La meta-analisi dei risultati della quantificazione del NAD(P)(H) mostra variabilità tra i tessuti dei mammiferi Ⅱ

L'effetto della raccolta di tessuto pre mortem rispetto a quella post mortem sui livelli di NAD (P) (H).

Abbiamo previsto che potrebbe esserci qualche differenza osservabile nello stato redox NAD(P)(H) che dipende dalle procedure di raccolta dei tessuti. Per rispondere a questa domanda, abbiamo esaminato l'effetto delle procedure di raccolta dei tessuti pre-rispetto a quelle post-mortem sullo stato redox NAD(P)(H). Per questa analisi, abbiamo confrontato i valori dei tessuti del fegato di ratto dato il maggior numero di studi che definiscono il loro protocollo di sacrificio. Quando divulgati, tutti gli studi esaminati hanno affermato che i campioni di tessuto sono stati mantenuti freddi e immediatamente estratti su ghiaccio o congelati a -80 gradi prima delle misurazioni NAD (P) (H). Questa analisi ha determinato che non vi era alcuna differenza significativa nelle concentrazioni di NAD plus nel fegato di ratto (Fig. 6a) tra i tessuti estratti prima o dopo l'eutanasia. Tuttavia, i livelli di NADH riportati nel fegato di ratto sono significativamente più alti nei campioni post mortem (Fig. 6b). Non sono state osservate differenze nei livelli totali di NAD (H) (Fig. 6c), ma il rapporto NAD plus / NADH era inferiore nei tessuti raccolti dopo l'eutanasia (Fig. 6d), il che è coerente con la variazione osservata nei livelli di NADH. I risultati del rapporto NADP plus, NADPH e NADP plus / NADPH nel fegato di ratto raggruppati per punto temporale di raccolta del tessuto sono mostrati nella Figura 9 supplementare; tuttavia, il numero insufficiente di campioni post mortem non ci consente di interpretare l'effetto del timepoint di raccolta dei tessuti sui livelli di NADP(H). Nel fegato di topo, non vi era alcuna differenza tra i livelli di NAD plus pre e post mortem, tuttavia il numero di studi di segnalazione era limitante (Fig. 6e). NONADH,NADP plus, ONADPHdati post mortem infegato di topoera disponibile per il confronto.

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Discussione

Molti studi recenti hanno dimostrato che la regolazione del NAD(P)(H) è essenziale per l'omeostasi cellulare e lo stato redox. I dati ottenuti dai roditori hanno portato a studi che esaminano i livelli di NAD plus nel sangue umano, come indicatore meno invasivo dei livelli di NAD plus in tutto il corpo. Recenti studi clinici hanno dimostrato che i livelli di NAD plus erano ridotti negli stati patologici23,47 ed elevati in seguito a strategie di potenziamento di NAD plus23,44,48,49. Abbiamo eseguito una meta-analisi di tutti gli studi pubblicati tra il 1946 e il 20 giugno 2021, che contenevano dati quantitativi per i livelli di NAD(P)(H) nelle specie di mammiferi con un'attenzione particolare a topi, ratti e esseri umani in quanto rappresentano i più specie studiate in campo biomedico. Questa analisi è stata eseguita in parte per determinare il livello standard medio delle concentrazioni di NAD(P)(H) nei normali tessuti dei mammiferi data la ben nota varianza di queste misure tra gli studi. Ci auguriamo che questi dati possano essere utilizzati per stimolare protocolli standardizzati nel campo della ricerca NAD plus e per promuovere l'uso dei livelli NAD (P) (H) e dei rapporti redox come biomarcatori affidabili per i regimi di malattia e trattamento.

Nonostante la notevole variabilità nelle misure tra i tessuti dei roditori, questa meta-analisi ha mostrato livelli medi NAD plus simili tra i tessuti con alcune eccezioni. È interessante notare che il muscolo scheletrico del topo mostrava livelli NAD plus mediani inferiori (Fig. 2a) rispetto ad altri tessuti altamente metabolici (cioè fegato, rene, cuore e cervello). Ciò può indicare diversi stati redox NAD (H) nel muscolo scheletrico o può indicare maggiori problemi con l'estrazione del metabolita nei tessuti fibrosi. Tuttavia, queste osservazioni non possono essere verificate negli esseri umani a causa della mancanza di campioni di tessuti oltre sangue e muscoli.

Esistono molti potenziali fattori che potrebbero influenzare l'accuratezza delle misurazioni fisiologiche del NAD(P)(H) nei campioni di tessuto. Quando riportati, tutti gli studi hanno descritto i tessuti come raccolti e immersi direttamente in azoto liquido o tenuti in ghiaccio prima del congelamento o della lavorazione al fine di preservare le frazioni sensibili al calore (NAD plus e NADP plus). L'effetto del pH sulle varie frazioni NAD(P)(H), come la natura acido-labile delle forme NAD(P)H ridotte, ha portato all'uso di solventi di estrazione a pH neutro dalla maggior parte degli studi . Tuttavia, data la rapida interconversione dei metaboliti ridotti e ossidati e l'effetto dell'anossia sul NAD(H)50-53, è anche importante garantire una rapida estrazione dei metaboliti tissutali e le procedure appropriate per l'estinzione del NAD(P)(H) cellulare )-redox/enzimi di consumo, ad esempio attraverso la deproteinizzazione. In questo senso, la nostra analisi della raccolta di tessuto pre-post-mortem indica che l'analisi post-mortem favorisce la riduzione del NAD plus. La riduzione del NAD plus tissutale è stata precedentemente descritta in vivo nel cervello, nel cuore e nel fegato di ratti esposti a un'atmosfera ipossica prolungata di 2.5-h54, un ambiente che può essere parzialmente ricapitolato da lunghi periodi di post- sacrificare la raccolta dei tessuti prima del congelamento a scatto. Ciò potrebbe indicare che l'estrazione di tessuti sotto anestesia o la priorità alla raccolta immediata di tessuti destinati a essere utilizzati per l'analisi dei metaboliti dopo il sacrificio, dovrebbe avvenire per ottenere misurazioni NAD(P)(H) rappresentative.

