Le meta-analisi identificano la metilazione del DNA associata alla funzione renale e al danno

edmund.chen@wecistanche.com

Cronicomalattie renaliè un grave onere per la salute pubblica. L'elevato rapporto albumina urinaria/creatinina è una misura didanno ai reni,e usato per diagnosticare e mettere in scena la cronicamalattie renali. Ampliare le conoscenze sui meccanismi regolatori relativifunzione renalee malattia, abbiamo condotto uno studio di associazione sull'intero epigenoma basato sul sangue per la velocità di filtrazione glomerulare stimata (n=33,605) e il rapporto albumina urinaria/creatinina (n=15,068) e rilevato 69 e sette siti CpG in cui la metilazione del DNA era associata al rispettivo tratto. La maggior parte di questi risultati ha mostrato associazioni direzionalmente coerenti con i rispettivi esiti clinici della cronicamalattie renalie albuminuria moderatamente aumentata. Associazioni di metilazione del DNA confunzione renale, come i CpG a JAZF1, PELI1 e CHD2 sono stati convalidati intessuto renale. La metilazione a PHRF1, LDB2, CSRNP1 e IRF5 ha indicato effetti causali sufunzione renale. Le analisi di arricchimento hanno rivelato percorsi correlati all'emostasi e alla migrazione delle cellule del sangue per la velocità di filtrazione glomerulare stimata e l'attivazione e la risposta delle cellule immunitarie per i CpG associati al rapporto albumina-creatinina urinaria.

Parole chiave:malattie renali; danno ai reni; funzione renale; tessuto renale; struttura renale

cronicomalattie renali(CKD) è un grave onere per la salute pubblica. Colpisce oltre il 10% degli adulti nel mondo e oltre il 40% delle persone di età pari o superiore a 70 anni1,2. L'insufficienza renale cronica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo3 e contribuisce in modo determinante alla morbilità e mortalità cardiovascolare2,4,5. L'insufficienza renale cronica è definita come la presenza prolungata di anomalie direnestruttura o funzione. Ilfunzione renalele misure più comunemente utilizzate sono la velocità di filtrazione glomerulare, generalmente stimata dalle concentrazioni sieriche di creatinina (eGFR), e il rapporto albumina/creatinina urinaria (UACR)6. UACR elevato è una misura didanno ai reni, utilizzato per diagnosticare e stadiare la CKD7, ed è associato a diabetici e ipertesimalattie renali8. Anche un UACR moderatamente elevato è un fattore di rischio per le malattie cardiovascolari, indipendentemente dagli altrifunzione renale markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 loci genetici associatifunzione renale10,12,13. Le varianti dell'indice nei loci associati a eGFR noti spiegano una stima dell'8,9% della varianza eGFR12.Una recente meta-analisi GWAS di regioni di cromatina aperte integrate eGFR con piccoli insiemi di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)10. I risultati di questo studio supportano l'importanza della regolazione trascrizionale alterata come meccanismo che contribuisce all'insufficienza renale cronica. Per studiare la metilazione del DNA, rispetto afunzione renale, sono stati effettuati studi di associazione sull'intero genoma (EWAS) di eGFR e CKD. In quanto regolatore chiave della trascrizione che può essere valutato in modo efficiente in termini di costi e ad alto rendimento, la metilazione del DNA è stata studiata nei siti CpG (CpG) con risoluzione a base singola. In precedenza abbiamo condotto un EWAS che includeva 4859 adulti da due studi basati sulla popolazione e identificato 18 siti convalidati, differenzialmente metilati nel sangue intero associati a eGFR14. Sebbene questo studio abbia rivelato approfondimenti sui meccanismi di regolazione genica direnefunzione, i CpG associati spiegavano solo l'1,2 percento della varianza eGFR. Altri studi precedenti erano focalizzati su pazienti con insufficienza renale cronica e/o pazienti con diabete o pazienti con infezione da virus dell'immunodeficienza umana, o erano limitati da piccole dimensioni del campione, mancanza di replicazione, aggiustamento mancante per potenziali fattori confondenti o una combinazione di questi14-19. Altri studi si sono concentrati sui modelli di metilazione del DNA del diabeticomalattie renali(DKD) pazienti20–22.

CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE

Qui, abbiamo condotto un EWAS difunzione renaletratti per identificare ulteriori CpG correlati a meccanismi di regolazione genica di potenziale importanza per CKD. Abbiamo esteso il precedente EWAS per eGFR e CKD aumentando sostanzialmente la dimensione del campione a 33.605 individui. Inoltre, abbiamo incluso UACR e albuminuria moderatamente aumentata (microalbuminuria) come tratti aggiuntivi. Gli EWAS sono stati condotti in studi prevalentemente basati sulla popolazione che regolavano il sesso, l'età, il diabete, l'ipertensione, l'indice di massa corporea (BMI), lo stato di fumatore e le proporzioni più abbondanti di globuli bianchi. Abbiamo replicato i nostri risultati EWAS in campioni separati, correlato i siti CpG ai livelli di espressione genica in diversi tessuti, applicato i risultati ai risultati clinici e valutato la causalità tra metilazione del DNA efunzione renale(Supplementare Fig. 1).

Risultati

Studiare le caratteristiche del campione. In questa indagine, 36 studi con un totale di 33.605 partecipanti hanno contribuito a EWAS di eGFR e 15.068 a EWAS di UACR. Le loro caratteristiche aggregate sono mostrate nella Tabella 1 e le descrizioni dei singoli studi sono fornite nei Dati Supplementari 1 e 2.

EWAS di eGFR e UACR.Abbiamo studiato l'associazione direnetratti con metilazione del DNA nel sangue fino a 441.870 CpG, la sovrapposizione di CpG coperti da Illumina MethylationnEPIC BeadChip e l'array Illumina HumanMethylation450 BeadChip, che sono stati utilizzati per la misurazione da tutti gli studi tranne uno (dati supplementari 3). Tutti gli studi hanno eseguito la pulizia dei dati dell'array e applicato script sviluppati a livello centrale per la preparazione del filerenevalori di tratto, che sono stati successivamente correlati alla metilazione del DNA utilizzando modelli di regressione lineare aggiustati per covariata con valori di metilazione come variabile dipendente seguendo protocolli di studio pre-specificati (vedi Metodi). Abbiamo osservato un'inflazione nulla o scarsa nell'EWAS specifico dello studio (inflazione media eGFR=1.00, inflazione media UACR=1.00, dati supplementari 1 e 2). In un EWAS transetnico multivariabile, 69 CpG erano significativamente associati a eGFR e replicati (Fig. 1A, Dati supplementari 4, vedere Metodi), compresi quelli precedentemente riportati14. I siti replicati hanno mostrato un chiaro modello di metilazione inferiore (60 CpG, Pbinom=2.2E-10; Fig. 1A).

Fig. 1 Risultati EWAS di eGFR e UACR. I grafici di Chicago dei risultati dello studio di associazione epigenome-wide (EWAS) per la velocità di filtrazione glomerulare stimata (eGFR) (A) e il rapporto albumina urinaria/creatinina (UACR) (B) utilizzando il campione combinato di scoperta e replicazione. I siti sono ordinati in base alla loro posizione cromosomica sull'asse x, con il loro valore P –log10 dell'associazione Wald-test fornito sull'asse y. I CpG positivamente correlati al tratto sono tracciati nella parte superiore, i siti con correlazione negativa nella parte inferiore. Le linee orizzontali tratteggiate rappresentano il livello di significatività (valore P < 1,1e-7).="" i="" nuovi="" siti="" replicati="" sono="" colorati="" in="" arancione,="" i="" siti="" replicati="" noti="" sono="" colorati="" in="" turchese="" e="" i="" siti="" che="" erano="" inoltre="" associati="" al="" rispettivo="" tratto="" binario="">malattie renali[CKD]/ microalbuminuria [MA]) sono contrassegnati da una croce.

