La proteina 75 regolata da mortalina/glucosio promuove la resistenza al cisplatino del cancro gastrico

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Il trattamento farmacologico con platino è una delle strategie chemioterapiche più predominanti per i pazienti con cancro gastrico (GC). Tuttavia, l'effetto terapeutico è tutt'altro che soddisfacente, in gran parte a causa della resistenza acquisita ai farmaci platino. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti può migliorare notevolmente l'efficacia terapeutica del GC. In questo studio, abbiamo mirato a studiare le funzioni/meccanismi correlati alla chemio-resistenza e il significato clinico della proteina 75 regolata dal glucosio (GRP75) in GC. Qui, i nostri dati hanno mostrato che rispetto alle cellule SGC7901, l'espressione di GRP75 era notevolmente più alta nella resistenza al cisplatino (cellule (SGC7901 *). Il knockdown di GRP75 ha abolito il mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale (MP) e ha inibito il fattore nucleare eritroide{{ 10}}fattore correlato 2 (NRF2), fosfatidilinositolo 3 chinasi/protein chinasi B (Pl3K/AKT), fattore 1a inducibile dall'ipossia (HIF-1a) e c-myc, che ha provocato il blocco dell'attivazione di i loro bersagli a valle. Questi processi hanno attenuato le capacità anti-ossidazione/apoptosi e alterato la riprogrammazione metabolica nelle cellule SGC7901 ", portando a sensibilizzare nuovamente queste cellule al cisplatino. Tuttavia, la sovraespressione di GRP75 nelle cellule SGC7901 ha causato gli effetti opposti. Un modello di xenotrapianti ha confermato i risultati sopra menzionati.Nei pazienti con GC sottoposti a chemioterapia al platino e una meta-analisi, un livello elevato di GRP75 è stato positivamente associato a caratteristiche aggressive e prognosi sfavorevole incluso ma non limitato a gastr tumori intestinali, ed era un predittore indipendente per la sopravvivenza globale. Collettivamente, il nostro studio ha indicato che GRP75 era coinvolto nella resistenza al cisplatino di GC e che GRP75 potrebbe essere un potenziale bersaglio terapeutico per ripristinare la risposta al farmaco nelle cellule di resistenza al platino e un utile strumento prognostico additivo nel guidare la gestione clinica dei pazienti con GC.

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introduzione

Il cancro gastrico (GC) è stata la prima incidenza e la seconda mortalità dei tumori dell'apparato digerente in Cina. I trattamenti attuali per il GC avanzato erano l'operazione chirurgica combinata con la chemioterapia sistemica, ma il tasso di sopravvivenza a lungo termine era meno che soddisfacente a causa dell'elevata recidiva post-chirurgica2. Nella pratica clinica, i farmaci platino erano uno degli agenti di prima linea per Chemioterapia GC3. Tuttavia, la resistenza acquisita ai farmaci si è sempre verificata dopo più cicli di trattamento a base di platino e indica una prognosi sfavorevole.cistanciaPertanto, è stato urgentemente essenziale illuminare i potenziali meccanismi e identificare le nuove strategie terapeutiche per superare la resistenza ai farmaci al platino nei pazienti con GC.

Cistanche può antietà

La proteina 75 regolata dal glucosio (GRP75) era l'accompagnatore molecolare inducibile dallo stress che apparteneva alla famiglia delle proteine ​​da shock termico4. La sovraespressione di GRP75 era strettamente associata alla progressione del tumore in vari tumori umani5-7. Qui, esplorando una meta-analisi, abbiamo scoperto che un livello elevato di GRP75 indicava una prognosi significativamente sfavorevole in diversi tumori dell'apparato digerente (cancro del colon-retto, colangiocarcinoma e cancro del pancreas). Per la resistenza ai farmaci, l'inibizione del GRP75 ha invertito la resistenza al cisplatino e alla doxorubicina nel carcinoma epatocellulare e nel cancro ovarico". i tumori positivi avevano una prognosi peggiore rispetto ai tumori negativi GRP75 in GC con normale funzione di p53. Tuttavia, p53 era uno dei geni mutati più frequentemente in GC (che interessava più del 50% dei pazienti)l2-15. Quindi abbiamo ipotizzato che oltre alla classica repressione dell'attività di p53, GRP75 potrebbe essere coinvolto nell'indurre/mantenere la resistenza ai farmaci al platino in GC tramite l'impiego di ap53-in modo indipendente.

