Vaccino a base di mRNA per il COVID-19: sono nuovi ma non sconosciuti!

Astratto:

I vaccini a mRNA sfruttano il meccanismo utilizzato dalle nostre cellule per produrre proteine. Le nostre cellule producono proteine ​​in base alla conoscenza contenuta nel nostro DNA; ogni gene codifica per una proteina unica. L'informazione genetica è essenziale, ma le cellule non possono usarla finché le molecole di mRNA non la convertono in istruzioni per produrre proteine ​​specifiche. Le vaccinazioni mRNA forniscono istruzioni mRNA pronte all'uso per costruire una proteina specifica. BNT162b2 (Pfizer-BioNTech) e mRNA-1273 (Moderna) sono entrambi vaccini anti-COVID basati su mRNA-19 recentemente approvati che hanno dimostrato protezione ed efficacia eccellenti. In totale, ci sono altri cinque candidati vaccini basati su mRNA per il COVID-19 in diverse fasi di sviluppo clinico. Questa recensione si concentra specificamente sui vaccini basati su mRNA per il COVID-19 e ne copre lo sviluppo, il meccanismo e gli aspetti clinici.

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Parole chiave:

vaccino anti-COVID-19; vaccini a mRNA; sviluppo di vaccini; vaccini basati su vettori

1. Introduzione

La pandemia di malattia da coronavirus{{0}} (COVID-19) causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus-2 (SARS-CoV-2) si è diffusa in tutto il mondo. Ad oggi, a livello globale, ci sono stati 662 milioni di casi confermati di COVID-19, inclusi 6,6 milioni di decessi segnalati all'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) [1]. Il virus colpisce più di 200 paesi in tutto il mondo, con la maggior parte dei casi segnalati in Brasile, Russia e Stati Uniti [2]. La prima segnalazione di un'epidemia di COVID-19 è arrivata dalla città di Wuhan, provincia cinese di Hubei, il 30 dicembre 2019. A Wuhan sono stati registrati focolai di casi di polmonite. Successivamente, il 7 gennaio 2020, si è scoperto che l'agente causale è un nuovo coronavirus (2019-nCoV). Alla fine l’OMS chiamò la malattia COVID-19 [3,4]. Il tasso di mortalità stimato varia dallo 0,5 all'1,5%. SARS-CoV-2 appartiene alla famigliaCoronaviridaee l'ordineNidovirales. SARS-CoV-2 appartiene al Betacoronavirus che ha una stretta relazione genomica con due virus, SARS-CoV e il coronavirus della sindrome respiratoria mediorientale (MERS CoV). Rispetto alla SARS e alla MERS, la SARS-CoV-2 è altamente contagiosa. Il COVID-19 è una malattia grave di rilevanza globale. La malattia non può essere trattata con un farmaco antivirale specifico, la chiave per prevenire la diffusione della malattia è interrompere la catena di trasmissione [5]. Per ridurre la prevalenza e i tassi di mortalità, viene utilizzata l’immunizzazione di massa contro la pandemia [6,7]. Da quando la sequenza del genoma della SARS-CoV-2 è stata rilasciata l'11 gennaio 2020, sono stati studiati più di 150 progetti di immunizzazione delle autorità. L’obiettivo principale della vaccinazione è indurre una risposta immunitaria che fornisca protezione a lungo termine contro la gravità della malattia [8]. Come valutato da Paddy Ssentongo e colleghi [9], l’efficacia del vaccino (VE) contro tutte le infezioni da SARS-CoV-2 è scesa dall’83% nel primo mese dopo il completamento della prima serie di immunizzazioni al 22% dopo 5 mesi o più . Allo stesso modo, il VE contro il COVID-19 sintomatico è diminuito dal 94% nel primo mese al 64% durante il quarto mese successivo all’immunizzazione. Nel complesso, il VE contro il COVID grave-19 è stato forte a tutte le età, con un livello del 90% (IC 95%, 87-92%) cinque mesi o più dopo la vaccinazione completa.

Il coronavirus ha aggiunto la proteina (S) sulla sua superficie; questa proteina S interagirà con il dominio di legame del recettore dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE) [10,11]. La maggior parte dei candidati al vaccino prendono di mira questa proteina S del virus [12]. Il vaccino Pfizer BioNTech COVID-19-BNT162b2 è la prima immunizzazione approvata dalla Food and Drug Administration (FDA). Si basa sull'RNA messaggero (mRNA) prodotto da Pfizer che ha ricevuto l'autorizzazione all'uso di emergenza per soggetti di età pari o superiore a 12-15 anni per la prevenzione della malattia COVID-19. La Food and Drug Administration statunitense (USFDA) ha approvato il vaccino Pfizer il 23 agosto 2021 [13]. Vari studi hanno riportato che l’immunizzazione ha un’efficienza dell’89,1% nel prevenire l’infezione da SARS-CoV-2; inoltre, i vaccini hanno anche ridotto i ricoveri ospedalieri, i decessi e la prevenzione dei ricoveri in terapia intensiva correlati al COVID-19-. La diffusione controllabile del SARS-CoV-2 può essere ottenuta prima quando un'ampia percentuale della popolazione viene immunizzata (ad esempio, 70–80%). L'immunizzazione riduce significativamente l'incidenza del COVID-19. Il vaccino fornisce una risposta immunitaria robusta ed efficace per sradicare l'infezione SARS-CoV-2 dal corpo umano. Le persone infette hanno avuto una potente risposta delle cellule T al virus, che può aiutarle nella capacità di riprendersi dall’infezione [14,15]. La neutralizzazione è rimasta fortemente correlata alla protezione dall’infezione sintomatica con varianti di SARS-CoV-2 preoccupanti [16]. Pertanto, la vaccinazione è la strategia per controllare la pandemia.

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I vaccini contro il COVID-19 vengono sviluppati su diverse piattaforme. Ne sono esempi un virus vivo attenuato, vaccini inattivati, vettori virali non replicanti, RNA e DNA. Diversi tipi di vaccini con esempi sono elencati nella Figura 1. Una strategia per lo sviluppo del vaccino consiste nell'utilizzare il virus SARS-CoV-2 ucciso, non è in grado di replicarsi ma può rimanere intatto nel corpo. Il sistema immunitario attiverà la sua risposta contro il virus producendo anticorpi contro di esso. COVAXIN® (BBV152) prodotto da Bharat Biotech, Hyderabad, India e CoronaVac noto anche come sinovac® sviluppato da Sinovac Biotech, Pechino, Cina, ha utilizzato l'approccio del virus inattivato per sviluppare il vaccino [17]. Il vettore virale non replicante è anche una tecnica adottata dalle aziende per la produzione di vaccini. L'adenovirus (Ads) è un vettore virale ampiamente utilizzato che ha un genoma a doppio filamento che funge da agente eziologico del comune raffreddore. CanSino Biologics Tianjin, Cina, ha sviluppato Ad5-nCoV (Convidecia®) che codifica l'intera lunghezza della proteina S del virus SARS-CoV-2. Il vettore virale non possiede proprietà di replicazione e quindi non causa vere e proprie malattie. Una volta entrato nel corpo, il DNA virale si presenta sulle cellule che presentano l'antigene e contro di esso viene generata una risposta immunitaria. Oxford/Astrazeneca ha utilizzato l'adenovirus dello scimpanzé (ChAdOx1) che possiede il potenziale per ridurre al minimo l'interazione con gli anticorpi prevalenti contro l'adenovirus. Il vaccino si chiama AZD122 (Vaxzevria™). L'Istituto di ricerca Gamaleya di Mosca, Russia, ha sviluppato il vaccino Sputnik V™, anch'esso un vettore virale avente un sierotipo Ad26 umano ricombinante. Il vaccino Janssen è stato prodotto da Johnson and Johnson, New Jersey, USA, utilizzando lo stesso approccio [18].