Nella meta-analisi, sono stati osservati i valori P più bassi per le associazioni eGFR note, tra cui cg17944885 (ZNF788,=-1,75E-04, valore P=8,7E-41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1,48E−04, valore P=3.2E−24) e cg06158227 (ZSCAN29,=−1,08E−04, valore P=8 .7E-20)14, seguito da una nuova ricerca in cg20777437 (CDCP2,=-8.28E-05, valore P=1.1E-17). I 69 CpG associati a eGFR replicati da soli hanno spiegato il 15,7 percento della variazione di eGFR in un campione di studio separato di 1888 partecipanti (vedi Metodi). Quando si aggiungono tutte le covariate (sesso, età, diabete, ipertensione, BMI, fumo e proporzioni dei globuli bianchi) al modello di associazione, la proporzione totale della varianza spiegata nell'eGFR è aumentata al 36,3%, con una variazione del 2,4% attribuita ai 69 CpG indipendentemente dalle altre covariate.

Nell'analisi transetnica dell'UACR, sette CpG sono stati significativamente associati e replicati (Fig. 1B, Dati supplementari 5, vedere Metodi). Dei risultati, cg18181703 (SOCS3,=-2,58E-03, valore P=2.6E-13) e cg02711608 (SLC1A5,=-1,63 E-03, P-value=9.9E-13) aveva i valori P di associazione di meta-analisi più piccoli. A sei dei sette CpG, una metilazione inferiore era associata a UACR più elevato. A causa del numero di siti replicati, la potenza del test binomiale era limitata (6 CpG, pbinom=0.13; Fig. 1B). I CpG replicati spiegavano il 3,9% e il modello completo il 14,6% della variazione dei livelli UACR, con lo 0,07% attribuito ai CpG indipendentemente dalle altre covariate.

C'era una bassa sovrapposizione tra i loci EWAS replicati e GWAS precedentemente riportati sia per eGFR (sovrapposizione=10 su 69; Dati supplementari 4) che UACR (sovrapposizione=1 su 7; Dati supplementari 5). Non vi era alcuna sovrapposizione di CpG replicati tra eGFR e UACR, indicando profili di metilazione del DNA specifici del tratto nel sangue. Anche tra le 967 e 270 associazioni suggestive (valore P < 1e-05)="" di="" una="" meta-analisi="" combinata="" di="" campioni="" di="" scoperta="" e="" replicazione="" per="" egfr="" e="" uacr,="" rispettivamente,="" solo="" 10="" siti="" si="" sovrapponevano="" tra="" entrambi="" i="" tratti.="" i="" risultati="" dettagliati="" di="" queste="" meta-analisi="" per="" tutte="" le="" associazioni="" suggestive="" sono="" forniti="" nei="" dati="" supplementari="" 6="" (egfr)="" e="" 7="">Eterogeneità degli antenati e robustezza dei risultati. Per valutare se i risultati dell'associazione su eGFR e UACR potrebbero essere guidati da una discendenza specifica, abbiamo eseguito una meta-analisi EWAS stratificata per ascendenza di campioni di ascendenza europea (EA) e di ascendenza afroamericana (AA) con risultati di più studi che contribuiscono a questi due etnie. Confronto dei risultati dell'associazione delle CpG replicate nei campioni di EA (Negar=23,671; nUACR=9806) con i campioni di AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) all'interno o entro 50 bp delle 69 CpG replicate è stato valutato per valutare se la presenza di SNP potesse influenzare il legame della sonda. Quattro sonde sono state localizzate vicino a un SNP comune (dati supplementari 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), che, tuttavia, non erano associati ad alcun tratto GWAS secondo la risorsa PhenoScanner V2 (accesso il 02/12/2021, pGWAS < 5e-8,="" inclusi="" gli="" snp="" proxy="" con="" eur="" r²=""> 0,8)23. Ciò indica che è improbabile che i risultati EWAS siano confusi da un tratto comune noto a cui si riferisconofunzione renaledalla variazione della sequenza del DNA nelle vicinanze. Gli SNP interni alla sonda che erano più di cinque basi dall'estremità 3' della sonda sono stati generalmente trovati di conseguenze trascurabili24.

Relazione con CKD e microalbuminuria.Delle 69 CpG associate a eGFR, 53 erano anche associate a CKD prevalente in una meta-analisi di 25,609 individui inclusi 2376 casi con una direzione dell'effetto coerente (valore P < 0.="" 05/69;="" dati="" supplementari="" 4,="" figura="" supplementare="" 3a).="" la="" correlazione="" tra="" gli="" effetti="" egfr="" e="" ckd="" era="" alta="" (r="-0,93;" fig.="" 3a).="" in="" una="" coorte="" indipendente="" di="" 551="" pazienti="" con="" insufficienza="" renale="" cronica,="" 65="" cpg="" erano="" direzionalmente="" coerenti="" con="" la="" meta-analisi="" egfr="" e="" cinque="" replicati="" (valore="" p=""><0,05 9,="" r="0.77;" figura="" 4="" supplementare,="" dati="" supplementari="" 4,="" vedi="" metodi).="" nella="" stessa="" coorte,="" i="" cpg="" associati="" a="" egfr="" cg18194850="" (valore="" p="1.6E-5)" e="" cg07242931="" (valore="" p="2.3E-5)" sono="" stati="" anche="" associati="" al="" tempo="">insufficienza renaleo acutodanno renale(Dati supplementari 8, vedere Metodi). Tutte e sette le CpG associate all'UACR erano anche significativamente associate alla microalbuminuria in un campione di 7279 individui, inclusi 1186 casi con la stessa direzione dell'effetto dell'UACR (valore P < 0.05/7,="" r="" {{7}="" }.98;="" fig.="" 3b,="" dati="" supplementari="" 5,="" figura="" 3b="">

Correlazione con l'espressione genica. Per ottenere informazioni sui possibili meccanismi funzionali dei CpG associati a eGFR e UACR, abbiamo testato la correlazione dei loro livelli di metilazione del DNA con i livelli di mRNA di geni codificati in cis nel sangue intero e nei monociti del sangue (vedi Metodi, Dati supplementari 9 ). Il noto cg17944885 associato a eGFR sul cromosoma 19 vicino a ZNF788 era associato alla trascrizione codificata dalla proteina zinc finger 439 distante 240 kb (ZNF439, Tabella 2). Inoltre, la metilazione di cg04864179 al fattore di regolazione dell'interferone 5 (IRF5) era associata a entrambi i trascritti di mRNA codificati da IRF5 e al vicino transportin 3 (TNPO3) (Figura 5A supplementare). Delle associazioni UACR, i due CpG replicati cg02711608 e cg22304262 al membro 5 della famiglia di portatori di soluti 1 (SLC1A5) hanno rivelato associazioni significative con i livelli di mRNA di SLC1A5 e cg23570810 alla proteina transmembrana indotta da interferone 1 (IFITM1) con i suoi trascritti in cis (Tabella 2). Tutti i risultati dell'analisi dell'espressione genica sono forniti in Dati supplementari 9.

