MTHFD2 è un checkpoint metabolico che controlla il destino e la funzione delle cellule T regolatorie

astratto grafico

Autori:

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Corrispondenza:

jeff.rathmell@vumc.org

In breve :

La sintesi dei nucleotidi è necessaria per supportare la rapida proliferazione delle cellule T. Sugiura et al. mostrano che il metabolismo delle purine de novo segnala la differenziazione e la funzione dei linfociti T diretti e identificano MTHFD2 come checkpoint metabolico e bersaglio terapeutico per le malattie infiammatorie.

Mette in risalto

• MTHFD2 è fondamentale per le cellule T CD4 attivate per mantenere la sintesi delle purine de novo

• MTHFD2 insufficiente promuove i fenotipi simili alle cellule Treg e il metabolismo nelle cellule Th17 d L'inibizione di MTHFD2 sopprime la segnalazione di mTORC1 e altera la metilazione dell'istone

• MTHFD2 può essere mirato per proteggere dall'infiammazione e dall'autoimmunità in vivo

MTHFD2 è un checkpoint metabolico che controlla il destino e la funzione delle cellule T regolatorie

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matteo Z. Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L. Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Lupo,²Arissa C. Young,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewell,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Foerch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Dawn C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵e Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilt Center for Immunobiology, Dipartimento di Patologia, Microbiologia e Immunologia, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

²Dipartimento di Medicina, Divisione di Ematologia e Oncologia, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, USA

³Dipartimento di Patologia, Università dell'Iowa, Iowa City, IA 52242, USA

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Science Park, Oxford, Regno Unito

⁵Dipartimento di Chimica, Ludwig Cancer Research Institute Princeton Branch, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, NJ 08544, USA6 Contatto principale

*Corrispondenza: jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

RIEPILOGO

La stimolazione antigenica promuove la riprogrammazione metabolica delle cellule T per soddisfare l'aumento delle richieste biosintetiche, bioenergetiche e di segnalazione. Mostriamo che l'enzima del metabolismo di un carbonio (1C) metilenetetraidrofolato deidrogenasi 2 (MTHFD2) regola la sintesi delle purine de novo e la segnalazione nelle cellule T attivate per promuovere la proliferazione e la produzione di citochine infiammatorie. Nelle cellule patogene T helper{4}} (Th17), MTHFD2 ha impedito una sovraregolazione aberrante del fattore di trascrizione FoxP3 insieme al guadagno inappropriato della capacità soppressiva. Il deficit di MTHFD2 ha anche promosso la differenziazione delle cellule T regolatorie (Treg). Meccanicamente, l'inibizione di MTHFD2 ha portato all'esaurimento dei pool di purine, all'accumulo di intermedi biosintetici delle purine e alla diminuzione della segnalazione mTORC1 del sensore di nutrienti. MTHFD2 è stato anche fondamentale per regolare la metilazione del DNA e dell'istone nelle cellule Th17. È importante sottolineare che il deficit di MTHFD2 ha ridotto la gravità della malattia in più modelli di malattie infiammatorie in vivo. MTHFD2 è quindi un checkpoint metabolico per integrare il metabolismo delle purine con la segnalazione delle cellule effettrici patogene ed è un potenziale bersaglio terapeutico all'interno delle vie del metabolismo 1C.

INTRODUZIONE

Un'efficace mobilitazione della risposta immunitaria adattativa richiede una robusta attivazione dei linfociti T CD4 più per subire una rapida crescita e proliferazione cellulare. Ciò comporta la riprogrammazione metabolica, guidata dal sensore di nutrienti mTORC1, da uno stato di riposo catabolico a uno stato di crescita anabolico con maggiori richieste biosintetiche, bioenergetiche e di segnalazione. A seconda dell'ambiente delle citochine, le cellule T CD4 più si differenziano in effettori e sottoinsiemi regolatori che hanno programmi metabolici distinti che guidano le loro funzioni effettrici (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). L'equilibrio di questi sottoinsiemi è fondamentale per la normale immunità mentre previene le malattie infiammatorie e autoimmuni. Ad esempio, la sclerosi multipla (SM) è caratterizzata da un aumento delle cellule T helper-17 (Th17) che producono interleuchina-17 (IL- 17) e da cellule T regolatorie soppressive ridotte o inefficaci (Treg) (Dendrou et al., 2015). Mirare ai programmi metabolici specifici di questi sottoinsiemi di cellule T offre un approccio alternativo all'immunoterapia.