In questo studio, la maggiore espressione di GRP75 ha contribuito alla resistenza al cisplatino nelle cellule SGC7901 e in un modello di xenotrapianto. Meccanicamente, GRP75 ha indotto/mantenuto la resistenza al cisplatino regolando le capacità antiossidanti/apoptotiche e le proprietà di riprogrammazione metabolica.cistanche AustraliaNei pazienti con GC, la sovraespressione di GRP75 ha contribuito alle caratteristiche aggressive e alla prognosi infausta. I nostri risultati hanno indicato che GRP75 ha promosso la resistenza al cisplatino in GC e potrebbe essere un biomarcatore per predire la risposta al trattamento farmacologico con platino.benefici di cistanceIl targeting del GRP75 potrebbe fornire una nuova comprensione della chemioterapia sistemica GC.

Risultati

Gli effetti del GRP75 sulla resistenza al cisplatino nei test di vitalità cellulare GC sono stati impiegati per verificare la resistenza delle cellule SGC7901~, l'Ipsos (uM) del cisplatino per le cellule SGC7901 e SGC7901CR era: 5,518 contro 72,46 (Fig. 1A). Sulla base dei database KM-Plotter, l'aumentata espressione di GRP75 indicava una prognosi sfavorevole (Fig.1B). Inoltre, le espressioni di GRP75 notevolmente aumentate nelle cellule SGC7901CR rispetto alle sue cellule SGC7901 parentali (Fig. 1C), suggerendo che GRP75 potrebbe contribuire alla resistenza al cisplatino. Per verificare questa ipotesi, le cellule SGC7901~ sono state trasfettate da siRNA scramble o GRP75 e gli IC50 (uM) di cisplatino per cellule SGC7901CK trasfettate con siRNA scrambled o GRP75 erano: 50,83 vs.20.86, rispettivamente (Fig. 1D). In contrasto,

la sovraespressione di GRP75 trasfettando i plasmidi GRP75 in cellule SGC7901 ha mostrato che gli IC50 del cisplatino per plasmidi scramble o GRP75 hanno trasfettato le cellule SGC7901 erano 3,825 contro 6,98 (Fig. 1E). Collettivamente, questi risultati hanno rivelato che GRP75 ha svolto ruoli cruciali nel mantenere/indurre la resistenza al cisplatino in GC, ma i meccanismi sono rimasti ulteriori indagini.

I potenziali meccanismi alla base del GRP75 hanno causato la resistenza al cisplatino

Abbiamo scaricato i set di dati di microarray GSE122130 (SGC7901CR vs. SGC7901) e GSE14209 (tessuti, resistenti al cisplatino vs. sensibili al cisplatino) da GEO, quindi abbiamo eseguito il processo GO-Biological e l'analisi di arricchimento KEGG-Pathway basata su DAVID e i primi 10 i risultati sono stati mostrati in Fig.2A-D. Le differenze essenziali dei processi biologici tra le cellule SGC7901C* e le cellule SGC7901 includevano la riduzione dell'ossidazione, il processo apoptotico (Fig. 2A), l'analisi di arricchimento KEGG-Pathway ha rilevato che i set di DEG erano strettamente correlati con le vie metaboliche e il fosfatidilinositolo 3 chinasi/proteina chinasi B (PI3K/AKT) (Fig. 2B). La risposta al farmaco è stata inclusa nelle differenze essenziali dei processi biologici tra i tessuti tumorali resistenti al cisplatino e sensibili al cisplatino e la via metabolica era anche il collegamento centrale nell'analisi di arricchimento KEGG-Pathway (Fig.2C, D). Inoltre, è stata costruita una rete di 60 proteine ​​​​che hanno interagito in modo significativo con GRP75 utilizzando il database String, quindi l'analisi KEGG-Pathway ha rilevato che le vie metaboliche hanno svolto un ruolo importante tra GRP75 e i suoi interattori (Fig. 2E). Sulla base di questi risultati, abbiamo ipotizzato che l'antiossidazione/apoptosi e la riprogrammazione metabolica potrebbero promuovere la sopravvivenza e la crescita di GC che portano alla resistenza al cisplatino. Tuttavia, i meccanismi della partecipazione del GRP75 alla regolamentazione necessitavano di ulteriori studi (Fig. 2F).