L’mRNA è anche considerato un nuovo approccio alla formulazione di un vaccino. I vaccini a mRNA sono nuovi per il pubblico, ma gli scienziati li studiano da molto tempo. Questi vaccini mRNA sono sintetizzati dal modello di DNA che codifica per la proteina spike e vengono imballati nel trasportatore a base di lipoproteine ​​per accelerare l’ingresso dell’mRNA all’interno del corpo e prevenirne la degradazione [19]. Quando il vaccino viene somministrato per via intramuscolare, viene iniettato nei tessuti più profondi e le molecole di mRNA entreranno all’interno della cellula facilitando il processo di traduzione [20]. Entrando nel corpo, l'mRNA verrà riconosciuto come antigene e verrà attivata una risposta immunitaria umorale che stimolerà le cellule B a svilupparsi nelle cellule B della memoria. Quindi sull'esposizione secondaria all'antigene; le cellule B della memoria neutralizzeranno e bloccheranno gli antigeni [21]. La FDA ha approvato vaccini basati su mRNA, uno dei quali è BNT162b2 (Comirnaty®) di Pfizer-BioNTech, New York, NY, USA e un altro è Moderna™, Cambridge, MA, USA mRNA-1273 noto anche come Spikevax. La FDA ha approvato l'mRNA-1273 per l'autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) per l'uso in persone di età pari o superiore a 18 anni. L'attuale revisione fornirà informazioni dettagliate sulla vaccinologia e fatti su COVID-19, sullo sviluppo di vaccini basati su mRNA, su come funzionano i vaccini mRNA, sulla formulazione e sugli ingredienti utilizzati, sulla sicurezza e sull'efficacia e sulle sfide normative per i vaccini.

Figura 1. Diversi tipi di vaccino per l'infezione da COVID-19. (Creato con BioRender.com accessibile il 31 dicembre 2022)

2. Vaccinazione e fatti sul COVID-19

Nel dicembre 2019 è stato segnalato in Cina un gruppo di individui affetti da disturbi polmonari per un motivo non identificato. Il Centro cinese per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) ha quindi indagato sull'incertezza nei casi correlati alla polmonite e sulla loro origine raccogliendo campioni dal corpo del paziente che sono stati rilevati utilizzando la reazione a catena della polimerasi in tempo reale [22]. Successivamente, la causa del disturbo polmonare divenne nota e si scoprì che era causata da un coronavirus, che fu successivamente denominato SARS-CoV-2 (sindrome respiratoria acuta grave) o COVID-19. Da allora, si è trasformata in una pandemia globale. Appartiene al gruppo dei -coronavirus. Strutturalmente è un virus avvolto, non segmentato, appartenente al sottogenere Sarbecovirus e alla sottofamiglia Orthocoronavirinae. Il materiale genomico presente nella sua struttura è la sequenza di RNA a senso positivo a filamento singolo [23]. Si trovano principalmente negli ospiti di uccelli e mammiferi. La struttura genomica del coronavirus è stata rappresentata nella Figura 2, che rappresenta che la struttura virale possiede proteine ​​​​spike, aventi subunità, S1 e S2, sulla membrana esterna. Il genoma virale dell'RNA è incapsulato all'interno della membrana insieme al nucleocapside. Pertanto, possiamo dire che esistono quattro proteine ​​strutturali, vale a dire la proteina spike (S), la proteina nucleocapside (N), la proteina di membrana (M) e la proteina dell'involucro (E) [24]. Oltre a questa sono presenti anche le proteine ​​non strutturali (Nsp) che sono sedici in totale. Le proteine ​​​​spike sono i principali siti di legame dei recettori, dove le proteine ​​possono interagire con i recettori presenti nel corpo [25]. La subunità S1 include il dominio di legame del recettore (RBD), in cui l'enzima II di conversione dell'angiotensina si lega alla proteina spike. Consiste anche nel dominio N-terminale (NDT). La subunità S2 possiede le proteine ​​di fusione (FP) e le proteine ​​transmembrana (TM) [26]. All'ingresso del virus nelle cellule ospiti, si verifica la fusione e la rimozione del rivestimento della membrana virale, seguita dalla trascrizione e traduzione dell'mRNA, che è essenziale per la formazione dell'assemblaggio virale, che poi espelle dall'ospite tramite esocitosi per infettare altre cellule. L’ingresso di particelle virali nelle altre cellule del corpo porta alla stimolazione della risposta immunitaria e alla generazione di anticorpi [27].

Figura 2. Struttura genomica del coronavirus. (Creato con BioRender.com accessibile il 31 dicembre 2022).

A livello globale, le vaccinazioni sono state ampiamente utilizzate e sono efficaci nel ridurre i tassi di mortalità. Sulla base di solide basi scientifiche e conoscenze, la valutazione della sicurezza e dell’efficacia dei vaccini e la loro diffusione possono essere migliorate [28]. I vaccini si sono evoluti dai vaccini tradizionali come i vaccini vivi attenuati o uccisi ai vaccini a subunità e, infine, alle strategie di immunizzazione prime-boost omologhe o eterologhe [29]. Diverse strategie vaccinali sono state illustrate nella Figura 3. Nell’antichità, i vaccini vivi attenuati hanno dimostrato di essere un salvatore contro vari virus patogeni e sono considerati sicuri contro milioni di popolazioni, ma sono spesso trascurati. Molti vaccini, compresi quelli MPR (morbillo, parotite, rosolia) e varicella, sono vaccini vivi attenuati [25,30]. Le forme indebolite del virus possono essere ottenute mediante esposizione a condizioni avverse o mediante modificazioni genetiche. Questo tipo di vaccino, in particolare il vaccino antipolio orale (OPV), può essere somministrato tramite vie non invasive. Al contrario, i vaccini uccisi, che sono le versioni inattivate dei virus, hanno un’applicazione limitata in termini di risposta immunologica, ma il vaccino indiano attualmente utilizzato, COVAXIN®, prodotto da Bharat Biotech International Limited, Hyderabad, Telangana, India, utilizza la versione inattivata del virus. il virus nella sua formulazione vaccinale [31]. Il virus inattivato è sufficientemente capace da mantenere la sua conformità epitome che aiuta a modulare la risposta immunitaria umorale [32].

Figura 3. Interazione dei vaccini con le cellule ospiti e le particelle virali. (Creato con BioRender.com accessibile il 31 dicembre 2022)

Le tecnologie recenti come i vaccini basati su mRNA o i vaccini basati su vettori ne sfruttano al massimo la sicurezza e l’efficacia dei vaccini COVID-19 [33]. I vaccini basati su vettori sono anche noti come vaccinazione eterologa prime-boost, che aiuta a indurre risposte immunitarie sia cellulari che umorali, mentre i vaccini a subunità vive provocano solo una risposta umorale [34-39]. Secondo uno studio, un aumento di 5-10 volte della risposta immunitaria mediata dalle cellule T nel caso di un vaccino eterologo basato su vettori rispetto alla stessa formulazione, preparata utilizzando un approccio omologo [40]. Pertanto, i vaccini basati su vettori, vale a dire quelli a DNA e RNA, sono più preferiti rispetto a quelli basati su subunità, spesso considerati più robusti rispetto ai vaccini a RNA ed efficaci poiché codificano la proteina “spike” della struttura del virus. Nel caso del virus Chikungunya, la strategia di coimmunizzazione utilizzando DNA e particelle simili al virus ha generato una migliore risposta immunitaria negli studi sugli animali [41]. A volte, i vaccini a DNA richiedono sistemi di somministrazione specializzati come elettroforesi, array di microaghi e sistemi basati su vettori come i liposomi per migliorare la permeabilità. Le microsfere a base di acido polilattico-co-glicolico sono state formulate per la somministrazione del vaccino a DNA dell'HIV-1 attraverso la via intramuscolare [42]. Tuttavia, i vaccini a DNA generano una scarsa risposta immunitaria e spesso richiedono un altro dosaggio. Questo può essere superato mediante l’uso di vaccini basati su mRNA [25,43].