Effetti nel tessuto renale.Per valutare se gli effetti di metilazione osservati nel sangue si traducono intessuto renale,abbiamo applicato un modello di regressione per testare le associazioni dei CpG replicati per associazione significativa (tasso di falsa scoperta (FDR) < 0.05) e direzione coerente con eGFR erenefibrosi, rispettivamente, in 506 microdissezionatitessuto renalecampioni. In questi campioni,rene-la metilazione del DNA basata sui tessuti di CpG replicati associati a eGFR cg23597162 a JAZF1, cg26099045 vicino a PELI1 e cg12644285 a CHD2 erano significativamente associati a eGFR con la stessa direzione dell'effetto come nel sangue (Figura 6A supplementare, Tabella 2, Dati supplementari 10) . Inoltre, lo stesso CpG a PELI1 e sei aggiuntivi

siti (cg20146909 a LRRC8D, cg25767870 vicino a FAM46C, cg16618493 a ZBTB7B, cg10632966 vicino a RPEL1, cg01068906 a NOD2 e cg03297731 a GDPD3) erano associati a fibrosi nelrenecampioni di tessuto con direzioni di effetto coerenti (cioè inverse) (Figura 6B supplementare, Tabella 2). Dei siti UACR replicati, i livelli di metilazione del DNA inreneil tessuto di cg00008629 a PTBP3 e cg24859433 vicino a IER3 era associato a fibrosi e mostrava la stessa direzione dell'effetto (Figura 6D supplementare, Tabella 2). Coerentemente con i risultati dell'EWAS, non è stata trovata alcuna associazione significativa dei CpG associati all'UACR con eGFR nei donatori di campioni di rene (Figura 6C supplementare, Dati supplementari 10).

Effetti causali tra metilazione del DNA efunzione renaletratti. Per valutare se ilfunzione renalei tratti influenzano causalmente la metilazione del DNA o viceversa, abbiamo condotto un'analisi bidirezionale di randomizzazione mendeliana a due campioni (MR) dei CpG significativamente associati. L'analisi MR in avanti ha suggerito che i CpG cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) e cg04864179 (IRF5) influenzano causalmente i livelli di eGFR (Tabella 3). Le stime di ereditabilità di questi quattro CpG variavano tra i tre set di dati di popolazioni di origine europea, ma erano costantemente superiori all'ereditabilità media di tutti i CpG valutati in ciascuno dei tre studi: 0,34 (CpG eGFR causale) vs. 0,16 (array HM450K) sulla base di Hannon et al.25, 0,55 contro 0,19 per Dongen et al.26 e 0,51 contro 0,19 per McRae et al.27. Non sono state identificate associazioni causali significative per qualsiasi CpG associato a UACR. Per la RM inversa, l'unico effetto significativo è stato quello di eGFR su cg23597162 (JAZF1) quando si utilizza il metodo della varianza inversa primaria. Tuttavia, non sono stati identificati/osservati effetti significativi nelle analisi multiple di sensibilità alla RM inversa. Le analisi leave-one-out non hanno mostrato alcuna indicazione che i risultati della RM potrebbero essere guidati da un singolo SNP. Inoltre, escludendo gli SNP che erano associati al diabete mellito di tipo 2, essendo un importante fattore di rischio permalattie renalinon ha portato a risultati diversi. I risultati per tutte le analisi MR primarie e di sensibilità sono mostrati nei Dati Supplementari 11 e 12 e nella Figura 7 Supplementare. Le analisi di sensibilità supportano i risultati primari dei risultati significativi di MR in avanti (FDR < 0.05,="" vedere="" metodi)="" con="" stime="" dell'effetto="" coerente="" con="" la="" direzione,="" indicando="" relazioni="" potenzialmente="" causali="" dalla="" metilazione="" del="" dna="" all'egfr="" ma="" non="">

Analisi del legame del fattore di trascrizione, del marchio dell'istone e dell'arricchimento del percorso. Abbiamo eseguito analisi del sito di legame del fattore di trascrizione, del segno dell'istone e dell'arricchimento del percorso sulla base dei 967 CpG che hanno mostrato un'associazione suggestiva con eGFR (valore P < 1e-05;="" dati="" supplementari="" 6)="" e="" 270="" cpg="" che="" hanno="" mostrato="" associazioni="" suggestive="" con="" uacr="" (valore="" p="">< 1e-5;="" dati="" supplementari="" 7)="" nella="" meta-analisi="" per="" massimizzare="" il="" potere="" statistico="" delle="" analisi="" di="" arricchimento="" (vedi="" metodi)="" 14="" in="" primo="" luogo,="" abbiamo="" valutato="" se="" i="" cpg="" associati="" a="" egfr="" mappati="" preferenzialmente="" ai="" siti="" di="" legame="" di="" 169="" fattori="" di="" trascrizione="" (tf)="" basati="" sulla="" cromatina="" dati="" sul="" sequenziamento="" del="" dna="" di="" immunoprecipitazione="" (chip-seq)="" dal="" progetto="" encode="" che="" sono="" stati="" aggregati="" da="" una="" chiamata="" di="" consenso="" su="" 91="" tipi="" di="" cellule="" umane="" (161="" tracce="" tf)="" e="" integrati="" con="">renetracce di tessuto (vedi Metodi). Dopo la correzione di test multipli per 169 TF, otto TF hanno mostrato un arricchimento significativo per CpG associati a eGFR (FDR <{3}}.05; fig.="" 4a,="" dati="" supplementari="" 13),="" incluso="" cebpb="" (valore="" p="1." 75e−06,="" traccia="" di="" tessuto="" incrociato)="" ed="" ep300="" (valore="" p="7.49E−09," traccia="" di="" tessuto="" incrociato).="" ciò="" è="" coerente="" con="" i="" risultati="" di="" chu="" et="" al.14="" in="" un="" sottoinsieme="" più="" piccolo="" di="" 4859="" partecipanti="" dei="" 33.605="" partecipanti="" qui="" analizzati.="" i="" cpg="" associati="" a="" uacr="" sono="" stati="" arricchiti="" in="" siti="" di="" legame="" di="" 56="" tf="" (fig.="" 4b,="" dati="" supplementari="" 14)="" con="" l'associazione="" più="" forte="" per="" polr2a="" (valore="" p="6.93E-19)," fos="" (valore="" p="" {{32="" }}.28e−12)="" ed="" ep300="" (valore="" p="">

Rene-CpG associati alla funzione sono stati ampiamente arricchiti per diversi segni dell'istone, con 82 su 195 combinazioni di tipi di cellule del segno dell'istone significative (FDR q <{4}}.05) per="" egfr="" (fig.="" 4c,="" dati="" supplementari="" 15)="" e="" 79="" su="" 195="" per="" uacr="" (fig.="" 4d,="" dati="" supplementari="" 16).="" la="" modifica="" dell'istone="" h3k4me1,="" un="" segno="" concentrato="" su="" potenziatori="" attivi="" e="" innescati,="" è="" stata="" arricchita="" per="" tutti="" i="" tipi="" di="" cellule="" per="" cpg="" associati="" a="" uacr="" e="" quasi="" tutti="" i="" tipi="" di="" cellule="" per="" cpg="" associati="" a="" egfr.="" mentre="" i="" cpg="" associati="" all'uacr="" hanno="" mostrato="" un="" arricchimento="" per="" il="" marchio="" del="" promotore="" h3k4me3="" in="" 34="" tipi="" di="" cellule,="" solo="" quattro="">

i tipi hanno mostrato un arricchimento per i siti associati a eGFR. Al contrario, il segno associato al corpo del gene H3K36me3 ha mostrato un arricchimento molto più ampio per le CpG associate a eGFR (30 tipi di cellule) rispetto alle CpG associate a UACR (cinque tipi di cellule). A differenza di H3K3me1/3 e H3K36me3, che sono stati tutti collegati a geni attivi (potenziatori, promotori attivi, trascrizione attiva), H3K9me3 e H3K27me3, che sono generalmente associati all'eterocromatina costitutiva e facoltativa28-31, non sono stati significativamente arricchiti per UACR- CpG associati in qualsiasi tipo di cellula testato (Fig. 4D, Dati supplementari 16). Arricchimento di geni implicati dafunzione renale-I CpG associati sono stati valutati nei database Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e Reactome (vedi Metodi)32–35. È stato osservato un arricchimento significativo per 27 termini (25 GO, un KEGG, un Reactome; Dati Supplementari 17, Fig. 5A) per eGFR e 91 termini (87 GO, quattro Reactome; Dati Supplementari 18, Fig. 5B) per UACR (Fig. 5B). I percorsi correlati alla migrazione specifica del tipo di globuli bianchi, alla traduzione dell'mRNA, all'emostasi e alla coagulazione, nonché alla risposta all'insulina, hanno mostrato un arricchimento significativo per le CpG associate a eGFR (FDR < 0.05;="" fig.="" 5a).="" i="" percorsi="" con="" i="" valori="" p="" di="" arricchimento="" più="" bassi="" per="" i="" siti="" associati="" all'uacr="" erano="" dominati="" dall'attivazione="" e="" dalla="" risposta="" delle="" cellule="" immunitarie="" e="" dai="" percorsi="" correlati="" all'interferone="" (fig.="" 5b).="" ulteriori="" percorsi="" che="" sono="" stati="" arricchiti="" includevano="" la="" migrazione="" dei="" globuli="" bianchi,="" come="" per="" i="" risultati="" egfr="" (dati="" supplementari="">