Effetti di GRP75 su antiossidante e anti-apoptosi Qui, il livello di ROS intracellulare era elevato nelle cellule SGC7901CR rispetto alle sue controparti parentali (Fig. 3A), suggerendo che le cellule SGC7901Ck erano esposte a condizioni di stress ossidativo relativamente più elevate. Uno studio precedente ha rivelato che GRP75 è stato coinvolto nella stabilizzazione di MMP, un'importante fonte di generazione di ROS. Qui, il knockdown di GRP75 ha abolito il mantenimento della MMP nelle cellule SGC7901CK indotte dal cisplatino e la sovraespressione di GRP75 ha avuto l'effetto opposto nelle cellule SGC7901 (Fig. 3B).colesterolo delle cistanzeQuindi, abbiamo convalidato la relazione tra GRP75 e antiossidante e anti-apoptosi. Come mostrato in Fig. 3C, il knockdown di GRP75 ha ridotto il livello del fattore nucleare eritroide-2-fattore 2 correlato (NRF2) e dei suoi geni bersaglio a valle (HO-1 e NQO-1) in SGC7901 ~ cellule e la sovraespressione di GRP75 ha mostrato l'effetto opposto nelle cellule SGC7901. Inoltre, il knockdown di GRP75 o NRF2 nelle cellule SGC7901CR ha ulteriormente migliorato le generazioni di ROS intracellulari, l'apoptosi (Fig. 3D) e le attività della caspasi-3 (Figura complementare S1) indotte dal cisplatino. Al contrario, la sovraespressione di GRP75 nelle cellule SGC7901 ha attenuato significativamente le generazioni di ROS indotte dal cisplatino, l'apoptosi cellulare (Fig. 3E) e le attività della caspasi-3 (Figura complementare S1). Questi risultati hanno rivelato che la resistenza al cisplatino mantenuta/indotta da GRP75 potrebbe essere l'induzione dell'antiossidazione e dell'anti-apoptosi nelle cellule GC.

Effetti di GRP75 sulla riprogrammazione metabolica Successivamente, abbiamo ulteriormente studiato il modo in cui GRP75 ha indotto un'alterazione della riprogrammazione metabolica. Prove crescenti hanno mostrato che il metabolismo delle cellule tumorali non era un cambiamento anormale in una singola via metabolica, ma una riprogrammazione dell'intera rete metabolica cellulare17. Molti oncogeni classici o vie di segnalazione sono stati coinvolti direttamente o indirettamente nella riprogrammazione metabolica, come PI3K/AKT, fattore la inducibile dall'ipossia (HIF-la), c-myc e così via"'819. Pertanto, abbiamo verificato se GRP75 fosse coinvolti nella riprogrammazione metabolica delle cellule GC. Come mostrato in Fig. 4A, abbiamo osservato livelli aumentati di p-AKT, HIF-la e c-myc nelle cellule SGC7901CR rispetto alle sue cellule SGC7901 parentali. Inoltre, nelle cellule SGC7901CR, atterramento di GRP75 ha ridotto i livelli di p-AKT, HIF-la e c-Myc indotti dal cisplatino e i loro target a valle correlati alla glicolisi (HK2: esochinasi 2; PDK1: piruvato deidrogenasi chinasi l e LDHA: lattato deidrogenasi A catena). Al contrario, la sovraespressione di GRP75 nelle cellule SGC7901 ha mostrato l'effetto opposto (Fig. 4B, C). Inoltre, il knockdown di GRP75 o AKT nelle cellule SGC7901CR ha mostrato una significativa diminuzione dell'assorbimento del glucosio e della vitalità/crescita cellulare indotta dal cisplatino; tuttavia, sovraespressione di GRP75 nelle cellule SGC7901 notevolmente aumentato la capacità di assorbimento del glucosio e la vitalità/crescita cellulare causata dal cisplatino (Fig. 4D-F). Collettivamente, questi dati hanno indicato che la resistenza al cisplatino mantenuta/indotta da GRP75 nelle cellule GC potrebbe essere attraverso la partecipazione alla riprogrammazione metabolica mediata da p-AKT, HIF-la e c-myc.

