD hanno ridotto la loro espressione ai livelli di controllo. Lo stesso modello è stato rilevato per CXCL 1 e 16. Tuttavia, per CXCL12, non è stata rilevata alcuna sovraregolazione nell'HSD (Figura 3A).
Per la famiglia CCL, CCL 2, 4, 12, 17, 19 e CX3CL1 non hanno mostrato sovraregolazione nell'HSD. CCL3 era sovraregolato nell'HSD, ma non è stato rilevato alcun cambiamento significativo con l'aggiunta di melatonina alla dieta. Per CCL7, una significativa sovraregolazione nell'HSD e una significativa sottoregolazione con l'aggiunta dimelatoninaall'HSD è stato rilevato (Figura 3B).
Figura 3. Sovraregolazione direnichemochinein HSD con e senza melatonina. L'espressione della famiglia del ligando di chemochine (motivo CXC) (CXCL) (A), della famiglia del ligando di chemochine (motivo CC) e CX3CL1 (B) sono state determinate nei ratti. (n=7–8) *-p Minore o uguale a 0.05 rispetto al controllo. #-p Inferiore o uguale a 0,05 rispetto a sale più melatonazione. HSD: dieta ricca di sale.
3.4. L'effetto diretto della melatonina sulla linea cellulare mesangiale RMC
Ci siamo quindi concentrati su CXCL9, 10 e 11 che attirano le cellule T legandosi al recettore CXCR3. Abbiamo determinato l'espressione di questichemochinenelle cellule RMC che sono una linea cellulare mesangiale di ratto.
Abbiamo trattato le cellule con 80 mM NaCl senza e con 0,5 mMmelatonina. Questa concentrazione di NaCl ha aumentato significativamente l'espressione di CXCR10 di 2,4 ± 0.26- volte rispetto al controllo e l'aggiunta di 0,5 mM di melatonina è diminuita significativamente questa espressione a 1,4 ± 0.{{10}} volte rispetto al controllo (Figura 4A). Per CXCL11, 80 mM NaCl ha aumentato significativamente l'espressione di 3 ± 0.48- volte rispetto al controllo e l'aggiunta di 0,5 mM di melatonina ha ridotto significativamente questa espressione a 1,8 ± 0.{{22 }}piega rispetto al controllo (Figura 4B). CXCL9 non è stato rilevato nelle cellule RMC.
Figura 4. Espressione sovraregolata di CXCL10 e CXCL11 in una linea cellulare mesangiale in cui il trattamento con melatonina ha sottoregolato la sua espressione. RMC (linea cellulare mesangiale di ratti) è stata trattata con sale80 mM con e senza melatonina 0,5 mM. CXCL10 (A) e CXCL11 (B) sono stati sovraregolati mediante trattamento con sale e aggiunta dimelatoninaridurre questa sovraregolazione. I grafici presentano 6 prove indipendenti. *-p Minore o uguale a 0.001 rispetto al controllo #-p Minore o uguale a 0.005 rispetto al sale 80 mM e melatonina 0,5 mM. $-p Inferiore o uguale a 0,05 rispetto al sale 80 mM e alla melatonina 0,5 mM.
4. Discussione
L'effetto benefico dimelatoninasull'HTN è stato dimostrato in studi precedenti ed è stato suggerito come possibile linea d'azione per l'HTN resistente al trattamento [18]. Nel nostro primo studio, ci siamo concentrati sullo stress ossidativo e abbiamo rivelato che la melatonina riduce lo stress ossidativo indotto dall'HSD. Nel presente studio, ci siamo concentrati sull'effetto immunitario adattativo e abbiamo dimostrato che la melatonina migliora la sopravvivenza dei ratti alimentati con HSD. Questo effetto è associato a una riduzione delle cellule T che si infiltrano nel rene e alla downregulation direneespressione di chemochine.
I dati storici dimostrano che i ratti DSS che consumano un HSD sviluppano un grave HTN e mostrano tassi di mortalità più elevati [19]. Lo stesso Dahl ha riferito mentre stabiliva il modello che quando i ratti DSS venivano posti su un HSD (8% di NaCl) allo svezzamento (21-23 giorni di età), sviluppavano rapidamente HTN e morivano tutti entro la 16a settimana di alimentazione con sale [20]. Lateron, dopo alcune modifiche del ceppo, Rapp et al. riportato che tutti i ratti erano morti entro otto settimane dall'HSD (8% NaCl) [21]. I ratti nel nostro studio avevano un alto tasso di mortalità ma non raggiungevano il 100 percento, probabilmente a causa della percentuale più bassa (4 percento) di sale nella loro dieta. Tuttavia, è ovvio chemelatoninal'integrazione ha prevenuto significativamente la mortalità dei ratti.