Relazione con associazioni EWAS note con altri tratti. Dato l'arricchimento osservato delle vie correlate alla risposta immunitaria, i risultati della metilazione del DNA inclusi i CpG vicino ai geni della via dell'interferone e il fatto che lo stato di metilazione del DNA è stato valutato prevalentemente nei leucociti, abbiamo valutato se i nostri risultati possono essere guidati da effetti confondenti di la risposta immunitaria o lo stato infiammatorio. Pertanto, abbiamo eseguito una ricerca delle CpG replicate in un grande EWAS su livelli sierici di proteina C-reattiva (CRP) ad alta sensibilità36. Solo due CpG, che erano anche associati alla metilazione del DNA e all'eGFR intessuto renale,cg09610644 a BDH1 e cg12644285 a CHD2, erano tra i siti associati alla CRP. Pertanto, sembra improbabile una confusione generale dei nostri risultati attraverso lo stato infiammatorio stimato dalla PCR.

Alcuni deifunzione renale-I CpG associati identificati in questo studio sono associati a molti altri tratti basati su EWAS pubblicato. Ventuno siti eGFR erano associati a pressione sanguigna, consumo di alcol, BMI, sesso, recettore 2 del fattore di necrosi tumorale solubile e/o stato di fumo e cinque siti UACR erano precedentemente associati a consumo di alcol, stato di fumo, BMI, livello di istruzione, -glutamil transferasi, recettore 2 del fattore di necrosi tumorale solubile, diabete mellito di tipo 2 e/o diversi metaboliti sierici (Tabella 2, Dati supplementari 19). Tre di questi CpG (tutti i siti UACR) erano associati a più di due tratti, vale a dire cg02711608 in SLC1A5 (con -glutamil transferasi, -glutamiltreonina, BMI, consumo di alcol), cg18181703 in SOCS3 (con diabete mellito di tipo 2, stato di fumo, BMI , recettore 2 del fattore di necrosi tumorale solubile) e cg24859433 vicino a IER3 (con stato di fumatore, livello di istruzione, 4-vinilfenolo_solfato). La figura 5B supplementare esemplifica un CpG, cg26099045, che era correlato con eGFR e fibrosi intessuto renalenella nostra analisi, e inoltre associato al sesso e al fumo in precedenti EWAS. Infine, cg17944885 a ZNF788 è stato associato anche a eGFR in un campione di pazienti con DKD22.

Discussione

In questo EWAS difunzione renale, abbiamo identificato e replicato livelli di metilazione del DNA nel sangue di 69 CpG associati a eGFR. Di questi, 60 siti non erano stati precedentemente segnalati, così come tutti e sette i CpG identificati in associazione con UACR. La maggior parte delle CpG associate a eGFR e UACR erano anche significativamente associate ai loro esiti clinici, ad esempio CKD e microalbuminuria, e potrebbero quindi avere il potenziale per la stratificazione degli individui a rischio. La varianza di eGFR attribuita a questi 69 CpG era del 2,4%, il doppio di quella di un precedente EWAS14, ed è paragonabile alla varianza spiegata da 29 SNP scoperti da GWAS che includevano una dimensione del campione tre volte superiore per la scoperta del locus37,38. Ciò suggerisce che la metilazione differenziale del DNA ai singoli CpG quantificati dal sangue spiega più della varianza eGFR rispetto ai singoli SNP comuni a una data dimensione del campione. Per l'UACR, sembra che siano necessarie dimensioni del campione più grandi rispetto all'eGFR per rivelare un numero simile di CpG associati al tratto. Dato che l'albumina e la creatinina per il calcolo dell'UACR sono misurate nelle urine in contrapposizione alla quantificazione della creatinina dal siero per la stima del GFR, questa differenza non è inaspettata ed è in linea con le osservazioni da GWAS di questi tratti10,13. Inoltre, la variazione genetica sembra influenzare ilfunzione renaletratti attraverso percorsi diversi rispetto ai cambiamenti nella metilazione del DNA. Ciò è supportato dalla bassa sovrapposizione tra i siti EWAS e GWAS replicati sia per eGFR che per UACR.

Questa meta-analisi EWAS includeva campioni di diverse popolazioni ed etnie. Abbiamo osservato un'elevata correlazione tra le stime degli effetti ottenute dal grande sottocampione di individui EA con gli effetti stimati negli individui AA (Fig. 2). Nonostante l'inclusione di dati da un numero sostanziale di individui di discendenza non EA, i risultati complessivi dell'EWAS transetnico potrebbero essere guidati dai dati di individui di discendenza EA, che rappresentavano il 70% (eGFR) / 65% (UACR) del nostro studio (Dati Supplementari 3 e 4). Per affrontare questa limitazione, sono necessarie analisi future con una maggiore percentuale di campioni non EA per una valutazione affidabile e dettagliata dell'eterogeneità tra gli antenati. Il potenziale di tradurre in soggetti con la malattia le intuizioni dell'EWAS sui tratti quantitativi in ​​studi per lo più basati sulla popolazione è illustrato dal fatto che le stime degli effetti su 65 su 69 CpG associate a eGFR sono state osservate nella stessa direzione in una coorte di 551 pazienti con insufficienza renale cronica, indicando meccanismi applicabili in un'ampia gamma di livelli di eGFR (Fig. 3). Inoltre,

cg07242931 in MAN1C1 e cg18194850 in SUCG2 non solo era associato a eGFR, ma prevedeva il tempo perinsufficienza renaleo acutodanno renale(Dati supplementari 8). Ulteriori prove per un coinvolgimento di SUCG2, che codifica per la subunità della succinil-CoA sintetasi, nella malattia renale è stata suggerita da un GWAS sul diabetemalattie renalinegli indiani d'America (SNP=rs4453858, valore P=2E-6)39. La variazione genetica in questo gene era anche associata ai livelli urinari di succinil-carnitina (C4DC, SNP=rs115560420, P-value=7E-15)40. C4DC è un prodotto metabolico del ciclo dell'acido tricarbossilico, che è catalizzato dal coinvolgimento della succinil-CoA sintetasi e livelli più elevati di C4DC nel sangue associati a un eGFR41 inferiore. Tuttavia, una ricerca nei risultati dei loci dei tratti quantitativi della metilazione (meQTL) di GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 non ha rivelato un'associazione significativa di questi due SNP con cg18194850, suggerendo nessun collegamento diretto tra questi SNP e il sito CpG.

Poiché la metilazione del DNA è un importante regolatore dell'espressione genica, abbiamo valutato la correlazione dei siti di metilazione del DNA associati ai tratti con i livelli di mRNA dei geni in cis. Geni i cui livelli di mRNA erano significativamente correlatifunzione renalei siti di metilazione del DNA associati erano correlati alle vie dell'interferone (sia per eGFR che per UACR). Sebbene questi risultati siano d'accordo con i risultati dell'arricchimento del percorso per UACR (Fig. 5B, Dati supplementari 18), il numero di correlazioni significative tra CpG associati all'UACR e livelli di trascrizione è piuttosto basso. Ciò non sorprende considerando la dimensione del campione relativamente piccola di 1915 individui disponibili per questa analisi e la copertura limitata della risorsa trascrittomica. È interessante notare che, tra i risultati significativi per UACR, due CpG nella famiglia di portatori di soluti 1 membro 5 (SLC1A5) erano associati all'espressione genica differenziale e anche alla pressione sanguigna. La metilazione del DNA a SLC1A5, che codifica per un trasportatore di amminoacidi neutri sodio-dipendente, potrebbe quindi essere un elemento aggiuntivo che contribuisce alla nota correlazione tra UACR e pressione sanguigna.