Conferma dei dati in vitro in un modello di xenotrapianto Quindi abbiamo studiato la potenziale rilevanza clinica di GRP75 in vivo. I dati sullo xenotrapianto hanno indicato che il trattamento con il solo cisplatino o il knockdown del solo GRP75 potrebbe inibire la crescita del tumore; tuttavia, il trattamento con cisplatino combinato con il knockdown GRP75 ha facilitato significativamente l'inibizione della crescita del tumore indotta dal cisplatino (Fig. 5A). Inoltre, i test IHC e qPCR hanno mostrato che cisplatino più GRP75 siRNA riduceva significativamente le espressioni di Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT e target a valle rispetto al solo trattamento con cisplatino, ma aumentava l'apoptosi (come determinato dalla colorazione TUNEL, Fig. 5B , C). Collettivamente, questi risultati hanno indicato che, attraverso la regolazione delle capacità antiossidanti/anti-apoptosi e la riprogrammazione metabolica, GRP75 ha stimolato la sopravvivenza e la crescita in vivo che a sua volta ha portato alla resistenza al cisplatino di GC.

Identificazione di GRP75 come un caratteristico fattore di promozione del cancro e significato clinico di GRP75 in GC

Abbiamo quindi valutato l'espressione di GRP75 in sezioni consecutive di campioni GC. Come mostrato in Fig. 6A, rispetto ai tessuti gastrici adiacenti non tumorali, è stata osservata una notevole elevazione dell'espressione di GRP75 nei tessuti GC. La sovraespressione di GRP75 è stata dimostrata nei tessuti GC dal punteggio di intensità IHC (Fig. 6B). È stata osservata anche una colorazione più forte per GRP75 con l'aumento della classificazione TNM dello stadio dei tumori maligni (Fig. 6C, D). Quindi, abbiamo diviso questi 116 campioni GC in due gruppi ("GRP75 basso" vs. "GRP75 alto", secondo l'intensità IHC, Fig. 6E). I diametri trasversali dei tumori nel gruppo "GRP75 alto" erano significativamente più grandi di quelli nel gruppo "GRP75 basso" (Fig. 6F). Abbiamo ulteriormente convalidato la prognosi clinica di GRP75 in GC. L'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier ha anche mostrato che i pazienti con GC nel gruppo "GRP75 alto" avevano una sopravvivenza globale peggiore rispetto a quelli nel gruppo "GRP75 basso" (Fig. 6G).

L'analisi multivariata ha identificato che GRP75 era un predittore indipendente per la sopravvivenza globale (Tabella 1).cistanche deserticola effetti collaterali,In sintesi, questi risultati hanno suggerito che GRP75 avesse un ruolo caratteristico nella progressione del GC, nella resistenza al cisplatino e nella prognosi sfavorevole. La meta-analisi dell'alto livello di GRP75 con la prognosi Il diagramma di flusso della ricerca e selezione della letteratura e la meta-analisi sono state mostrate nella Figura S2 supplementare. Il modello a effetti casuali e il modello a effetti fissi sono stati utilizzati per calcolare e analizzare il valore HR, entrambi hanno mostrato che livelli elevati di GRP75 sono significativamente associati a scarsi risultati per i pazienti. L'HR aggregato era 1,91 (IC al 95% da 1,62 a 2,25), con eterogeneità(I'=0.0 percento ,p =0.559)(Fig. 7A). Quindi abbiamo effettuato un'analisi per sottogruppi, che ha mostrato che il livello di espressione di GRP75 nel cancro gastrointestinale (HR aggregato era 1,99,95% CI da 1,64 a 2,43), ha una relazione significativa con una prognosi infausta di sopravvivenza. Certamente, risultati simili sono stati trovati anche in altri tumori (l'HR aggregato era 1,74,95% CI da 1,29 a 2,33) (Fig.7B). Tutti e due