L'aumento di peso è un indicatore del benessere dei ratti all'età di 4-13 settimane. DSS derivato da Sprague Dawley, che è un ceppo ben caratterizzato. All'età dei ratti che abbiamo utilizzato nei nostri esperimenti, si suppone che i ratti aumentino di peso in modo consistente [22]. In molti studi sugli animali, la riduzione del peso è considerata uno degli "endpoint" degli esperimenti [23]. Da diversi studi, è chiaro che un HSD nei ratti DSS comporta tassi di guadagno di peso inferiori rispetto ai controlli [24,25]. In accordo con questi studi, abbiamo anche osservato differenze di peso tra i gruppi. Qui, i ratti non sono aumentati di peso dopo quattro settimane di HSD. Anche la melatonina ha interrotto questo effetto dell'HSD, poiché i ratti trattati con melatonina hanno continuato ad aumentare di peso, anche se meno dei controlli.
La capacità dimelatoninaper ridurre la pressione sanguigna in modelli animali è stato scoperto alla fine degli anni Settanta del 20° secolo [26–28]. Da allora, è stato riportato in molti altri modelli, come ad esempio che una dieta ricca di fruttosio induce sindrome metabolica in ratti spontaneamente ipertesi [29,30]. I nostri studi in questo campo sono i primi a dimostrare che la melatonina svolge un ruolo nell'HTN indotto dal sale, prevenendo il danno d'organo e riducendo la mortalità.
In questo studio, abbiamo dimostrato che un HSD induce l'infiltrazione di linfociti T nelrene, un processo che è stato descritto nei ratti DSS principalmente dal gruppo di Mattson [31-33]. Il ruolo fondamentale di questo processo di infiltrazione nel modello DSS è stato dimostrato da uno studio recente che ha osservato che i ratti DSS carenti di cellule T sono protetti da L'HTN indotto da un HSD e un trasferimento di splenociti esacerba l'HTN sensibile al sale [34].
La melatonina può influenzare le cellule T in vari aspetti (per la revisione, vedere [35]). Questo studio lo ha dimostrato per la prima voltamelatoninariduce l'attrazione delle cellule T CD4 plus e CD8 plus verso ilrenenell'HSD. Questo effetto della melatonina potrebbe essere il meccanismo che ne sottolinea l'effetto benefico in questo modello.
La capacità della melatonina di ridurre l'infiltrazione delle cellule T è stata descritta nel modello sperimentale di topi con encefalomielite autoimmune (EAE). In EAE, è stato dimostrato che la melatonina riduce l'infiltrazione di cellule T CD4 più e cellule Th17 nel SNC [36,37].
L'attrazione dei linfociti T verso un tessuto specifico è regolata principalmente da alte concentrazioni locali dichemochineche sono citochine chemiotattiche che controllano i modelli migratori e il posizionamento delle cellule immunitarie. Due grandi famiglie di chemochine che inducono l'infiltrazione dei linfociti T sono le famiglie di chemochine del ligando del motivo CXC (CXCL) e del ligando del motivo CC (CCL) [38].
Cistanche per migliorare la disfunzione renale
Nel nostro studio, non abbiamo trovato un modello costante nella risposta della famiglia CCL a un HSD e amelatonina. Dei novechemochinein questa famiglia, solo CCL7 e CLL21 sono stati osservati per aumentare la loro espressione a causa dell'HSD e l'integrazione di melatonina lo ha ridotto. Un HSD ha aumentato l'espressione di CCL3, ma non è stata rilevata alcuna riduzione nei ratti trattati con melatonina. Uno studio recente sullo stesso modello ha dimostrato che un HSD sovraregola CCL2 nelreneutilizzando il metodo RNA-Seq [39]. Tuttavia, questo studio ha testato i livelli nei giorni 3 e 21 dopo l'inizio della dieta. Nel nostro studio, abbiamo testato i livelli dopo otto settimane. È possibile che l'espressione delle chemochine cambi durante il periodo HSD.