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3. Sviluppo di vaccini basati su mRNA

In precedenza, per la formulazione del vaccino venivano utilizzate diverse forme di RNA, inclusi mRNA trascritto in vitro, siRNA (RNA a piccola interferenza), aptameri basati su RNA, riboswitch, molecole antisenso e, successivamente, mRNA. La conoscenza dell'acido ribonucleico messaggero, cioè dell'mRNA, deriva dalla sua creazione fondamentale ed economica, dal suo movimento transitorio e dalla lenta degradazione nelle cellule bersaglio, e dai suoi vantaggi in termini di sicurezza rispetto alla terapia del DNA poiché non coordina il genoma umano, inibendo l'inserzione mutagenesi ed è prontamente accessibile per l'interpretazione in proteine ​​nel citoplasma cellulare [44]. All’inizio degli anni ’90, i ricercatori hanno lavorato intensamente per riuscire nello sviluppo di vaccini basati su mRNA. Sono stati effettuati vari esperimenti in vitro ed i risultati hanno evidenziato una successiva produzione delle proteine ​​desiderate; pertanto, si è concluso che, poiché l'mRNA è sufficientemente capace di produrre proteine, può essere un probabile regime terapeutico per trattare la malattia [45]. Secondo Martinon et al., il vaccino mRNA a base di nucleoproteine ​​per il trattamento dell'influenza è stato sintetizzato mediante trascrizione in vitro ed è stato incorporato nelle vescicole liposomiali. I risultati hanno dimostrato l’induzione di cellule T e anticorpi citotossici, in vivo [46]. Da allora, c’è stato un progressivo sviluppo nell’uso dell’mRNA come strumento terapeutico grazie alla sua significativa efficacia, facile scalabilità e rapporto costo-efficacia, che è un requisito primario per il trattamento di malattie altamente contagiose e per la terapia del cancro. Recenti studi di ricerca hanno rivelato che le terapie basate sull’mRNA proteggevano significativamente i topi dai sintomi della Chikungunya e mantenevano livelli desiderabili di anticorpi dopo due dosi [47]. I vaccini a base di RNA prendono di mira le cellule immunitarie del corpo alterandone le funzioni, prendendo di mira i ribosomi per la traduzione, generando così una risposta immunitaria [19].

Le immunizzazioni basate su mRNA comprendono mRNA a filamento singolo, che codifica l'antigene desiderato. Possono essere veicolati come mRNA nudo o incapsulati in sistemi di trasporto idonei per facilitarne il rilascio nelle cellule. Una volta che l'mRNA entra nella cellula, viene tradotto in strutture a base proteica dai meccanismi naturali della cellula. Viene ulteriormente sottoposto a modifiche post-traduzionali per ottenere una proteina di interesse e genera una risposta immunitaria come determinato dai peptidi segnale [44,48]. I vaccini basati su mRNA devono affrontare almeno due ostacoli: la degradazione nucleare quando iniettati negli animali e l’immunogenicità innata simile a quella dell’antigene [49]. Per superare questo problema, la pseudo-uridina (Ψ) è una nota modificazione dell'RNA. Ψ sostituisce l'uridina con l'mRNA trascritto in vitro (IVT), che è un nucleotide altamente diffuso e presente in natura in tutte le cellule con RNA. La vaccinazione contro COVID-19, prodotta sia da Moderna che da Pfizer-BioNTech, consiste in una nuova Ψ modificata con efficacia fino al 90% contro i sintomi [50]. In un vaccino sviluppato da CureVac NV mancava l’mRNA Ψ-modificato e gli studi clinici hanno confermato l’efficacia solo del 48% [51].

Durante il processo di traduzione, esistono principalmente due diverse categorie di vaccini mRNA, vale a dire mRNA non amplificante (NMR) e mRNA autoamplificante (SMR). Il meccanismo di funzionamento dell'mRNA non amplificante e dell'mRNA autoamplificante è spiegato nella Figura 4. Strutturalmente, come mostrato nella Figura 5, entrambe le strutture possiedono una CAP, 50 e 30 regioni non tradotte (UTR), una cornice di apertura (ORF), e una coda di cavallo in comune [52,53].

Figura 4. Categorie di mRNA. (Creato con BioRender.com accessibile il 31 dicembre 2022)

Oltre a ciò, l'SMR possiede una replicasi come segmento che aiuta nell'amplificazione dell'mRNA a livello intracellulare. Inoltre, i segmenti vengono tradotti dai ribosomi per produrre proteine ​​di interesse. Le proteine ​​secrete portano alla generazione della risposta immunitaria [54]. Gli SMR sono comparativamente più grandi degli NMR e delle molecole anioniche. Recenti studi sull'RNA autoreplicante hanno mostrato una migliore espressione del sottogenoma in vitro delle proteine ​​non strutturali del replicone dell'encefalite equina venezuelana (VEE) quando sono state osservate diverse mutazioni. Uno studio clinico simile è stato condotto per colpire la glicoproteina della rabbia utilizzando l’RNA autoamplificante del virus VEE-Sindbis formulato in nano-emulsioni ed è attualmente in corso [55]. I principali attributi critici di qualità (CQA) che definiscono l'efficacia delle terapie a base di mRNA sono riepilogati nella Tabella 1 [54].

Figura 5. Ottimizzazione della sequenza di mRNA. (Adattato da [56] con diritti e autorizzazioni).

Tabella 1. CQA per i vaccini mRNA.

La produzione dell'mRNA è un processo in due fasi, che include produzione e purificazione. Nei sistemi di produzione di mRNA non sono presenti impurità poiché non contengono materie prime di origine animale o cellulare, la produzione è relativamente più sicura [65]. La produzione della sequenza di mRNA può essere un processo enzimatico a fase singola o un processo enzimatico a due fasi. Un analogo di tappatura viene utilizzato nel caso di un processo di produzione in una sola fase, generalmente utilizzato su scala di laboratorio. Il processo viene quindi realizzato mediante purificazione, che comporta la separazione utilizzando tecniche cromatografiche come mostrato nella Figura 6. La reazione enzimatica in due fasi per la produzione di mRNA comprende la trascrizione in vitro dello stampo di DNA per formare una sequenza di RNA polimerasi [66]. Lo stampo di mRNA così formato può essere tappato utilizzando l'enzima di tappatura del vaccino e il donatore di metile. La produzione di mRNA è relativamente elevata e su scala industriale è difficile ottenere la riproducibilità [67].

Figura 6. Il processo di produzione della sequenza di mRNA. (Creato con BioRender.com accessibile il 1 gennaio 2023)

4. Come funzionano i vaccini a mRNA?

L'mRNA è una molecola instabile carica negativamente incapsulata in nanoparticelle lipidiche. Attraverso l'endocitosi, queste nanoparticelle lipidiche entrano nelle cellule. Una volta entrati nel citoplasma, questi endosomi vengono immediatamente diretti ai lisosomi per la degradazione. Gli studi rivelano che i lipidi ionizzabili svolgono un ruolo importante nella fuga degli endosomi e nel rilascio dell'mRNA. Il gruppo di testa dei lipidi viene protonato nell'ambiente acido degli endosomi e questo stato cationico viene successivamente attaccato alla testa anionica del fosfolipide nella membrana endosomale. La coda idrofobica del lipide cationico e del fosfolipide si estende quindi, distruggendo la struttura del doppio strato fosfolipidico e consentendo all'mRNA di fuoriuscire nel compartimento citoplasmatico. I ribosomi trasformano l'mRNA in proteine ​​quando viene rilasciato. Questa proteina può attivare una risposta immunitaria in due modi: (1) Il proteasoma degrada queste proteine ​​in peptidi, che vengono poi presentati come antigene sulla superficie cellulare dalle molecole MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) di classe I, che si legano al TCR (T recettore cellulare) per attivare le cellule T CD8+, che uccidono le cellule infette; la proteina stessa può attivare una risposta immunitaria in due modi. (2) Le proteine ​​secrete extracellularmente vengono fagocitate dalle APC (cellule presentanti l'antigene) e degradate in peptidi che vengono presentati sulla superficie cellulare dall'MHC di classe II e riconosciuti dalle cellule T CD4+, che secernono citochine per produrre una cellula risposta immunitaria umorale e coattivare le cellule B per produrre una risposta immunitaria umorale, come mostrato nella Figura 7. Inoltre, i vaccini mRNA hanno rilasciato RNA a doppio e singolo filamento che si lega al TLR (recettore Toll-like) nell'endosoma, determinando la risposta immunitaria umorale. stimolazione di numerosi geni stimolati dall'IFN-1 (interferone di tipo I), attivando quindi le risposte immunitarie innate antivirali.