Esiste anche la possibilità che vari metodi di quantificazione, ciascuno con limitazioni diverse, contribuiscano alla variabilità intra-studio complessiva delle misurazioni NAD(P)(H). Negli ultimi due decenni, i metodi utilizzati più di frequente sono stati i saggi del ciclo enzimatico, LC-MS e HPLC. Ciascuno di questi metodi è influenzato dalle tecniche di estrazione dei metaboliti, dai parametri di quantificazione e dall'implementazione di controlli di qualità adeguati. Utilizzando LC-MS, Lu et al. hanno dimostrato che l'interconversione tra le forme ridotte e ossidate dei metaboliti NAD(P)(H) avviene a velocità diverse in vari tamponi o solventi di estrazione con acetonitrile:metanolo:acqua con 0.1 M miscela di acido formico che produce la il più alto recupero con il minor numero di interconversioni31. Tuttavia, quando si utilizza LC-MS, questa interconversione può essere monitorata tra i singoli campioni di uno studio aggiungendo controlli interni come gli isotopi NAD(P)(H), il che rappresenta un vantaggio della tecnica LC-MS rispetto a quella dell'HPLC e dell'enzima analisi cicliche31,33,55. Tuttavia, anche con tecniche LC-MS ben controllate, vari fattori possono interferire con il segnale misurato, inclusi effetti matrice e variazioni nell'efficienza di ionizzazione. Ad esempio, alcuni studi utilizzano estratti di lievito marcati con 13C come standard interni nella metabolomica basata su LC-MS. Tuttavia, aggiungere alla matrice del metabolita del campione estratto una matrice del metabolita dell'estratto di lievito marcato con 13C può avere varie conseguenze, come la soppressione ionica, che riduce il segnale dei metaboliti marcati e/o non marcati, e può portare a errori nella quantificazione assoluta se non rilevati da un'approfondita valutazione della qualità56. Inoltre, sebbene le tecniche LC-MS consentano teoricamente la misurazione di più metaboliti NAD (P) (H) in un esperimento, ci sono ancora limitazioni poiché è necessario eseguire diluizioni ottimali se i metaboliti di interesse hanno grandi differenze nelle concentrazioni. Pertanto, nonostante i loro vantaggi rispetto ai più semplici saggi di ciclo enzimatico, la complessità dei metodi LC-MS impone la necessità di un'ottimizzazione completa. Recentemente sono stati sviluppati nuovi metodi analitici, come NAD più biosensori e spettrometria di massa basata su imaging, ma i dati quantitativi generati da queste tecniche sono ancora insufficienti per essere inclusi in una meta-analisi. Tuttavia, uno studio incluso nella nostra meta-analisi ha utilizzato un biosensore bioluminescente su carta per misurare i livelli di NAD plus nel fegato di topo e in altri tipi di campioni57. Questo studio è stato incluso nel gruppo dei test bioluminescenti a causa del metodo di rilevamento simile (Fig. 1a).

Metodi

Estrazione dati.

I dati numerici per i metaboliti NAD(P)(H) sono stati ottenuti direttamente dagli articoli o estratti dalle figure degli articoli utilizzando un software di estrazione dati semiautomatico (WebPlotDigitizer58). Inoltre, ove applicabile, sono stati registrati i punti temporali del campionamento dei tessuti relativi al sacrificio e/o ai metodi di campionamento dei tessuti/sangue (ad es. metodo di anestesia e/o eutanasia, manipolazione dei tessuti e temperatura di conservazione). Per i modelli animali, sono state registrate le specie, le caratteristiche (ad es. ceppo, genotipo, età e peso) e le condizioni ambientali (ad es. ciclo del sonno, tipo di dieta, frequenza di alimentazione e stato di alimentazione rispetto al campionamento dei tessuti). Inoltre, per tutti gli studi, sono stati estratti i trattamenti (ad es. trattamenti farmacologici, interventi chirurgici, irradiazione, induzione del tumore e altre procedure applicate ai soggetti dello studio) e tutte le informazioni sui gruppi di studio (ad es. gruppi di trattamenti o malattie e controlli corrispondenti). Infine, il metodo di quantificazione del NAD(P)(H) (ad es. saggi enzimatici, basati sulla spettrometria di massa, HPLC, NMR, bioluminescenza) e le specifiche della pubblicazione (ad es. titolo della pubblicazione, codice di riferimento [DOI, Medline UI, PMID] o collegamento ipertestuale e anno di pubblicazione) sono stati annotati (materiale supplementare 2).

Analisi dei dati. Prima dell'analisi, tutte le concentrazioni sono state convertite in nmol/g di tessuto o in nmol/g di proteine ​​per i campioni di tessuto o in nmol/ml per le frazioni del sangue. A causa del basso numero di risultati normalizzati al contenuto proteico, mostriamo solo i risultati normalizzati al peso del tessuto e al volume del sangue. L'analisi statistica è stata eseguita con GraphPad Prism versione 9.3.1 (GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA,Disponibilità dei datiTutti i dati estratti e analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato e nel suo supplementofile informativi.Ricevuto: 29 aprile 2022; Accettato: 7 febbraio 2023

Riferimenti

10. Amore, NR et al. La chinasi NAD controlla la biosintesi del NADP animale ed è modulata tramite meccanismi dipendenti dalla calmodulina evolutivamente divergenti. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 1386–1391 (2015).

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