La terapia basata sul metabolismo cellulare iniziò nel 1948 quando gli agenti chemioterapici antifolati si dimostrarono efficaci nei bambini con leucemia linfoblastica acuta (Farber et al., 1948). Il folato contribuisce al metabolismo del carbonio (1C) per la biosintesi delle purine, la generazione di donatori di metile e il mantenimento dell'equilibrio redox cellulare (Ducker e Rabinowitz, 2017; Yang e Vousden, 2016). Da allora molti farmaci, tra cui metotrexato (MTX), fluorouracile ({7}}FU) e mercaptopurina ({8}}MP), sono stati sviluppati per indirizzare questo percorso. Le cellule a rapida proliferazione, comprese le cellule tumorali e le cellule T attivate, condividono le dipendenze su questi percorsi per sintetizzare DNA e RNA. MTX rimane comunemente usato per trattare malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide (RA) (Brown et al., 2016). Tuttavia, a causa dell'ampia espressione degli enzimi mirati, questi agenti terapeutici sono associati a effetti avversi comuni e potenzialmente gravi. L'identificazione di bersagli enzimatici metabolici che sono selettivamente importanti nelle popolazioni cellulari di interesse potrebbe portare allo sviluppo di immunoterapie più sicure ed efficaci.

Il metabolismo dell'1C comprende i cicli del folato e della metionina con trasferimento di singole unità di carbonio. La serina funge da donatore 1C per attivare il tetraidrofolato (THF) a 5,{3}}metileneTHF, con concomitante produzione di glicina. 5,{5}}metileneTHF può quindi essere ossidato utilizzando NAD(P) per generare il precursore purinico 10- formilTHF. In alternativa, 10-formylTHF può essere sintetizzato da formiato e THF in modo ATP-dipendente. Nella via citosolica, 10-la produzione di fomilTHF è mediata dalla metileneTHF deidrogenasi 1 (MTHFD1). La perdita di MTHFD1 affama le cellule di 10-formylTHF citosolico, ablazione della capacità biosintetica delle purine e mutazioni in MTHFD1 causano grave immunodeficienza combinata (SCID) (Field et al., 2015). Il percorso mitocondriale si basa su MTHFD2 e MTHFD{17}}mitocondriali simili (MTHFD1L).

Figura 1. Il metabolismo 1C e l'MTHFD2 sono sovraregolati nel CD4 attivato^piùcellule T e nel contesto di EAE

(A) Cambiamento nelle specie del metabolismo dei nucleotidi in CD4 differenziati in vitro^piùSottoinsiemi di cellule T confrontati con cellule naive misurate mediante spettrometria di massa (n=3 repliche biologiche).

(B) Flusso di lavoro per lo screening CRISPR mirato nel modello di infiammazione polmonare in vivo.

(C) Modifica dell'abbondanza di gRNA dallo screening CRISPR in vivo mirato al metabolismo 1C nel CD4 primario^piùCellule T (analisi statistica eseguita da MAGeCK, n=3 replicati biologici).

(D) espressione di mRNA di geni identificati in (C) durante lo sviluppo e l'attivazione delle cellule T (dati dal browser di dati ImmGen RNA-seq).

(E) Espressione proteica dei geni identificati in (C) in CD4 ingenui e attivati^piùCellule T (dati della Risorsa immunologica del proteoma [ImmPRes]).

(F) espressione di mRNA di geni identificati in (C) nel sangue intero di individui con i disturbi infiammatori indicati rispetto a soggetti sani di controllo (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA in trattamento MTX; LES, lupus eritematoso sistemico; MS-Tx naive, MS naive al trattamento al momento della diagnosi; SM accertata, SM in trattamento e in remissione della malattia; n=3–8 donatori.

(G) IHC che mostra la colorazione CD3 e MTHFD2 nel segmento cauda equina del midollo spinale di topi con EAE sintomatico al 2003 (in alto; barra della scala, 100 mm) e 4003 (in basso; barra della scala, 50 mm) ingrandimento (i dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti).

(H e I) Espressione dell'mRNA relativa (H) media (MFI) e (I) di MTHFD2 in CD4^piùCellule T della milza e del midollo spinale di topi con EAE sintomatico e milza di topi di controllo (media ± SD, ANOVA unidirezionale, i dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con 6 replicati biologici totali).

(J) Espressione di mRNA di MTHFD2 in CD4 indifferenziato^piùCellule T 0, 5 e 24 ore dopo l'attivazione con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 (media ± SD, ANOVA unidirezionale, n=3 replicati biologici).