Figura 7. Il meccanismo attraverso il quale il vaccino mRNA suscita l'immunità nell'ospite. (Creato con BioRender.com accessibile il 1 gennaio 2023)

5. Aspetti formulativi dei vaccini a base di mRNA

Una volta iniettato, l'mRNA trascritto esprimerà le proteine ​​all'interno del corpo. Si osserva una risposta immunologica a causa della proteina espressa dall'mRNA. Questo processo è prevalentemente la base dello sviluppo del vaccino a mRNA [68].

5.1. Modello del DNA

L'identificazione dell'antigene del patogeno bersaglio è il passo più importante. Lo sviluppo dell'immunizzazione tramite mRNA richiede l'aggiunta dell'antigene codificato in uno stampo di DNA, che aiuterà nella traduzione dell'mRNA in vitro. L'antigene specifico verrà prodotto in vivo mediante la trascrizione dell'mRNA trascritto, che raggiungerà esclusivamente il citoplasma; questo aiuterà a suscitare una risposta immunitaria. Il DNA plasmidico (pDNA) contiene una sequenza promotrice con forte affinità per una RNA polimerasi DNA-dipendente, come T7, SP6 o T3, nonché la sequenza appropriata per il costrutto dell'mRNA. L'enzima passerà lungo il modello, estendendo la trascrizione dell'RNA fino a raggiungere l'estremità del modello [69].

5.2. Enzima di tappatura

Per una traduzione efficiente dell'mRNA dal modello di DNA, è molto importante la copertura all'estremità 50 dell'mRNA. Inoltre, è necessario un limite di 50 nell'mRNA maturo per la protezione dell'mRNA dalla degradazione, dall'espressione genica e dal reclutamento dei ribosomi. Un ponte 5 0 -50 -trifosfato collega le 50 capsule dell'mRNA eucariotico alla 7-metilguanosina (m7G) (m7GpppN). Una nuova tecnica co-trascrizionale che utilizzava un kit clean cap per aggiungere con precisione una struttura naturale da 50 cap1 al sito iniziale durante le reazioni IVT ha reso la generazione di 50 mRNA tappati da parte della polimerasi T7 un metodo di tappatura comunemente usato con buona traduzione e reattogenicità minima. Nei vaccini mRNA COVID-19 BNT162b1, i tappi 5 0 sono stati aggiunti utilizzando il metodo del tappo pulito [70]. L'mRNA trascritto con analogo del cappuccio ha una coda poli 1 e una coda 30 (poli-A) è presente alle 30 estremità dell'mRNA eucariotico. Questa coda poli A svolge funzioni di trasporto, traduzione e stabilità dell'mRNA. La coda da 30 poli A e il cappuccio da 50 creeranno una struttura stabile a circuito chiuso con il complesso eIF4F per l'inizio del processo di traduzione. A causa dei suoi 120 nucleotidi (nt) nella coda di 30 poli(A), il vaccino mRNA BioNTech ha stabilità ed efficienza di traduzione superiori [71].

5.3. Substrati nucleotidici trifosfati (NTP)

Quando i plasmidi del DNA sono integrati con la polimerasi T7 e i nucleotidi trifosfati, l'mRNA viene tradotto in modo più efficiente e vengono prodotti più rendimenti. Dopo la somministrazione del vaccino, una preoccupazione sollevata è l’immunogenicità. All'attivazione della segnalazione a valle, il corpo riconoscerà e risponderà agli RNA virali. Questo riconoscimento dell'RNA a singolo e doppio filamento avviene da parte dei recettori endosomali come i recettori Toll-like (TLR3), TLR7 e TLR8. L'RNA a doppio filamento e modificato con 50 -trifosfato è riconosciuto dal gene I inducibile dall'acido retinoico del recettore citosolico (RIG-1) e dalla proteina 5 associata alla differenziazione del melanoma (MDA-5). Sono state segnalate reazioni allergiche e shock anafilattico quando il sistema immunitario del corpo è stato attivato in modo incontrollato. Questa sovrastimolazione del sistema immunitario a livello molecolare limiterà la traduzione delle proteine, l’espressione degli antigeni e l’efficacia del vaccino. Questa limitazione può essere superata mediante modifiche delle basi azotate. La N1-metil pseudouridina, una base azotata modificata, aumenterà la produzione di proteine ​​e diminuirà l'attivazione di TLR3. I nucleotidi modificati tramite RIG-1 non solo influenzano l'interazione proteina-RNA ma diminuiscono anche la capacità degli mRNA di diffondere segnali immunologici. L'efficienza di traduzione dell'mRNA in proteine ​​è migliorata grazie alla N1-metilpseudouridina. L’inizio della traduzione che avviene rapidamente aumenterà in modo coordinato l’emivita dell’mRNA [50].

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5.4. Componenti di nanoparticelle lipidiche per la consegna di mRNA

Rispetto a tutti gli altri vaccini, i vaccini a mRNA vengono sviluppati in tempi relativamente brevi e sono più efficaci. Tuttavia, la sfida più grande nella produzione di vaccini a mRNA è la loro scarsa stabilità. La stabilità e la capacità del vaccino di trattare l'infezione da COVID-19 sono ridotte perché il vaccino viene rapidamente scomposto dalle ribonucleasi dopo la somministrazione, producendo componenti scomposti che vengono eliminati attraverso i reni. Per affrontare questa sfida, l’mRNA può essere formulato con nanoparticelle lipidiche (LNP). Il vaccino mRNA-LNP proteggerà l’mRNA dalla degradazione prematura e faciliterà il rilascio citoplasmatico alle cellule presentanti l’antigene [72]. I lipidi sono agenti perfetti per trasportare l'mRNA nel sito citosolico, poiché la loro fusione è compatibile con le membrane cellulari lipidiche; portando al rilascio mirato ed efficace dell'mRNA. Gli LNP sono particelle nanometriche con un diametro inferiore a un micron che contengono due o più lipidi in proporzioni variabili. Gli LNP differiscono dai liposomi per la presenza di componenti lipidici nel nucleo come una miscela discontinua. Gli LNP sottoposti a formulazione hanno una struttura vescicolare multilamellare, un guscio centrale omogeneo e un nucleo nanostrutturato [73]. All'interno del nucleo degli LNP è presente acqua, che espone l'mRNA all'interazione con un mezzo acquoso. Come mostrato nella Figura 8, l'mRNA si trova all'interno degli LNP, che lo protegge dall'ambiente esterno. La composizione più comune che costituisce i sistemi LNP dell'mRNA è un lipide cationico/ionizzabile, un fosfolipide ("lipide aiutante"), colesterolo e un polietilenglicole (PEG). Le caratteristiche fisico-chimiche all'interno del sistema di rilascio dell'LNP, come l'efficacia dell'incapsulamento, la carica superficiale esterna, la dimensione delle particelle e la forma, possono essere facilmente modificate regolando la composizione lipidica. I rapporti dei componenti vengono regolati in base al tessuto bersaglio desiderato [74].