Il diagramma a imbuto di Begg e il test di Egger sono stati utilizzati per valutare il possibile bias di pubblicazione degli studi inclusi. Nell'analisi dell'associazione tra GRP75 e OS, il valore p del test di Begg e del test di Egger era 0.076 e 0,024, rispettivamente (Fig.7C e D). Tuttavia, il test di Egger ha una maggiore sensibilità nella valutazione del bias di pubblicazione. Pertanto, il metodo di ritaglio e riempimento è stato utilizzato per rendere i nostri risultati più credibili. Come mostrato in Fig. 7E, la FC aggiustata nel modello a effetti fissi era 1,785 (IC 95% da 1,530 a 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Discussione

In questo studio, abbiamo utilizzato uno degli agenti chemioterapici di prima linea per i pazienti con GC, i farmaci platino. Classicamente, i farmaci a base di platino potrebbero legarsi in modo covalente alla guanina sulla catena del DNA e quindi bloccare la replicazione e la trascrizione del DNA2. Tuttavia, a causa della resistenza ai farmaci e degli effetti collaterali indesiderati, l'identificazione di nuove strategie terapeutiche per invertire la resistenza nei pazienti con GC era urgentemente essenziale. Inoltre, i pazienti con GC hanno sviluppato resistenza ai farmaci dopo aver ricevuto diversi cicli di cisplatino e i nostri risultati hanno mostrato che le cellule SGC7901~ hanno mostrato una resistenza significativa al cisplatino rispetto alle cellule SGC7901.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) ha svolto un ruolo chiave nella regolazione dell'inizio e della progressione dei tumori umani-7. Più recentemente, era diventato chiaro che anche il GRP75 aveva un ruolo fondamentale nella resistenza alla chemioterapia". . Tuttavia, il meccanismo molecolare di GRP75 e resistenza al cisplatino è stato raramente riportato. Qui, il nostro studio ha rivelato che GRP75 ha promosso capacità anti-ossidazione/apoptosi e ha alterato la riprogrammazione metabolica, portando alla resistenza al cisplatino nelle cellule GC. Abbiamo anche scoperto che GRP75 era sovraregolato in SGC7901~ e nei campioni di tessuto dei pazienti, ed era correlato con resistenza ai farmaci, pro-sopravvivenza, crescita e scarsi risultati. Nel frattempo, l'analisi multivariata ha identificato che GRP75 era un predittore indipendente per la sopravvivenza globale. Inoltre, la meta-analisi ha indicato che un l'alto livello di GRP75 ha mostrato una prognosi sfavorevole incluso ma non limitato a GC, che era altamente coerente con la nostra ricerca.Tutti i risultati di cui sopra hanno convalidato che il targeting di GRP75 potrebbe dovrebbe diventare un nuovo approccio per invertire la resistenza al cisplatino e migliorare la prognosi dei pazienti con GC.