Significative trascrizioni differenzialmente espresse non erano sempre codificate dal gene più vicino (cg17944885 vicino a ZNF788), o un sito CpG era correlato con più geni in cis (cg04864179 a IRF5). In particolare, è notevole la correlazione della metilazione del DNA a cg04864179 con i livelli di trascrizione IRF5. Considerando il significativo risultato MR di questo CpG con eGFR, la metilazione del DNA a IRF5 potrebbe influenzare causalmente eGFR mediato dalla sua espressione genica. Tenendo conto della trasformazione dei tratti delle associazioni genetiche sottostanti (vedi Metodi), abbiamo osservato che un aumento della metilazione del DNA di dieci deviazioni standard ha comportato un eGFR superiore del 3,2%. Sebbene questo effetto stimato sia molto piccolo, un'influenza causale dei pattern di metilazione nelle cellule del sangue sull'insufficienza renale cronica è stata supportata anche da una risonanza magnetica basata su riassunti con un set di dati meQTL diverso in uno studio recente, in cui l'effetto causale era direzionalmente coerente con i nostri risultati22. Applicando la colocalizzazione multi-tratto, hanno anche dimostrato che gli effetti genetici di questo locus sull'eGFR erano mediati dalla metilazione dell'IRF5 e dall'espressione genica nel sangue. Inoltre, è stata mostrata la colocalizzazione dell'espressione genica IRF5 con eGFR nei compartimenti tubulari e glomerulari direnetessuto43. Nell'interpretare l'effetto causale osservato nel nostro studio, va tuttavia tenuto presente che le analisi MR per CpG cg04864179 hanno mostrato un'eterogeneità significativa (p <0,05) tra="" gli="" strumenti="" (dati="" supplementari="" 11="" e="" figura="" complementare="" 7="">

IRF5 codifica un membro della famiglia dei fattori di regolazione dell'interferone (IRF). Il gruppo di membri della famiglia IRF contiene fattori di trascrizione con ruoli diversi, come la modulazione dell'attività del sistema immunitario, la crescita e la differenziazione, nonché il controllo dell'espressione genica per la risposta dell'interferone alle infezioni virali. IRF5 può influenzare la risposta delle cellule immunitarie. Diversi studi supportano che i cambiamenti nella metilazione di IRF5 potrebbero influenzarefunzione renaletramite vie immunitarie: gli SNP in IRF5 sono associati al LES tramite cambiamenti nell'espressione di IRF5 nei monociti del sangue44-46. Il LES è una malattia autoimmune caratterizzata da un'attivazione della via dell'IFN che può interessare ilrenicome la nefrite lupica47. Inibizione dell'iperattivazione di IRF5 in un modello murino di LES protetto dall'insorgenza e dalla gravità della nefrite da lupus e miglioratofunzione renalee patologia48,49. Sebbene il nostro EWAS non si sia concentrato sullo studio dei pazienti con LES, piccoli effetti della metilazione dell'IRF5 sugli esiti correlati ai reni, mediati almeno in parte dalla sua espressione e dalle successive vie dell'IFN, potrebbero essere rilevati come effetti sull'eGFR nella popolazione generale.

CISTANCHE MIGLIORA IL DOLORE RENALE/RENALE

Molti dei CpG associati a eGFR per i quali la metilazione del DNA è stata quantificata dalle cellule del sangue erano anche associati a eGFR erenefibrosi quando è stata quantificata la metilazione del DNArenetessuto, sebbene la dimensione del campione fosse sostanzialmente inferiore rispetto al set di dati EWAS. Ciò suggerisce che almeno alcuni dei risultati ottenuti dal sangue possono essere tradotti in un ulteriore tessuto bersaglio specifico del tratto. Qui, sangue erenesono i due principali tessuti bersaglio specifici del tratto, poiché ilfunzionedelreneè la filtrazione del sangue per rimuovere i rifiuti. Analisi di arricchimento delfunzione renalei CpG associati hanno indicato un ruolo centrale nella regolazione trascrizionale. Abbiamo riscontrato un diffuso arricchimento di H3K4me1/3 e H3K36me3. H3K4me1/ 3 è legato a potenziatori attivati ​​e attivi, nonché a promotori attivi e H3K36me3 è strettamente correlato alle regioni trascritte del genoma50. Il ruolo della regolazione trascrizionale è ulteriormente supportato dal più forte segnale di arricchimento del fattore di trascrizione dei CpG associati a UACR, che è POLR2A, la più grande subunità del principale enzima che sintetizza l'mRNA negli eucarioti.

I potenziali limiti relativi alle analisi MR includono che non erano disponibili strumenti validi per tutti i CpG per il forward MR. Dato che tutti gli strumenti di un CpG sono stati selezionati da regioni cis, cioè della stessa regione genetica, è probabile che tutti gli strumenti di un CpG siano validi o non validi, limitando così il numero di diversi metodi MR che possono essere applicati per testare il robustezza dei risultati51. L'MR inverso aveva una potenza limitata a causa della piccola dimensione del campione disponibile per la stima delle associazioni di metilazione SNP-DNA. Studi meQTL più grandi come il GoDMC non potevano memorizzare i risultati dell'associazione per tutti gli SNP (cioè, al di sopra di una certa associazione di cutoff del valore P) a causa di motivi tecnici, e quindi non erano utilizzabili per la MR inversa a due campioni. Pertanto, i risultati non significativi devono essere interpretati con cautela. Inoltre, un'interpretazione della dimensione dell'effetto causale è difficile, poiché le associazioni genetiche sottostanti sono calcolate sulla scala della deviazione standard dei livelli di metilazione del DNA. Un'altra potenziale limitazione dello studio è che eGFR, CKD e UACR sono fenotipi stimati da diversi parametri sottostanti e hanno influenze multifattoriali. Pertanto, abbiamo eseguito diverse analisi per garantire che i nostri risultati EWAS non fossero guidati da fattori confondenti noti, incluso il diabete di tipo 2, un potenziale fattore confondente della relazione tra DNAm efunzione renale. In primo luogo, le associazioni EWAS in ciascuna coorte sono state adattate affinché i fattori confondenti rimuovessero i loro effetti all'interno di una coorte. In secondo luogo, gli EWAS sono stati eseguiti in ciascuna coorte separatamente e quindi meta-analizzati, il che corrisponde a un aggiustamento, ad esempio, per la prevalenza del diabete tra le coorti. Infine, abbiamo verificato le associazioni dei nostri CpG replicati all'interno degli studi EWAS sul diabete pubblicati. Di tutte le nostre associazioni CpG replicate, solo il CpG associato all'UACR cg18181703 presso SOCS3 ha mostrato un'associazione con il diabete di tipo 2. Questo CpG è stato anche associato allo stato di fumo, all'IMC e ai livelli ematici del recettore 2 del fattore di necrosi tumorale solubile. Tenendo conto che il nostro EWAS è stato aggiustato anche per lo stato di fumo e l'IMC, presumiamo che gli effetti di cg18181703 sull'UACR siano a almeno parzialmente indipendente da diabete di tipo 2, BMI e stato di fumo. Sebbene abbiamo controllato per molti di questi fattori noti, altri fattori come le covariate non misurate non possono essere regolati esplicitamente nelle analisi e possono influenzare i risultati.