Figura 8. Struttura delle nanoparticelle lipidiche utilizzate per un efficiente rilascio di mRNA. (Creato con BioRender.com accessibile il 1 gennaio 2023)

5.4.1. I lipidi cationici

Con un gruppo amminico che conferisce una carica netta positiva, una catena idrofobica e un gruppo di collegamento che consente l'attacco della porzione idrofila alla catena idrofobica, i lipidi cationici mostrano la proprietà anfifilica. Hanno una carica positiva permanente sulla testa polare, che aiuta nell'interazione con gli acidi nucleici caricati negativamente, migliorando l'efficienza dell'intrappolamento. Anche la fuga endosomiale del sistema LNP e l’assorbimento cellulare aumentano a causa della carica positiva netta. Per la somministrazione di mRNA sono stati studiati lipidi cationici, lipidi ionizzabili e altri tipi di lipidi. Rispetto ai lipidi cationici non ionizzabili, i lipidi ionizzabili, che sono caricati positivamente a pH basso e a pH fisiologico rimangono neutri, sono comparativamente meno tossici a causa delle variazioni di pH. All'interno della membrana cellulare hanno carica positiva e nel flusso sanguigno possiedono proprietà non cariche. Il vaccino BNT162b2 comprende il lipide cationico ALC-0315 mentre l'mRNA-1273 comprende SM-102; a pH basso, entrambi i lipidi vengono protonati e formeranno facilmente un complesso con l'mRNA. Un flusso di mRNA in acqua viene combinato con una miscela lipidica in etanolo utilizzando un dispositivo microfluidico. Per intrappolare l’mRNA caricato negativamente, i componenti di questi due flussi si combinano rapidamente per generare nanoparticelle [75]. Per il vaccino BNT162b2 i rapporti molari del lipide cationico: lipide PEG: colesterolo: DSPC è (46,3:1,6:42,7:9,4) e per l'mRNA-1273 è (50:1,5:38,5:10). Le nanoparticelle hanno un diametro di 80-100 nm e per una nanoparticella lipidica sono presenti circa 100 molecole di mRNA [73].

5.4.2. I lipidi del glicole polietilenico (PEG).

Per la stabilità dei colloidi e la prevenzione del legame delle proteine ​​con le nanoparticelle vengono utilizzati lipidi di polietilenglicole. Conferiscono una circolazione sistemica più lunga riducendo al minimo la rimozione delle nanoparticelle. Gli LNP possono causare aggregazione fisica nella soluzione, che può aumentare la dimensione delle particelle degli LNP, e i lipidi PEG possono superare forse anche il problema del rilascio prematuro dell'mRNA incapsulato. Inoltre, anche la stabilità allo stoccaggio degli LNP sarà migliorata [76].

5.4.3. Colesterolo

Per la trasfezione delle cellule e per stabilizzare i LNP il colesterolo ha un ruolo vitale. Una temperatura di transizione più bassa si ottiene quando il contenuto di colesterolo aumenta negli LNP, questo aiuterà nel rilascio dell'mRNA dall'LNP e nella sua traslocazione attraverso la membrana endosomiale [77]. In uno studio condotto da Zhang et al., i liposomi modificati sono stati formulati utilizzando il peptide cationico DP7 modificato con colesterolo insieme al Dioleoil-3- trimetilammonio propano (DOTAP) come trasportatore per il rilascio dell'mRNA. I liposomi sono stati preparati mediante la tecnica dell'idratazione del film e quindi valutati per la loro efficienza di trasfezione. In vitro, gli studi di trasfezione hanno rivelato un aumento dell’efficienza della trasfezione con un aumento della concentrazione del peptide DP7. Oltre a ciò, studi antitumorali in vivo hanno dimostrato che il complesso aveva una migliore efficacia contro il tumore [78].

5.4.4. Altri eccipienti

I vaccini a mRNA sono composti da stabilizzanti, ad es. Trometamina, che tampona per mantenere un pH compreso tra 7 e 8, Sali: aiuta a bilanciare l'acidità nel corpo, Zucchero che aiuta le molecole a mantenere la loro forma durante il congelamento agendo come crioprotettore e mantiene la stabilità a lungo termine della formulazione di nanoparticelle lipidiche-mRNA [73]. Un riepilogo degli ingredienti chiave utilizzati nei vaccini a base di mRNA è fornito nelle Tabelle 2 e 3.

Tabella 2. Ingredienti chiave utilizzati nei vaccini a base di mRNA.

Tabella 3. Ingredienti della formulazione dei vaccini mRNA Pfizer e Moderna.

5.5. Altro sistema di consegna per mRNA

5.5.1. Nanoparticelle polimeriche

Le nanoparticelle polimeriche possono essere sintetizzate da polimeri sintetici o naturali come PLGA [poli (acido lattico-co-glicolico)], chitosano, PLA (acido polilattico), policaprolattone, gelatina e poli-alchil-cianoacrilati. Queste nanoparticelle polimeriche possono incapsulare composti e proteine ​​idrofobici e idrofili, di lunga durata; e può modificare la somministrazione di composti terapeutici. L'RNA può essere incapsulato in polimeri cationici autoassemblati con modificazione idrofobica [80,81].

5.5.2. Nanoemulsioni cationiche

Le nanoemulsioni cationiche si sono rivelate un veicolo efficace per il rilascio di acidi nucleici. I lipidi cationici presenti nelle nanoemulsioni sono importanti per i complessi con l'acido nucleico attraverso interazioni elettrostatiche e migliorano l'efficienza di trasfezione dell'acido nucleico e la sua stabilità. Gli studi rivelano che il sistema di rilascio di nanoemulsioni cationiche di mRNA migliora la risposta immunitaria reclutando cellule immunitarie e stimolando risposte cellulari agli anticorpi e ai primati T a dosi relativamente basse [80,82].

5.5.3. Nanoparticelle di silice

Le nanoparticelle di silice mesoporosa sono costituite da una matrice di silice amorfa con porosità ben disposta nell'intervallo mesoporoso. Queste nanoparticelle hanno ampie aree superficiali con grandi volumi di pori e la loro superficie può essere facilmente modificata da alcune porzioni caricate positivamente per trasportare efficacemente RNA caricato negativamente. Inoltre, è possibile un rilascio mirato di RNA attaccando ligandi specifici sulla superficie [81]. Secondo uno studio condotto da Adam et al., è stato formulato un vaccino nasale a base di microparticelle di silicio poroso modificato (mPSM) per il COVID-19. La formulazione ha portato ad un aumento delle cellule T helper (Th1) e delle risposte immunitarie e l'mPSM ha causato l'assorbimento degli antigeni attraverso la via nasale. È stato riscontrato che la carica virale era ridotta in modo significativo [83].

5.5.4. Nanomateriali di carbonio e oro

I nanotubi di carbonio, le nanoparticelle d'oro, l'ossido di nanografene e i punti quantici sono nanostrutture sintetizzate che hanno anche il potenziale per fornire RNA al sito target e proteggerlo dalla degradazione [81].

6. Sfide per la conservazione del vaccino

La stabilità e i requisiti di conservazione rappresentano la principale preoccupazione per i vaccini a mRNA. La stabilità dipende da fattori quali eccipienti, pH e temperatura. Il vaccino anti-COVID-19 di BioNTech/Pfizer deve essere conservato a -80 ◦C e ha una durata di conservazione fino a 6 mesi, mentre il vaccino anti-COVID-19 di Moderna deve essere conservato a -20 ◦C ◦C e ha la stessa durata di conservazione. Il vaccino BioNTech/Pfizer richiede l'imballaggio con ghiaccio secco durante il trasporto. La distribuzione di entrambi i vaccini nei paesi poveri del mondo è impegnativa, poiché i vaccini a mRNA devono essere conservati a temperature ultra fredde. Questi requisiti sono costosi e nelle regioni del mondo con risorse limitate, gli accordi sono difficili. Uno dei problemi è lo sviluppo di un vaccino a mRNA termostabile che sia clinicamente efficace e che possa essere conservato per un periodo più lungo senza incorrere in grandi costi di stoccaggio. Secondo le raccomandazioni di conservazione dell’EMA, i vaccini mRNA prodotti da Moderna e BioNTech sono stabili se congelati fino a 6 mesi a -25 ◦C, fino a 30 giorni a temperatura di frigorifero (4 ◦C) e fino a 6 ore a temperatura ambiente. 84].