(K) Relativo MTHFD2 MFI oltre 5 giorni dopo l'attivazione in sottoinsiemi di cellule CD4 più T, normalizzati a cellule a riposo (media ± SD, n {3}} replicati biologici). Vedere anche la figura S1. I risultati statisticamente significativi sono etichettati (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percento="">

MTHFD2 è uno dei geni più altamente indotti e sovraespressi in tutti i tumori (Nilsson et al., 2014). Sebbene ampiamente sovraregolato durante l'embriogenesi, MTHFD2 ha poca o nessuna espressione nella maggior parte dei tessuti adulti (Nilsson et al., 2014). Nella terapia antitumorale (Zhu e Leung, 2020), l'inibizione di MTHFD2 può portare a un aumento dello stress ossidativo (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), dipendenza da glicina (Koufaris et al., 2016) e insufficiente sintesi delle purine (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman et al., 2016). Il deficit di MTHFD2 può anche sopprimere l'attività di mTORC1 attraverso molteplici meccanismi, anche attraverso l'esaurimento della guanina e la successiva inibizione dell'attivazione di mTORC1-GTPase Rheb (Emmanuel et al., 2017). Il deficit di MTHFD2 provoca anche l'accumulo di intermedi della via di sintesi delle purine, incluso l'analogo dell'adenosina monofosfato (AMP) 5-aminoimidazolo carbossammide ribonucleotide (AICAR) (Ducker et al., 2016), che può attivare la protein chinasi attivata da AMP (AMPK) per inibire mTORC1 (Su et al., 2019).

Poiché il metabolismo 1C integra molteplici input di nutrienti ed è terapeuticamente trattabile, abbiamo esaminato il ruolo del metabolismo 1C nel CD4^piùSottoinsiemi di cellule effettore T (Teff) e Treg. Attraverso uno screening mirato in vivo basato su CRISPR-Cas9- nelle cellule T murine primarie, abbiamo identificato MTHFD2 come un successo che è stato anche sovraregolato in modo coerente in individui con disturbi infiammatori. In particolare, la carenza di MTHFD2 ha compromesso la proliferazione e la funzione delle cellule di Teff. La carenza di MTHFD2 ha anche promosso l'espressione aberrante di FoxP3 e l'attività soppressiva nelle cellule Th17 promuovendo la differenziazione delle cellule Treg. Questi effetti erano associati all'accumulo di AICAR, alla riduzione delle concentrazioni di purine, alla sottoregolazione della segnalazione di mTORC1, all'aumento del metabolismo mitocondriale e all'alterata metilazione del DNA e dell'istone. In vivo, il targeting di MTHFD2 ha protetto da più modelli di malattie infiammatorie. Questi dati mostrano che l'MTHFD2 funge da checkpoint metabolico nelle cellule Th17 e Treg ed evidenziano il potenziale di questo enzima come bersaglio per l'immunoterapia antinfiammatoria.

RISULTATI

Il metabolismo dell'1C e la sintesi delle purine sono differenzialmente attivi nel CD4^piùSottoinsiemi di cellule T

Abbiamo ipotizzato che la sintesi dei nucleotidi possa differire tra i CD4^piùSottoinsiemi di cellule T. CD4^piùLe cellule T sono state differenziate in vitro in cellule Th1, Th17 e Treg e raccolte dopo 72 ore per la spettrometria di massa. Le quantità di specie nucleotidiche erano generalmente elevate in tutti i sottoinsiemi rispetto alle cellule ingenue (Figura 1A). In particolare, gli intermedi di sintesi delle purine erano differenzialmente abbondanti, con il più alto accumulo di glicinamide ribonucleotide (GAR), 1- (fosforibosil) imidazolo carbossammide (SICAR) e AICAR nelle cellule Th17 (Figura S1A).

Per testare la dipendenza di CD4^piùCellule T sugli enzimi nel metabolismo 1C, abbiamo eseguito uno screening in vivo basato su CRISPR-Cas9- nel CD4 primario^piùCellule T (Figura 1B). È stata costruita una libreria di RNA guida personalizzata (gRNA) per indirizzare gli enzimi nel metabolismo 1C, insieme al complesso di sclerosi tuberosa 2 (TSC2) come controllo positivo e controlli negativi non mirati (NTC). CD4^piùLe cellule T isolate da topi transgenici OT-II Cas9 con doppio transgenico del recettore delle cellule T (TCR) dell'ovoalbumina (OVA) sono stati trasdotti con questa libreria e trasferiti per via endovenosa in Rag1^{__ /__}host. I topi sono stati quindi immunizzati con OVA intranasale per indurre l'infiammazione polmonare. Le cellule T recuperate dai polmoni di questi topi sono state sequenziate ed è stato stabilito l'arricchimento o l'esaurimento dei gRNA rispetto alle frequenze di input. Il gRNA di TSC2 è stato arricchito, supportando il ruolo inibitorio di questa proteina nei linfociti T. Al contrario, i gRNA PPAT, AHCY, MAT2A e MTHFD1 sono stati esauriti in modo significativo e i gRNA GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 e MTHFD2 sono stati ridotti in misura minore, indicando che questi geni contribuiscono alla proliferazione delle cellule T e alla funzione infiammatoria in vivo (Figure 1C e S1B).