In condizioni fisiologiche, le cellule erano inevitabilmente esposte a ROS da fattori esterni e dal metabolismo aerobico intracellulare. Come un'arma a doppio taglio, i ROS appropriati erano importanti molecole segnale che regolano la normale funzione delle cellule, mentre i ROS eccessivi portavano all'apoptosi. Pertanto, nell'organismo esisteva un preciso sistema di regolazione antiossidante per mantenere l'equilibrio redox e le procedure apoptotiche 20. Tuttavia, a differenza delle condizioni fisiologiche, i livelli di ROS dei tumori erano generalmente significativamente superiori ai normali controlli della stessa origine tissutale, il che determinava l'esistenza di uno speciale sistema antiossidante nelle cellule tumorali, in particolare per le cellule tumorali resistenti ai farmaci27-29. I nostri risultati hanno confermato che le cellule SGC7901CR hanno mostrato un livello relativamente più alto di ROS rispetto alle cellule SGC7901 e che il GRP75 ha elevato le capacità di antiossidante/apoptosi. Le cellule tumorali avevano una lunga storia di anomalie metaboliche. Già negli anni '30 Otto Warburg scoprì che le cellule tumorali preferiscono la glicolisi. Anche in condizioni di ossigeno sufficiente, le cellule tumorali hanno mantenuto alti tassi di glicolisi per la generazione di ATP. Questo pattern metabolico anormale è stato chiamato "effetto Warburg"3031. I cambiamenti metabolici guidati dall'effetto Warburg sono stati recentemente indicati come riprogrammazione metabolica e gli studi su questi cambiamenti hanno fornito una comprensione più profonda del metabolismo delle cellule GC. È stato dimostrato che le cellule GC e le cellule normali esibivano differenze metaboliche non solo nel metabolismo del glucosio ma anche nel metabolismo dei lipidi e degli aminoacidi³2-35. In questa ricerca, abbiamo scoperto che i cambiamenti nel metabolismo del glucosio erano uno dei principali collegamenti mantenendo la crescita cellulare, portando infine alla resistenza al cisplatino GC.

Come accennato, gli oncogeni classici e le vie di segnalazione come PI3K/AKT, HIF-la e c-myc sono stati coinvolti direttamente o indirettamente nella riprogrammazione metabolica. L'attivazione della via PI3K/AKT nelle cellule tumorali ha potenziato molte delle attività metaboliche. In primo luogo, consentiva alle cellule di assorbire glucosio, aminoacidi e altri nutrienti. In secondo luogo, l'AKT ha aumentato la glicolisi e la produzione di lattato attraverso i suoi effetti sull'espressione genica e sull'attività enzimatica ed è stato sufficiente per indurre un effetto Warburg nelle cellule tumorali. In terzo luogo, l'attivazione di questo percorso ha migliorato la biosintesi delle macromolecole e stimolato l'espressione di geni lipogenici e la sintesi lipidica'7. Inoltre, GRP75- ha attivato l'AKT e le protein chinasi 1 e 2 regolate dal segnale extracellulare hanno inibito i cambiamenti conformazionali di Bax e l'apoptosi 8. Le cellule tumorali si sono adattate all'ipossia coinvolgendo la riprogrammazione metabolica tramite la sovraregolazione dei geni bersaglio HIF-la per stimolare l'assorbimento del glucosio, la glicolisi, produzione e secrezione di acido lattico, accumulo di glicogeno, catabolismo della glutammina³ e promuovere l'accumulo di trigliceridi nelle goccioline lipidiche³. Più recentemente, è diventato chiaro che il GRP75 potrebbe legarsi specificamente a HIF-la e colpire la membrana mitocondriale esterna, associata a VDAC1 e HK2, che hanno impedito l'apoptosi'. C-myc potrebbe mediare la riprogrammazione metabolica in diversi modi e la riprogrammazione metabolica mediata da c-myc è stata in gran parte ottenuta influenzando i mitocondri. Da un lato, c-myc ha anche promosso la glicolisi regolando direttamente l'espressione di enzimi correlati alla glicolisi, inclusi LDHA, HK2 e PDK11938. D'altra parte, gli enzimi attivati ​​​​da c-myc coinvolti nel metabolismo della glutammina tramite la trascrizione hanno promosso l'utilizzo di glutammina dai mitocondri nelle cellule tumorali. Questo effetto è chiamato "glutamminolisi". Inoltre, la sovraespressione75-di GRP ha ridotto la ciclina-B1 e sovraregola la ciclina-D1 e c-myc per promuovere la crescita delle cellule del cancro ovarico*. Sulla base dei nostri risultati attuali, abbiamo fornito una nuova comprensione della resistenza al cisplatino GC attraverso GRP75 come collegamento potenzialmente importante nella regolazione delle reti di riprogrammazione metabolica del tumore.