7. Sicurezza ed efficacia dei vaccini a mRNA

7.1. Sicurezza dei vaccini a base di mRNA

È stata effettuata una valutazione degli esiti relativi alla sicurezza per i vaccini a mRNA. Sono stati condotti studi clinici in aperto di fase 1 con incremento della dose di mRNA-1273 su partecipanti di età compresa tra 18 e 70 anni o più [85]. Lo studio è stato condotto in due gruppi in cui i partecipanti di età compresa tra 18 e 55 anni hanno ricevuto la dose di vaccino di 250 µg e ai soggetti più anziani sono stati somministrati 25 µg o 100 µg della dose. Dopo la vaccinazione sono stati osservati eventi avversi locali e sistemici sollecitati, eventi avversi non richiesti, eventi avversi gravi e lo sviluppo di nuove condizioni mediche croniche. I risultati non hanno mostrato sviluppo di eventi avversi gravi. Le reazioni avverse più tipiche riportate sono state mal di testa, stanchezza, mialgia, brividi e dolore nel sito di iniezione. È stato dimostrato che i livelli di anticorpi neutralizzanti sono correlati alla difesa contro una varietà di virus negli esseri umani e alla difesa contro la SARS-CoV-2 negli animali. Il vaccino mRNA-1273 negli anziani ha prodotto alti livelli di anticorpi leganti e neutralizzanti e le tendenze tempo e dose-dipendenti erano simili alle risposte negli adulti più giovani. Le risposte dopo la seconda vaccinazione erano paragonabili a quelle osservate nei pazienti che si erano ripresi da COVID-19 e avevano donato siero convalescente, compresi alcuni che erano in condizioni critiche. I pazienti più anziani che hanno ricevuto la dose da 100 µg hanno mostrato risposte anticorpali e di cellule T più elevate rispetto a quelli che hanno ricevuto 25 µg e la risposta è stata identica alla reazione nei partecipanti di età compresa tra 18 e 55 anni che hanno ricevuto la dose da 100 µg. I pazienti di età superiore a 56 anni devono ricevere una seconda dose di vaccino per ottenere anticorpi neutralizzanti. Dopo aver ricevuto una dose di richiamo, i titoli anticorpali aumentano rapidamente. I risultati chiave sulla sicurezza dei vaccini Moderna e Pfizer osservati durante vari studi clinici sono stati elencati nella Tabella 4.

Tabella 4. Studi sulla sicurezza e sull’efficacia dei vaccini a mRNA negli studi clinici

Tabella 4. Continua

Dopo la seconda dose di vaccino, gli eventi di reattogenicità locale e sistemica sono aumentati in frequenza e sono stati principalmente di moderata gravità. L'incidenza dell'eritema è stata riscontrata in tre partecipanti ed è durata da 5 a 7 giorni. Eventi avversi sistemici sollecitati come febbre e affaticamento si sono verificati in modo prominente nel sottogruppo più anziano. Tutti questi risultati suggeriscono che gli eventi avversi richiesti o non richiesti erano da lievi a moderatamente gravi. Pertanto l'mRNA-1273 è stato ulteriormente testato per studi di fase 2/3 per valutare la sicurezza e l'efficacia in popolazioni più ampie [95]. Lo studio clinico di fase 3 era uno studio randomizzato, stratificato, in cieco per l'osservatore e controllato con placebo, che ha coinvolto 30.420 volontari di età pari o superiore a 18 anni, assegnati in modo casuale a ricevere un vaccino (0,5 mL con 100 µg di dose) o placebo. Per la valutazione della sicurezza sono state monitorate le reazioni locali per 7 giorni dopo l'immunizzazione, gli eventi avversi sistemici, le reazioni avverse impreviste dopo 28 giorni dalla somministrazione della dose e qualsiasi evento avverso significativo. Gli effetti avversi richiesti erano predominanti nell'mRNA- 1273 rispetto al gruppo placebo (84,2%, contro 19,8%). Alcuni degli eventi più osservati sono stati dolore nel sito di iniezione dopo la vaccinazione, eritema, dolorabilità e indurimento. Questi eventi si sono risolti entro 4-5 giorni dopo la vaccinazione. Dopo la seconda dose, il gruppo mRNA-1273 ha sollecitato eventi sistemici che sono diventati più gravi. La presenza di reazioni di ipersensibilità è stata riscontrata rispettivamente nell'1,5% e nell'1,1% dei partecipanti ai gruppi vaccino e placebo. Oltre a questi reclami, non sono stati sollevati problemi di sicurezza dopo la somministrazione del vaccino [106].

Una terza dose di vaccino era necessaria a causa del calo della protezione a seguito di due iniezioni di mRNA del SARS CoV-2 e dell'introduzione di varianti. Dopo aver somministrato una terza dose del vaccino mRNA a persone che avevano precedentemente ricevuto la serie primaria mRNA-1273 nello studio di Fase 1, sono state valutate la loro sicurezza iniziale e la loro immunogenicità. Uno studio trasversale condotto a Napoli (Italia) ha valutato la preparazione all'assunzione del vaccino anti-COVID-19. In questo gruppo, l'accettazione della dose di richiamo è stata quasi del 86%. Inoltre, le persone anziane in migliore salute dopo la serie principale di vaccini, coloro che vivevano con amici o familiari risultati positivi al COVID-19 e coloro che avevano ricevuto informazioni relative alla malattia dalle istituzioni pubbliche ufficiali erano disposti a ottenere il richiamo dose [107].

La vaccinazione bivalente conteneva 25 mcg di ciascun mRNA-1273 e mRNA-1273.351, mentre le formulazioni del vaccino di richiamo contenevano 100 mcg di mRNA-1273 e 50 mcg di mRNA-1273 .351, che codifica per la proteina spike della variante Beta. Una terza dose del vaccino mRNA ha mostrato adeguata reattogenicità e sicurezza. Rispetto alle risposte di picco dopo il secondo dosaggio, gli aumenti indotti dalla vaccinazione nei titoli anticorpali leganti e neutralizzanti le varianti D614G, Beta e Delta erano simili o maggiori. Si è notato che gli anticorpi neutralizzanti e leganti venivano ridotti costantemente. Tuttavia, il rilevamento degli anticorpi era presente a 10-11 mesi (prima della terza dose) nei partecipanti, indipendentemente dall'età e dalla dose iniziale della serie primaria (ad esempio, 25, 50, 100 e 250 µg). Dolore al sito di iniezione, stanchezza, mialgia e brividi sono stati gli effetti avversi più spesso riportati dopo la terza dose del vaccino mRNA e la frequenza di questi eventi era paragonabile tra i tre regimi vaccinali di richiamo (prototipo monovalente, variante monovalente e gruppi bivalenti). ). Con l'uso dei vaccini della variante Beta monovalente o bivalente, non è stato osservato alcun vantaggio o svantaggio specifico nelle risposte cellulari agli epitopi all'interno dei peptidi Beta-mutati. Tutti questi risultati supportano l'attuale suggerimento di utilizzare un prototipo monovalente di mRNA-1273 per fornire un'ampia protezione immunologica incrociata tra le varianti [95]. Secondo un sondaggio, la somministrazione eterologa di BNT162b2 (BNT) nei partecipanti vaccinati con ChAdOx1 (ChAd) (ChAd/BNT) ha dimostrato un'immunogenicità non inferiore alla somministrazione di BNT omologa (sia il prime che il booster erano vaccini BNT, BNT/BNT), con reattogenicità tollerabile e maggiori risposte delle cellule T. Rispetto alla vaccinazione omologa ChA dOX1 (ChAd/ChAd), la vaccinazione eterologa ChAd/BNT ha suscitato una maggiore immunogenicità (ChAd/BNT vs. ChAd/ChAd, rapporto dei titoli anticorpali: 9,2) [108].

Uno studio di fase 1 per BNT162b2 è stato condotto su 76 partecipanti; sono stati randomizzati a ricevere dosi di vaccino da 10 µg, 30 µg e 100 µg e all'altro gruppo è stato somministrato il placebo. Il 58,3% dei soggetti che hanno ricevuto 10 µg e il 100% dei soggetti che hanno ricevuto 30 µg e 100 µg hanno manifestato dolore di reazione locale sollecitata nel sito di iniezione dopo la prima dose. La gravità di tutte le reazioni locali è stata da lieve a moderata. Affaticamento e mal di testa nel BNT162b2 erano eventi sistemici comuni. Inoltre sono stati osservati anche brividi, dolori muscolari e dolori articolari. Con l’aumento delle dosi, gli eventi sistemici sono stati segnalati maggiormente dopo la somministrazione della seconda dose. Un totale del 50,0% dei partecipanti che hanno ricevuto 10 o 30 g di BNT162b1, il 58,3% delle persone che hanno ricevuto 100 g di BNT162b1 e l'11,1% dei destinatari del placebo hanno riferito di aver riscontrato eventi avversi. Non sono stati segnalati eventi avversi gravi [109].