Successivamente abbiamo esaminato il profilo di espressione dei geni identificati dallo schermo. Sebbene tutti fossero sovraregolati in modo coordinato nello sviluppo dei timociti, l'mRNA e la proteina MTHFD2 sono stati indotti più fortemente nelle cellule T periferiche stimolate (Figure 1D e 1E). Inoltre, in un set di dati di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) pubblicato separatamente da sangue intero di individui con una varietà di malattie infiammatorie e autoimmuni (Aune et al., 2017), MTHFD2 è stato sovraespresso in modo coerente in più condizioni, tra cui la colite ulcerosa, il morbo di Crohn , celiachia, RA, lupus eritematoso sistemico (LES), psoriasi, artrite psoriasica, sindrome di Sjo Gren e SM (Figura 1F). In particolare, gli individui con SM di recente diagnosi avevano un'espressione MTHFD2 significativamente elevata rispetto a donatori sani o individui con SM sottoposti a terapia con remissione della malattia (Figura S1C). Quindi, CD4^piùLa proliferazione e la sopravvivenza delle cellule T dipendono da alcuni geni del metabolismo 1C e l'espressione di questi geni differisce attraverso le fasi di sviluppo, attivazione e differenziazione delle cellule T, nonché nell'impostazione dell'infiammazione patologica.

Figura 2. La carenza di MTHFD2 compromette il CD4^piùProliferazione e funzione dei linfociti T

(A–D) Proliferazione misurata mediante (A) diluizione CellTrace Violet (CTV), (B) vitalità, (C) espressione di CD25 e (D) espressione di TF in CD4^piùSottoinsiemi di cellule T trattati con MTHFD2i per 72 ore dopo l'attivazione (media ± SD, ANOVA unidirezionale, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali).

MTHFD2 è altamente sovraregolato nel CD4 che si infiltra nel SNC^piùCellule T nell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) e nel CD4 attivato^piùCellule T in vitro

La regolazione di MTHFD2 non è stata ben descritta nelle cellule T CD4 più. Per misurare l'espressione di MTHFD2 nelle lesioni infiammatorie in vivo, CD4^piùLe cellule T di topi transgenici 2D2 TCR specifici per la mielina sono state attivate e trasferite adottivamente in Rag1^{__ /__}topi per indurre EAE. Dopo che i topi hanno iniziato a mostrare una paralisi degli arti posteriori, il segmento cauda equina del midollo spinale è stato analizzato mediante immunoistochimica (IHC). I topi che hanno ricevuto cellule T 2D2 hanno mostrato un arricchimento di MTHFD2 e CD3^piùcellule che era assente nel controllo (Figura 1G). Per determinare direttamente se CD4^piùLe cellule T hanno sovraregolato MTHFD2 nelle lesioni infiammate, le cellule T della milza e del midollo spinale di topi sottoposti a un modello di EAE indotto dalla glicoproteina mielinica degli oligodendrociti (MOG) e dalla tossina della pertosse (PTX) sono state raccolte per l'analisi. CD4 infiltrante il SNC^piùLe cellule T hanno sovraespresso MTHFD2 rispetto al CD4 splenico abbinato^piùCellule T da topi di controllo e EAE, misurate mediante citometria a flusso (Figura 1H) e qRT-PCR (Figura 1I). La cinetica dell'espressione di MTHFD2 in CD4^piùSuccessivamente sono state misurate le cellule T in vitro. Una robusta sovraregolazione dell'mRNA di MTHFD2 è stata rilevata dopo 5 ore di stimolazione e ha iniziato a diminuire di 24 ore (Figura 1J), mentre CD4 differenziato^piùI sottoinsiemi di cellule T hanno raggiunto la massima espressione della proteina MTHFD2 48 h dopo l'attivazione (Figura 1K). Questi dati mostrano che MTHFD2 è sovraregolato in CD4^piùCellule T con attivazione in vitro e nel sito di infiammazione in vivo.