Sono necessari ulteriori studi EWAS con maggiori dimensioni del campione e con metilazione del DNA quantificata da tessuti aggiuntivi, nonché analisi funzionali per ampliare le nostre conoscenze sui meccanismi regolatori difunzione renale, e infine migliorare la previsione e il trattamento direnepatologia. Ciò vale in particolare per UACR, dato il numero inferiore di associazioni CpG significative osservate. In sintesi, questa meta-analisi EWAS su larga scala ha sostanzialmente esteso il numero di CpG associati in modo riproducibile con eGFR e CKD e ha rivelato sette associazioni per UACR e microalbuminuria. La metilazione del DNA in questi siti spiegava un'ampia percentuale della varianza dell'eGFR e la metilazione differenziale a quattro CpG ha mostrato prove di una potenziale relazione causale con l'eGFR. Caratterizzazione completa delle CpG replicate tra i pazienti con insufficienza renale cronica, intessuto renale,per l'espressione genica differenziale e per percorsi arricchiti e segni epigenetici forniscono approfondimentifunzione renale-regolazione trascrizionale associata.

Metodi

Panoramica.Abbiamo istituito una meta-analisi collaborativa basata su un modello di dati distributivo e procedure di controllo della qualità. Per massimizzare la standardizzazione del fenotipo tra gli studi, sono stati creati e forniti a tutti gli studi partecipanti un piano di analisi e uno script della riga di comando (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) ( studi prevalentemente basati sulla popolazione; Dati supplementari 1 e 2). I file di riepilogo generati automaticamente sono stati controllati centralmente. Dopo l'approvazione del fenotipo, gli studi hanno eseguito il loro EWAS e caricato i risultati e le informazioni aggregate sulla metilazione del DNA su un server centrale. Il controllo di qualità EWAS è stato eseguito con script personalizzati per valutare l'inflazione, i controlli positivi, la distribuzione delle sonde CpG e confrontare tra gli studi le distribuzioni complessive delle dimensioni degli effetti, degli errori standard e dei valori P. Tutti i protocolli di studio sono stati approvati dai rispettivi comitati etici locali. Tutti i partecipanti a tutti gli studi hanno fornito il consenso informato scritto.

CISTANCHE MIGLIORERA' LA DIALISI RENALE/RENALE

Definizione del fenotipo.I valori di creatinina ottenuti con il test Jaffé prima del 2009 sono stati calibrati moltiplicandoli per 0,9552. Studi stimati GFR con il cronicoMalattie renaliEquazione della collaborazione epidemiologica (CKD-EPI)53. eGFR è stato winsorizzato a 15 e 200 ml min−1 per 1,73 m2. La CKD è stata definita come un eGFR inferiore a 60 ml min-1 per 1,73 m2. I valori UACR misurati in mg/g sono stati trasformati in log naturali prima di tutte le analisi. La microalbuminuria è stata definita come 1 per UACR > 30 mg/g e come 0 per valori UACR < 10="">

Quantificazione della metilazione del DNA e controllo di qualità.Per la quantificazione della metilazione del DNA, il DNA genomico è stato estratto dal sangue periferico. I livelli di metilazione del DNA sono stati quantificati utilizzando l'array Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC), l'array Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip (HM450K) o l'array Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27K). La preelaborazione dei dati di metilazione del DNA è stata eseguita secondo protocolli di studio individuali, tra cui correzione dello sfondo, normalizzazione dei quantili, filtraggio della sonda, filtraggio del campione, corrispondenza SNP con le posizioni della sonda di controllo SNP, filtraggio dei valori anomali e correzione del tipo di analisi (dati supplementari 3). Il livello di metilazione in ciascun sito è stato rappresentato e analizzato come valore. Sono state annotate le sonde CpG che si sovrappongono agli SNP. Ciascuno studio ha calcolato la media e la deviazione standard di ciascun sito CpG e queste statistiche riassuntive sono state confrontate tra gli studi per le differenze sistematiche tra i CpG e seguite con i singoli analisti dello studio

Valutazione covariata.La metilazione del DNA e le covariate sono state misurate alla stessa visita/punto temporale. Il diabete prevalente è stato definito come glicemia a digiuno maggiore o uguale a 126 mg/dl, glicemia a digiuno maggiore o uguale a 200 mg/dl, trattamento per il diabete o autovalutazione di una diagnosi di diabete. L'ipertensione prevalente è stata definita come pressione sistolica maggiore o uguale a 140 mm Hg, pressione diastolica maggiore o uguale a 90 mm Hg o trattamento per l'ipertensione. Se la pressione sanguigna misurata non era disponibile, l'ipertensione veniva definita mediante autovalutazione. Lo stato attuale del fumo è stato definito utilizzando le informazioni auto-riferite. Il BMI (kg/m2) è stato calcolato utilizzando le misurazioni di peso e altezza valutate in ciascuno studio. L'età è stata inclusa come valore continuo nei modelli associativi. La struttura della popolazione negli studi non familiari è stata regolata dalle componenti principali genetiche (PC). Le proporzioni del tipo di globuli bianchi sono state stimate sulla base della metilazione del DNA54. Ulteriori covariate tecniche includevano la sonda di controllo PC55, il centro studi, il batch di elaborazione, l'ID della sentinella dell'array e la posizione della sentinella.