In uno studio clinico sul vaccino Pfizer/BioNTech (BNT162b2), uno studio multinazionale, controllato con placebo, in cieco per l'osservatore, randomizzato e cardine sull'efficacia, sono stati assegnati in modo casuale 43.548 partecipanti di età pari o superiore a 16 anni. Un totale di 21.720 volontari hanno ricevuto 30 µg per dose di BNT162b2 e 21.728 con placebo. Per determinare il profilo di sicurezza di BNT162b2 sono state valutate caratteristiche come dolore nel sito di iniezione, che è a breve termine, da lieve a moderato in caso di gravità, affaticamento e mal di testa. A tutti i partecipanti sono state somministrate due iniezioni di BNT162b2 o di un placebo, secondo la randomizzazione a 21 giorni di distanza, nel muscolo deltoide [98]. Le reazioni locali in coloro che hanno ricevuto il vaccino BNT162b2 sono state segnalate maggiormente rispetto al gruppo placebo. Il dolore da lieve a moderato nel sito di iniezione è stato il disturbo più comune registrato tra i destinatari di BNT162b2 entro una settimana. Dolore severo è stato segnalato in meno dell’1% della popolazione. Il dolore è stato osservato meno nei partecipanti più anziani rispetto a quelli più giovani. Il rossore o il gonfiore sono stati osservati meno. Dopo la somministrazione della seconda dose, le reazioni locali sono state meno segnalate [110].

I partecipanti più giovani che hanno ricevuto il vaccino hanno riscontrato più eventi sistemici rispetto ai destinatari più anziani. Affaticamento e mal di testa (59% e 52%) sono stati gli eventi più comunemente riportati, e i soggetti molto meno vaccinati (<2%) experienced any severe systemic events. After the second dose of the vaccine, 16% of younger groups and 11% of older age reported fever (temperature ≥ 38 ◦C), which increased the use of antipyretic or painkillers. However, post-delivery of the first dose cases of fever were reported very less [110]. Lymphadenopathy was noticed as an adverse event in BNT162b2 receivers in comparison to the placebo group. A shoulder injury related to the vaccination, right axillary lymphadenopathy, paroxysmal ventricular arrhythmia, and right leg paresthesia were among the unfavorable events recorded among BNT162b2 recipients [98]. Rare adverse effects observed are Bell's palsy, acute myocardial infarction, cerebral venous sinus thrombosis, pulmonary embolism, Guillain–Barré syndrome, lymphadenopathy, herpes zoster reactivation, stroke, neurological complications, and thrombosis with thrombocytopenia syndrome, and autoimmunity (e.g., autoimmune peripheral neuropathies and autoimmune hepatitis). Among these certain adverse effects such as anaphylaxis, myocarditis, and appendicitis were common in younger people while Guillain–Barré syndrome and myocardial infarction increased with age. These vaccine-associated adverse effects are less frequent than the additional serious adverse effects that occur after severe COVID-19. A recent study reveals the risk of neurological complications in COVID-19 vaccine receivers. The molecular foundation of these adverse effects is unknown. We hypothesize that, since most of these are also apparent in severe COVID-19, it may be associated with acute inflammation produced by both the vaccine and the virus, as well as in the common SARS-CoV-2 S protein. In the BNT162b2 and mRNA-1273 vaccines encoded antigen (S protein) is stabilized it is therefore probable that, if entering the circulation and systemically distributed throughout the body, it can contribute to these adverse effects in susceptible individuals [111].

7.2. Efficacia dei vaccini a mRNA

Per la valutazione dell'efficacia dell'mRNA-1273, gli endpoint primari del vaccino erano l'efficacia nel prevenire l'infezione sintomatica da COVID-19 dopo 14 giorni dalla seconda dose di vaccino. Come endpoint secondario, è stata utilizzata la prevenzione dell'infezione grave da COVID-19 con sintomi persistenti. I risultati dopo la vaccinazione mostrano che erano presenti 11 casi di COVID-19 nel gruppo vaccinato e 185 casi nel gruppo placebo, indicando un'efficacia del 94,1% del vaccino mRNA-1273 per il trattamento del COVID sintomatico-19 . Per gli endpoint secondari di efficacia, è stata eseguita la valutazione della prevenzione del COVID grave-19. I risultati hanno indicato un’efficacia del vaccino del 100% poiché 30 partecipanti con infezione virale appartenevano al gruppo placebo. Uno studio condotto in Qatar ha dimostrato l'efficacia del vaccino (VE) dell'mRNA-1273 95,7% contro l'infezione da COVID-19 grave, critica o fatale. Dopo un periodo pari o superiore a 14 giorni dalla prima dose, l’efficacia è stata dell’88,1% contro la variante B.1.1.7 (alfa) ed è stata del 100% dopo la seconda dose. Il 61,3% e il 96,4% di VE sono stati segnalati dopo la prima e la seconda dose di immunizzazione contro il ceppo B.1.351 (beta). Pertanto, il vaccino ha un discreto successo sia contro il ceppo, sia sintomatico che asintomatico, sia contro qualsiasi ricovero e morte per COVID-19, anche dopo una singola dose [112].

L'efficacia del vaccino BNT162b2 (VE) contro il COVID confermato-19 con insorgenza di almeno 7 giorni dopo la seconda dose in soggetti esenti da evidenza virologica o sierologica di infezione da SARS-CoV-2 è stata la prima valutazione primaria punto finale. Il secondo endpoint primario ha misurato l'efficacia nei partecipanti con e senza evidenza di precedente infezione e la prevenzione dell'infezione grave da COVID-19. In una ricerca condotta su un totale di 36.523 persone, nel gruppo vaccinato si sono verificati 8 casi di COVID-19 con inizio 7 giorni dopo la seconda dose, rispetto a 162 casi nel gruppo placebo. Ciò dimostra il 95% dell’efficacia del vaccino. Tuttavia, il VE osservato contro la malattia virale è stato del 52% tra la prima e la seconda dose, ed è stato del 91% nei primi 7 giorni successivi alla dose 2, raggiungendo un’efficacia completa contro la malattia con un’insorgenza almeno 7 giorni dopo la dose 2. Solo 1 dei 10 casi gravi di COVID-19 osservati dopo la prima dose si è verificato nel gruppo che ha ricevuto la vaccinazione. Questa osservazione è in linea con l'eccellente efficacia complessiva contro tutti i pazienti affetti da COVID-19. Si sono verificati due casi di infezione nei soggetti vaccinati tra i pazienti ipertesi e 44 casi nel gruppo placebo. Questo caso riporta il 94,6% dell’efficacia del vaccino nei pazienti ipertesi. Pertanto il vaccino BNT162b2 soddisfa gli endpoint di efficacia sia primari che secondari nei partecipanti vaccinati [113]. A parte l’infezione da SARS-CoV-2, con una singola dose del vaccino BNT162b2, l’efficacia vaccinale prevista contro la malattia sintomatica con la variante delta (B.1.617.2) era di circa il 36%. Dopo due dosi, il VE era pari a circa l’88% [114].