Conclusioni

In conclusione, abbiamo dimostrato che la sovraespressione di GRP75 potrebbe promuovere la sopravvivenza/crescita nelle cellule GC regolando l'antiossidazione/apoptosi e le reti di riprogrammazione metabolica, inducendo così la resistenza al cisplatino

Materiali e metodi

Cellule, reagenti e condizioni di coltura

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.{1}} percento di purezza), è stata acquistata da Sigma-Aldrich (Shanghai, Cina). Le cellule sono state coltivate in mezzo RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 100 U/ml di penicillina, 100 ug/ml di streptomicina (Gibco) e incubate nel 5 percento di CO2 a 37 gradi. Per il mantenimento del fenotipo di resistenza al cisplatino, le cellule SGC7901CR sono state incubate in un mezzo contenente cisplatino (5μM).

Xenotrapianti e trattamenti

Questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di medicina di Nanchino e gli animali sono stati trattati in modo umano e per quanto riguarda l'alleviamento della sofferenza. I topi nudi BALB/c sono stati ottenuti dall'SLRC Laboratory Animal Center (Shanghai, Cina) e conservati convenzionalmente come descritto in precedenza*l. Per lo studio sullo xenotrapianto, cellule SGC7901CK da 2 × 10 gradi in 100ul di matrigel sono state iniettate per via sottocutanea nei fianchi dei topi per 5 settimane. Per determinare gli effetti di GRP75 sulla resistenza al cisplatino di GC, abbiamo eseguito il test di iniezione intratumorale e intraperitoneale. In breve, i topi sono stati divisi casualmente in 4 gruppi (5 topi per gruppo): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK＋cisplatino e （4） GRP75 KD＋cisplatino. 100 ul di siRNA (si-Con o si-GRP75, 100 nM) erano iniezioni intratumorali ogni 3 giorni. I gruppi sottoposti a terapia con cisplatino (5 mg/kg) sono stati iniezioni intraperitoneali 3 volte a settimana e gli altri gruppi sono stati perfusi con un uguale volume di soluzione fisiologica. I tumori sono stati misurati ogni settimana e i loro volumi sono stati calcolati utilizzando la formula: V=Y (larghezza2 lunghezza). Dopo 5 settimane, i topi sono stati sacrificati e i tessuti tumorali sono stati rimossi per ulteriori indagini.

Pazienti e campioni di tessuto

Questo studio è stato approvato dal Comitato di etica medica del Secondo ospedale affiliato, Università di medicina di Nanchino e dall'ospedale affiliato Changzhou n. 2 dell'Università di medicina di Nanchino e i consensi informati scritti dei partecipanti sono stati ottenuti da ciascun paziente. I dati clinico-patologici sono stati elencati nella Tabella Supplementare S1. Il microarray tissutale è stato costruito da Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Shanghai, Cina) come descritto in precedenza*

Trasfezione cellulare

Per la trasfezione, scrambled e pcDNA-3.1-GRP75-Flag sono stati sintetizzati da General Biotech (Shanghai, Cina); mentre i siRNA erano elencati nella tabella supplementare S2. Le cellule sono state transfettate transitoriamente tramite il reagente lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, USA), secondo il protocollo del produttore. In breve, le cellule sono state piastrate su 6-piastre a pozzetti a una densità di cellule di 1 × 10 gradi in terreno RPMI 1640 contenente il 10 percento di FBS senza antibiotici. Dopo l'incubazione per 24 ore, le cellule sono state transfettate transitoriamente con 5 ng/ml scrambled o GRP75-Flag, o 20 nM si-Con o si-GRP75 per 12 ore. Dopo la trasfezione, le cellule sono state coltivate in un mezzo fresco integrato con FBS al 10% per altre 24 ore prima di essere utilizzate per altri esperimenti.

Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR) I primer utilizzati sono stati elencati nella tabella supplementare S3. L'isolamento dell'RNA totale, la trascrizione dell'RNA in cDNA e le prestazioni di qRT-PCR con la macchina Applied Biosystems 7300HT erano tutti secondo il nostro precedente studio 2. L'-actina è stata amplificata per garantire l'integrità del cDNA e per normalizzare l'espressione. Le variazioni di piega nell'espressione di ciascun gene sono state calcolate mediante un metodo del ciclo di soglia comparativo (Ct) utilizzando la formula 2-(4ACt)

Questo articolo è tratto da Dai et al. Scoperta della morte cellulare (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w