Metodi statistici e meta-analisi. Per garantire una potenza comparabile tra i siti analizzati, nelle analisi sono state incluse solo le CpG autosomiche misurate da entrambi, EPIC e HM450K. Ciascuno studio ha eseguito analisi di regressione lineare separate da gruppi di ascendenza. Per valutare la robustezza dei risultati EWAS, le analisi sono state limitate a studi e sottocampioni di individui di discendenza europea. I valori di metilazione del DNA sono stati modellati come variabili dipendenti con il tratto che è costituito da valori eGFR o UACR continui o variabili binarie di CKD o microalbuminuria: metilazione del DNA ~ tratto più sesso più età più PC genetici più proporzioni dei globuli bianchi più covariate tecniche più diabete più ipertensione più BMI più abitudine al fumo I partecipanti avevano bisogno di informazioni complete per tutte le variabili e le statistiche riassuntive dello studio e sono stati inclusi solo se erano disponibili rispettivamente un minimo di 50 partecipanti per eGFR/UACR e 50 casi/controlli per CKD/microalbuminuria. Ciascun EWAS specifico dello studio è stato corretto per l'inflazione prima della meta-analisi mediante l'approccio BACON se la stima dell'inflazione era maggiore o uguale a uno (Figura 8 supplementare)56. Gli studi sono stati suddivisi in scoperta e replica in base all'ordine cronologico di contributo alla meta-analisi del CKDGen Consortium (dati supplementari 1 e 2). È stata eseguita una meta-analisi ponderata per la varianza inversa a effetti fissi implementata nel pacchetto R "metafor" (versione 2.1-0) per studi di scoperta, studi di replica e per le risultanti stime degli effetti di scoperta e replica. I CpG sono stati esclusi se all'interno della discovery o della replica era disponibile meno della metà della rispettiva dimensione del campione o se la stima dell'eterogeneità I2 era maggiore del 95%. Il successo della replica di un CpG associato è stato definito come direzione coerente delle stime degli effetti tra la scoperta (neGFR disc=22,347, nUACR disc=11,458) e la replica (neGFR repl=11,258 , nUACR repl=3610) meta-analisi, un significato corretto da Bonferroni del valore P di scoperta (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Analisi dell'espressione genica.Gli effetti delfunzione renalele CpG associate al tratto sono state testate per le associazioni con l'espressione genica nel sangue utilizzando due set di dati: (1) livelli di mRNA di monociti di 1202 partecipanti allo studio MESA e (2) mRNA di sangue intero di 713 individui del Studio KORA F4 57,58. Come passaggio iniziale, è stata eseguita una ricerca dei livelli di metilazione CpG con i livelli di mRNA disponibili nei risultati di associazione dello studio MESA. Per questa ricerca erano disponibili risultati di associazione con un valore P < 1e{{1{16}}}}.="" l'analisi="" è="" stata="" descritta="" in="" dettaglio="" in="" kennedy="" et="" al.59.="" in="" breve,="" l'espressione="" genica="" è="" stata="" valutata="" utilizzando="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" e="" v4.0="" expression="" beadchips="" e="" la="" metilazione="" del="" dna="" mediante="" l'array="" illumina="" hm450k.="" i="" valori="" di="" espressione="" sono="" stati="" normalizzati="" utilizzando="" la="" trasformazione="" di="" stabilizzazione="" della="" varianza.="" 13.933="" trascrizioni="" dagli="" array="" v3.0="" e="" v4.0,="" che="" erano="" significativamente="" espresse="" al="" di="" sopra="" dei="" livelli="" di="" fondo="" (valore="" p="" di="" rilevamento=""><0,01) in="" almeno="" il="" 5%="" dei="" soggetti.="" le="" analisi="" di="" associazione="" in="" mesa="" sono="" state="" eseguite="" come="" modello="" misto="" lineare="" utilizzando="" valori="" di="" espressione="" genica="" trasformati="" in="" log="" come="" variabile="" dipendente,="" valori="" beta="" di="" metilazione="" del="" dna="" come="" variabile="" indipendente="" con="" età,="" sesso,="" etnia="" e="" centro="" di="" studio="" aggiunti="" come="" covariate="" al="" modello.="" un="" secondo="" test="" di="" associazione="" è="" stato="" eseguito="" nel="" set="" di="" dati="" kora="" f4.="" l'associazione="" del="" livello="" di="" metilazione="" ai="" cpg="" replicati="" con="" i="" livelli="" di="" espressione="" genica="" dei="" geni="" entro="" ±500="" kb="" è="" stata="" calcolata="" utilizzando="" i="" livelli="" di="" mrna="" trasformati="" log2-ottenuti="" dall'array="" di="" espressione="" genica="" illumina="" human="" ht-12v3.="" i="" valori="" di="" espressione="" genica="" sono="" stati="" regrediti="" sui="" valori="" beta="" di="" metilazione="" del="" dna="" aggiustati="" per="" sesso="" ed="" età.="" prima="" dell'analisi="" i="" fattori="" tecnici,="" così="" come="" le="" proporzioni="" dei="" tipi="" di="" cellule="" del="" sangue,="" sono="" stati="" regrediti="" dai="" livelli="" di="" metilazione="" dell'mrna="" e="" del="" dna="" e="" i="" suoi="" residui="" sono="" stati="" inclusi="" nel="" modello="" di="" associazione="" finale.="" annotazione="" e="" controlli="" di="" qualità="" delle="" sonde="" di="" espressione="" genica="" sono="" stati="" basati="" sulla="" tabella="" fornita="" in="" schurmann="" et="" al.60.="" associazioni="" di="" espressione="" del="" gene="" cpg="" nel="" sangue="" che="" erano="" disponibili="" nei="" risultati="" mesa="" e="" avevano="" un="" valore="" p="" di=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Metilazione del DNA nel tessuto renale.Le analisi che utilizzano la metilazione del DNA intessuto renalecon eGFR e fibrosi sono stati eseguiti utilizzando i dati di 506 microdissezionatitessuto renalecampioni utilizzando il BeadChip Illumina EPIC. I campioni di tessuto renale sono stati raccolti separatamente e sono distinti dai campioni di sangue che sono stati analizzati nella meta-analisi EWAS. Questi campioni sono stati raccolti da porzioni non interessate di nefrectomie tumorali e preparati come descritto in precedenza 61. In breve, il software SeSAMe62 è stato utilizzato per eseguire la preelaborazione e il controllo di qualità, incluso il rilevamento basato su bassa intensità, la correzione del bleed-through nella sottrazione del fondo, la correzione del bias del colorante non lineare, controllo per la conversione del bisolfito, calcolo dei valori beta e stima della frazione leucocitaria. I valori beta di CpG associati a eGFR e UACR e le informazioni cliniche sono stati estratti per l'analisi di associazione. È stato applicato un modello di regressione per testare le associazioni dei beta di metilazione del DNA delle CpG finali come variabili dipendenti con i livelli di eGFR e di fibrosi, rispettivamente, come variabili indipendenti aggiustate per sesso, età, PC genetici (1–5), stato del diabete, stato di ipertensione , BMI, ID della sentinella dell'array, posizione della sentinella e controllo della conversione del bisolfito e frazione stimata dei leucociti.

Indagini mirate delle sonde eGFR nei pazienti con insufficienza renale cronica. L'associazione dei 69 CpG associati a eGFR e convalidati dalla popolazione generale con eGFR nel German ChronicMalattie renali (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g-1). Il follow-up dei pazienti per gli endpoint clinici è ancora in corso. Gli endpoint dello studio vengono registrati continuamente in modo standardizzato sulla base delle lettere di dimissione ospedaliera e dei certificati di morte e includono eventi correlati ai reni e morte. Il disegno dello studio e la popolazione di studio reclutata sono descritti più dettagliatamente nelle pubblicazioni precedenti63,64. Lo studio GCKD è stato approvato dai comitati etici locali e registrato nel registro nazionale degli studi clinici (DRKS 00003971). Un sottogruppo di 559 pazienti con insufficienza renale cronica attribuita a lupus eritematoso sistemico, nefropatia membranosa, glomerulosclerosi segmentaria focale o policistico autosomico dominantemalattie renaliè stato selezionato per la quantificazione della metilazione del DNA e misurato utilizzando l'array Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC). L'associazione con eGFR è stata valutata in modo analogo all'analisi principale (vedi Metodi statistici e meta-analisi), a parte l'aggiustamento per il fumo che è stato codificato 0/1/2 per i fumatori mai/ex/attuale. Per valutare l'associazione della metilazione del DNA con il tempoinsufficienza renaledall'inizio dello studio, i modelli di regressione di Cox sono stati adattati per ciascun CpG e, analogamente, per un endpoint combinato diinsufficienza renalee acutodanno renale.Oltre al predittore di metilazione del DNA, i modelli sono stati adeguati per età, sesso e sottotipo di CKD. Il modello di regressione di Cox fornisce stime per l'hazard ratio (HR) causa-specifica in presenza di eventi concorrenti, cioè qualsiasi altro decesso eccetto il decesso correlato ai reni. Sono state inoltre effettuate analisi dei rischi di sottodistribuzione al fine di valutare i potenziali effetti indiretti attraverso l'evento concorrente. L'ipotesi di rischio proporzionale è stata valutata sulla base di residui di Schoenfeld in scala. La valutazione grafica per i due CpG associati non ha rivelato prove di gravi violazioni (Figura 9 supplementare).

Trame e annotazione dell'associazione regionale. I grafici per la Figura 5 supplementare sono stati creati utilizzando i pacchetti "Gviz" 65 e "rtracklayer" 66 R. Nella trama sono stati inclusi un massimo di 40 siti entro 50,{5}} bp a monte oa valle del sito di interesse CpG. Se l'intervallo conteneva più di 40 siti, la regione tracciata veniva ridotta alla distanza del sito più lontano più 10,000 bp. La sezione RefSeq Genes si basa sulla traccia UCSC NCBI RefSeq con i simboli dei geni del pacchetto R 'org.Hs.eg.db', la sezione CpG Islands si basa sulla traccia UCSC CpG Islands, la sezione Roadmap chromHMM era basata sul Roadmaps 15- stato del modello chromHMM del fetoreneepigenome (Roadmap Epigenome ID: E086)67 e la sezione Common SNPs si basa sulla traccia UCSC Common SNPs(151)68. Infine, il grafico di correlazione CpG nella parte inferiore della figura si basa sui dati dei campioni di metilazione del DNA dello studio KORA F4 utilizzando l'array Illumina HumanMethylation450 BeadChip, con i siti mancanti di colore grigio chiaro.