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

8. Sfide normative

La scienza della regolamentazione è il fondamento su cui vengono prese le decisioni normative. Il suo obiettivo primario è sviluppare nuovi metodi, strumenti e standard per valutare la sicurezza, l’efficacia, la qualità e le prestazioni dei prodotti regolamentati in tutte le fasi del loro ciclo di vita [115]. I vaccini a mRNA devono affrontare lo stesso tipo di ostacoli normativi di qualsiasi altro tipo di vaccino, inclusa la necessità di dimostrare la sicurezza e l’efficacia negli studi preclinici, nelle sperimentazioni cliniche e nella sorveglianza post-marketing, oltre a mantenere uno standard elevato per la materie prime utilizzate nella produzione e consistenza della fabbricazione. I test sui vaccini si basano fortemente sull’affidabilità e sulla riproducibilità di enzimi, nucleotidi e modelli di DNA lineare [116]. I componenti grezzi, come i lipidi, dovrebbero essere rigorosamente regolamentati e la loro purezza dovrebbe essere dimostrata. Durante la creazione del modello di DNA lineare è necessario seguire le attuali buone pratiche di produzione (cGMP). Per garantire che la sostanza farmaceutica sia della massima qualità, è essenziale tenere d'occhio la percentuale di mRNA tappato e poliadenilato, il numero di trascrizioni brevi e la presenza di RNA a doppio filamento. La poliadenilazione e la copertura dell'estremità 50 dell'mRNA garantiscono stabilità e traduzione efficace [21]. L'efficienza di traduzione è strettamente legata alla coda poli (A) [114]. Quantificare la quantità di mRNA incapsulato nella particella e determinare la distribuzione dimensionale delle particelle è fondamentale per il prodotto farmaceutico perché consente al produttore di garantire l'uniformità di produzione. Il monitoraggio viene generalmente eseguito su una serie di caratteristiche, comprese quelle relative alla stabilità, all'identità e alla sterilità. Uno dei problemi per gli sviluppatori, i regolatori e gli utenti dei vaccini è la stabilità termica dei vaccini a mRNA [115]. Le vaccinazioni convenzionali sono sottoposte a stress test, inclusa l’esposizione prolungata a temperature elevate, al fine di determinarne la stabilità in una varietà di circostanze di conservazione. Ciò va condotto anche per i vaccini a mRNA, dove è necessario valutare non solo la stabilità della molecola di mRNA ma anche la preservazione della struttura della particella vaccinale stessa. I protocolli di test di integrità per i singoli componenti dell’mRNA nei vaccini a mRNA multicomponente necessitano ancora di sviluppo. L'identificazione di un vaccino con acido nucleico è determinata dalla sua sequenza. In generale, la sequenza del primo plasmide di DNA utilizzato come modello è sufficiente per le vaccinazioni a mRNA. Questo perché il DNA viene immediatamente tradotto in RNA. Non è noto se il sequenziamento dell'mRNA, direttamente o convertendolo in cDNA e quindi sequenziando quel DNA, fornisca informazioni aggiuntive. Anche se i tassi di errore delle RNA polimerasi sono sostanzialmente maggiori di quelli delle DNA polimerasi, i tassi di errore dichiarati di 1 errore ogni 104-105 nucleotidi sarebbero difficili da rilevare nell'RNA a causa della natura casuale degli errori. Sulla base delle ricerche attuali che suggeriscono che i vaccini a mRNA forniscono un’immunità protettiva nei modelli animali, questo tasso di errore non sembra alterare la formazione di un antigene immunogenico. La quantificazione dei lipidi può essere condotta mediante LC-MS/MS [116]. Se la proteina viene tradotta troppo rapidamente, potrebbe non ripiegarsi adeguatamente in un antigene funzionale, il che può avere la conseguenza involontaria di ridurre l’efficacia del vaccino.

9. Discussione

Nel 2021, i vaccini mRNA hanno attirato l'attenzione per la loro posizione critica nella reazione dell'industria farmaceutica al COVID-19. A differenza dei vaccini virali tradizionali, che utilizzano copie indebolite e non replicanti dei virus per visualizzare antigeni e suscitare una risposta immunitaria, la strategia dell’mRNA utilizza molecole di mRNA a filamento singolo ottimizzate che possono fornire induzione biologica. Una volta ottenuto il vaccino, le cellule lo assorbiranno, “leggeranno” la sequenza dell'mRNA e produrranno la proteina spike. Poiché al tuo corpo mancano proteine ​​che assomigliano a quel picco, il tuo sistema immunitario lo interpreta come dannoso e lancia un assalto contro di esso. Inoltre, se in seguito si viene infettati dal coronavirus, il sistema immunitario ricorda la proteina Spike e addirittura la riconosce. Il ritmo notevole con cui i primi due vaccini COVID-19 sono stati sviluppati e resi disponibili al pubblico negli Stati Uniti supporta l'idea che i vaccini mRNA di Pfizer e Moderna hanno ricevuto l'autorizzazione all'uso di emergenza dalla FDA a dicembre 2020-meno di un anno dopo che gli scienziati cinesi avevano annunciato la composizione genetica del coronavirus. Il vantaggio principale delle tecnologie vaccinali basate su mRNA è la loro possibilità di essere rapidamente modificate per varie malattie poiché l’elaborazione dell’antigene bersaglio è “esternalizzata” alle cellule ospiti, il che significa che solo il codice genetico dell’antigene viene utilizzato per progettare un vaccino candidato. Il tempo trascorso tra lo scambio della struttura genetica del SARS-CoV-2 da parte del governo cinese e il trasporto da parte di Moderna del suo candidato vaccino al National Institutes of Health (NIH) negli Stati Uniti per gli studi di fase uno è stato di soli 44 giorni. I vaccini vaccinali a mRNA non hanno storicamente ottenuto l’autorizzazione normativa per l’uso nell’umanità a causa della percepita mancanza di studi clinici per questo metodo, nonché di sfide tecniche legate alla stabilità e alla distribuzione del prodotto. Con un tale aumento di vaccini a mRNA sul mercato, è possibile fornire consigli più precisi per aiutare nello sviluppo e nella valutazione di nuovi vaccini a mRNA. Il controllo è un altro campo in cui la scienza dei vaccini a mRNA è agli inizi. Al momento non esistono linee guida ufficiali della Food and Drug Administration statunitense o dell’Agenzia europea per i medicinali per i vaccini a mRNA, anche se i farmaci sono sufficientemente sicuri per importanti studi clinici.

10. Considerazioni conclusive e prospettive future

Prima del 2020, l’mRNA non era un termine scientifico molto conosciuto nel mondo dei vaccini. A più di un anno dall'inizio della catastrofica pandemia globale di COVID-19, i programmi clinici basati sull'mRNA hanno registrato un aumento sostanziale del sostegno, sia da parte del pubblico in generale che delle grandi aziende farmaceutiche. Più di 80 milioni di americani sono stati vaccinati contro la SARS CoV-2-il virus che causa il COVID-19, sfruttando le possibilità rivoluzionarie della tecnologia mRNA. "Il campo dei vaccini è stato trasformato e avanzato per sempre a causa del COVID-19", afferma Dan Barouch, MD, Ph.D., direttore del Centro per la virologia e la ricerca sui vaccini presso la Harvard Medical School. Principalmente nel caso del vaccino COVID-19, il filamento di mRNA è progettato per produrre l'esclusiva "proteina picco" del coronavirus, che produce una risposta immunitaria in grado di proteggere dall'infezione con il virus vero e proprio. I vaccini sviluppati da Moderna e Pfizer/BioNTech sono stati gli unici vaccini basati su mRNA a ottenere l'approvazione di emergenza dalle principali autorità di regolamentazione e le prove reali derivanti dal lancio globale del COVID-19 sarebbero fondamentali per dimostrare la loro efficacia a lungo termine e caratteristiche di sicurezza contro il coronavirus e alcuni altri agenti virali. Il rilascio di mRNA basato su esosomi sarà anche il futuro delle terapie basate su mRNA [117,118]. Principalmente con le implicazioni della tecnologia basata sull’mRNA che diventano evidenti man mano che questi vaccini di prima generazione iniziano a essere distribuiti a livello globale, c’è attualmente un boom nella ricerca clinica sull’mRNA per le malattie infettive e i ricercatori del settore prevedono un aumento dell’interesse per le piattaforme di mRNA per altri campi terapeutici , in particolare l'oncologia, ma anche condizioni autoimmuni non comuni e geni neurodici.

Riferimenti

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