Al contrario, i livelli della maggior parte della famiglia CXCL, inclusi CXCL 1, 9, 10, 11 e 16, sono aumentati nei ratti trattati con HSD emelatoninal'integrazione ha abolito questo incremento. Solo CXCL12 non ha mostrato alcun aumento in risposta all'HSD.
CXCL9, CXCL10 e CXCL11, denominati "ligandi del recettore 3 delle chemochine CXC inducibili dall'interferone", sono indotti dall'IFN- e sono i ligandi del recettore 3 delle chemochine CXC (CXCR3). Studi in vivo hanno dimostrato la loro importanza nell'attivazione e nel reclutamento dei linfociti T nell'organo bersaglio [40-42]. Youn et al. ha mostrato, in pazienti umani ipertesi, sia infiltrazione renale di cellule T che elevati livelli circolanti di tutti e tre i CXCR3chemochine, suggerendo che CXCR3 e i suoi ligandi sono rilevanti per le cellule T coinvolte nell'HTN umano [43]. Un altro studio ha dimostrato che CXCL10 è elevato nei pazienti ipertesi e i suoi livelli sono correlati ai loro valori di pressione sanguigna [44].
Grazie a questi studi, ci siamo concentrati su CXCL9, CXCL10 e CXCL11. Abbiamo coltivato la linea cellulare di ratto mesangiale e li abbiamo trattati con NaCl 80 mM e melatonina 0, 5 mM. Abbiamo scoperto che CXCL 10 e 11 sono sovraregolati nelle cellule e la melatonina abolisce questa elevazione. I nostri risultati indicano che l'effetto del sale nell'elevare CXCL 10 e 11 e l'effetto opposto dimelatonina, sono stati entrambi rilevati direttamente nelle cellule mesangiali. Al contrario, CXCL9 non è stato rilevato in queste cellule.
Il nostro studio ha dei limiti. Nei nostri risultati FACS, molti dei CD3 plus erano doppiamente negativi sia per CD4 che per CD8. Gli stessi risultati sono stati osservati nello studio di Mattson del 2010 [31]. Tuttavia, in studi più recenti del gruppo di Mattson, le cellule CD3 più CD4-CD8- erano molto poche [32,33,45,46]. La significativa diminuzione delle cellule CD3 doppie negative potrebbe essere il risultato dell'aggiunta del marker CD45 e dell'analisi solo delle cellule CD45 positive, che è quanto è stato effettuato negli studi successivi di Mattson. È possibile che la vasta popolazione del CD3 più CD4-CD8- sia un artefatto. Tuttavia, non sono noti artefatti per la popolazione cellulare CD3 plus CD4 plus e CD3 plus CD8 plus.
5. Conclusioni
In conclusione, una dieta ricca di sale è associata all'infiltrazione di cellule T nelrenidi ratti DSS. Il sale ha anche aumentato l'espressione di specifici chemioattrattivi dei linfociti T nel rene. Trattamento conmelatonina(30 mg/kg/giorno) ha abolito questi effetti (melatoninariduce l'infiltrazione di cellule T indotta da HSD nei reni insieme a una riduzione dell'espressione di chemochine del ligando CXCL3).
Il nostro studio in vitro dimostra che il sale e la melatonina possono regolare l'espressione chemioattrattiva influenzando direttamenterenecellule.
Contributi dell'autore: Concettualizzazione, AL; analisi formale, AB e RK; indagine, RK; metodo, AB e AL; scrittura: bozza originale, AB e AL; scrittura—revisione e montaggio, YS e EG Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
Finanziamento: questa ricerca non ha ricevuto finanziamenti esterni.
Dichiarazione del Comitato di revisione istituzionale: il protocollo di studio è stato approvato dal comitato istituzionale animaletico del centro medico Sheba, protocollo n. 1219/19/ANIM e protocollo n. 16418 del Ministero della salute.
Dichiarazione di consenso informato: Non applicabile.
Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: i dati presentati in questo studio sono disponibili su richiesta dell'autore corrispondente.
Ringraziamenti: Gli autori ringraziano Zehava Shabtai per il suo eccellente supporto tecnico e Michael Kanovsky per i suoi servizi editoriali.
Conflitti di interesse: Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
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