La varianza è spiegata dalla metilazione del DNA.La percentuale di varianza fenotipica spiegata dalle 69 CpG replicate associate a eGFR è stata stimata utilizzando i dati di 1.888 partecipanti dello studio KORA FF4, il follow-up di sette anni dello studio KORA F457,58. Il KORA FF4 non faceva parte della meta-analisi EWAS. Tuttavia, 988 individui inclusi nell'analisi della varianza spiegata si sovrapponevano ai partecipanti KORA F4 dell'EWAS. In questo set di dati, la varianza spiegata da tutti i CpG indipendentemente dalle covariate è stata stimata come la differenza nell'R2 del modello base inclusi i CpG e quello senza. Il modello base è stato definito comerenetratto ~sesso più età più proporzioni di globuli bianchi più diabete più ipertensione più BMI più fumo corrente conrenetratto che rappresenta eGFR e UACR. Per due CpG associati a eGFR (cg06008406, cg20004659), non erano disponibili dati nel set di dati KORA FF4.

Analisi di randomizzazione mendeliana bidirezionale.In Forward MR, utilizzando il pacchetto R "TwoSampleMR"69, abbiamo studiato i potenziali effetti causali della metilazione del DNA ai CpG replicati su eGFR e UACR. La RM utilizza strumenti genetici per ridurre al minimo le distorsioni dovute a confondimento e causalità inversa70. Gli strumenti genetici per la metilazione del DNA (meQTL) erano disponibili rispettivamente per 47 e cinque CpG per eGFR e UACR, come precedentemente identificato da GoDMC in un massimo di 27,750 individui42. Riassunto dell'ascendenza europea I dati GWAS su eGFR10 e UACR13 sono stati utilizzati come rispettivi dati di esito. I filtri sono stati applicati per l'inclusione di meQTL (pSNP < 1e-5="" con="" metilazione="" del="" dna="" in="" una="" regione="" cis="" di="" ±="" 500="" kb,="" disequilibrio="" di="" collegamento="" r2="">< 0,="" 2="" all'interno="" di="" una="" regione="" di="" 1="" mb,="" filtraggio="" steiger,="" maf=""> 0, 05). Abbiamo eseguito analisi di MR ponderata per varianza inversa e analisi di sensibilità MR (modalità semplice, modalità ponderata, mediana ponderata e MR Egger) o triangolazione stimando il rapporto di Wald nel caso in cui fosse disponibile un solo strumento per sito CpG71-73. Le stime dell'effetto ottenute da MR dipendono dalle unità dei set di dati sottostanti e in questo caso corrispondono a una variazione per unità di una deviazione standard dei livelli di metilazione sull'eGFR trasformato in log naturale e alla deviazione standard dell'UACR trasformato in log naturale, rispettivamente. Nella RM inversa, abbiamo esaminato i potenziali effetti causali difunzione renaletratti sulla metilazione del DNA, utilizzando gli SNP significativi a livello del genoma da GWAS transetnici su eGFR10 e UACR13 come strumenti genetici rispettivamente per eGFR e UACR. Per massimizzare la potenza sui dati di esito, abbiamo eseguito una meta-analisi z-score delle associazioni SNP-CpG dagli studi KORA F4 (n=1662) ​​e FHS (n {9}}). Le stime dell'effetto combinato e i loro errori standard del meQTL incluso nel MR sono stati stimati dalla dimensione del campione, dalla frequenza dell'allele e dallo z-score74. I filtri sono stati applicati per l'inclusione SNP (valore P < 5e-8="">renetratto, valore P unilaterale < 0.05="" con="" azoto="" ureico="" nel="" sangue="" per="" strumenti="" egfr,="" eterogeneità="" ascendente="" valore="" p="" maggiore="" o="" uguale="" a="" 0.0="" 1,="" filtraggio="" steiger,="" maf=""> 0.05). Abbiamo eseguito la MR ponderata per varianza inversa con effetti casuali moltiplicativi (perché per ogni tratto era disponibile un numero sufficientemente elevato di strumenti da diversi loci)51 e le analisi di sensibilità della RM (modalità semplice, modalità ponderata, mediana ponderata e MR Egger)71–73. Come ulteriore analisi di sensibilità per le varianti pleiotropiche, abbiamo escluso in totale 35 strumenti associati al diabete mellito di tipo 2 in un recente GWAS75 che includeva 898.130 individui: undici SNP che avevano un valore P di associazione < 5e-8="" con="" il="" diabete="" e="" 24="" ulteriori="" strumenti="" che="" erano="" in="" linkage="" disequilibrium="" (r2=""> 0,2 entro 1 Mb, pannello di riferimento di 1000 G EUR) con un tale SNP associato al diabete. Il disequilibrio di collegamento è stato valutato tramite LDlink76. Per la RM inversa, le stime degli effetti forniscono rispettivamente la variazione per unità dell'eGFR trasformato in log naturale e la deviazione standard dell'UACR trasformato in log naturale su una deviazione standard dei livelli di metilazione del DNA. L'aggiustamento del test multiplo del valore P secondo Benjamini-Hochberg FDR < 0,05="" è="" stato="" applicato="" per="" tratto="" renale="" e="" per="" mr="" avanti="" e="" indietro="" separatamente77.="" i="" valori="" p="" di="" eterogeneità="" sono="" stati="" ottenuti="" dalla="" statistica="">

Analisi di arricchimento.Per informare i potenziali effetti funzionali dei CpG associati, abbiamo valutato l'arricchimento di questi CpG nei siti di DNasi I o modifica dell'istone (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), set di geni basati su termini e percorsi GO nei database KEGG e Reactome32 –35. Le analisi di arricchimento TFBS sono state eseguite come precedentemente descritto in dettaglio14. In breve, il test di arricchimento è stato valutato utilizzando eForge78 utilizzando la permutazione con corrispondenza per la localizzazione della regione insulare del gene e CpG durante il campionamento. I dati sono stati ricavati dai progetti ENCODE (125 campioni) o Roadmap Epigenomics (299 campioni) generati dal metodo Hotspot67,79,80. I CpG associati rispettivamente a eGFR e UACR con valore P < 1e−05="" nella="" meta-analisi="" sono="" stati="" utilizzati="" come="" input="" (dati="" supplementari="" 6="" e="" 7)="" e="" 10,000="" esecuzioni="" di="" ricampionamento,="" un="" filtro="" di="" prossimità="" attivo="" e="" considerato="" significativo="" fdr="">< 0,05="" (dati="" supplementari="" 13="" e="" 14).="" le="" analisi="" di="" arricchimento="" del="" segno="" istonico="" sono="" state="" eseguite="" in="" modo="" analogo="" (dati="" supplementari="" 15="" e="" 16).="" l'arricchimento="" in="" set="" o="" percorsi="" genici="" è="" stato="" valutato="" utilizzando="" il="" pacchetto="" metilgsa="" e="" la="" versione="" r="" 3.6.181.="" il="" metodo="" del="" test="" di="" arricchimento="" era="" metilglm="" implementando="" una="" regressione="" logistica="" che="" regola="" il="" numero="" di="" sonde="" per="" gene="" e="" il="" background="" autosomico="" che="" si="" sovrappone="" agli="" array="" 450k="" e="" epic.="" sono="" stati="" testati="" insiemi="" o="" percorsi="" genici="" con="" 100-500="" geni="" (impostazione="" predefinita).="" abbiamo="" considerato="" un="" set="" di="" geni="" o="" un="" percorso="" significativamente="" arricchito="" a="" fdr=""><0,05 correggendo="" test="" multipli="" all'interno="" di="" ciascun="" database="" utilizzando="" il="" metodo="" benjamini="" e="" hochberg="" (dati="" supplementari="" 17="" e="">