CD4^piùI sottoinsiemi di cellule T richiedono differenzialmente MTHFD2 per l'attivazione, la proliferazione, la sopravvivenza e la produzione di citochine

Successivamente abbiamo testato il ruolo di MTHFD2 nell'attivazione, differenziazione, proliferazione e funzione del sottoinsieme di cellule T CD4 più. CD4^piùLe cellule T sono state attivate in vitro in presenza di citochine per la differenziazione e il veicolo ottimali delle cellule Th1, Th17 e Treg o un inibitore MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et al., 2019). Dopo 72 ore, tutti i sottoinsiemi avevano ridotto la proliferazione (Figura 2A) e il numero di cellule cicliche vive (Figure S2A e S2B). La vitalità è stata ridotta nelle cellule Th1 e Th17 (Figura 2B) e l'attivazione, misurata dall'espressione di CD25, è stata ridotta in tutti i sottoinsiemi (Figura 2C). L'espressione del fattore di trascrizione (TF) caratterizzante il lignaggio è stata ridotta nelle cellule Th1 (T-bet^più) ma invariato nelle cellule Th17 (ROR t^più) e modificato minimamente nelle celle Treg (FoxP3^più) (Figura 1D). Per misurare la funzione delle cellule di Teff, le cellule sono state stimolate nuovamente con 12-miristato 13- acetato (PMA) e ionomicina. Significativamente meno cellule Th1 hanno espresso interferone-g (IFNg) e meno cellule Th17 hanno espresso IL-17 quando differenziate in presenza di MTHFD2i (Figura 2E). Ciò non era dovuto a un'attivazione iniziale compromessa perché questi fenotipi sono stati mantenuti quando l'esposizione al farmaco è stata ritardata fino a 24 ore dopo l'attivazione, sebbene l'espressione di TF che caratterizza l'età della linea fosse inalterata in questa impostazione (Figure S2C-S2F). MTHFD2 è quindi richiesto per il massimo CD4^piùAttivazione, proliferazione, sopravvivenza e produzione di citochine dei linfociti T.

Per convalidare geneticamente questi effetti farmacologici, abbiamo generato un Mthfd2^fl/flceppo di topo e l'ha incrociato con topi transgenici Cd4- cre per ottenere l'eliminazione genetica condizionale. Come anticipato, attivato CD4^piùCellule T da Mthfd2^fl/flCd4-cre più (CD4^ΔMthfd2) i topi avevano un'espressione di MTHFD2 inferiore rispetto alle cellule di Mthfd2^fl/flCd4-cre^più(wild-type [WT]) compagni di cucciolata (Figura 2F). Al basale, i topi CD4DMthfd2 avevano un numero leggermente inferiore di CD4^piùCellule T nella milza rispetto al WT (Figura 2G). Dopo attivazione e differenziazione in vitro, numero di cellule e vitalità di CD4^ΔMthfd2Le cellule Th17 e, in misura minore, le cellule Treg erano significativamente inferiori (Figura 2H). Inoltre, l'espressione di CD25 è stata ridotta nelle cellule Th17 e Treg e ha mostrato una tendenza più bassa nelle cellule Th1 (Figura 2I). Infine, CD4^ΔMthfd2Le cellule Th1 e Th17 avevano rispettivamente un'espressione inferiore di T-bet e ROR t. FoxP3 nelle cellule Treg, tuttavia, è rimasto invariato (Figura 2J). Nonostante i cambiamenti nell'espressione di TF, le cellule di Teff che si sono differenziate hanno prodotto quantità normali di citochine (Figura 2K). Le differenze nei risultati tra gli approcci farmacologici e genetici possono essere attribuite alla tempistica e alla completezza della perdita della funzione enzimatica durante lo sviluppo e ai potenziali meccanismi compensatori.

L'MTHFD2i induce l'espressione di FoxP3 nelle cellule Th17 e migliora la differenziazione delle cellule Treg

Data la dipendenza delle cellule Teff da MTHFD2, abbiamo testato la regolazione MTHFD2i delle cellule FoxP3 e Treg. In particolare, la sovraregolazione aberrante indotta dal trattamento MTHFD2i di FoxP3 in Th1 e in modo più evidente nelle cellule Th17 in modo dose-dipendente (Figura 3A). Ciò si è verificato anche quando il trattamento è stato ritardato fino a 24 ore dopo l'attivazione (Figura 3B). Una tendenza simile è stata osservata nelle cellule CD4DMthfd2 Th17 (Figura 3C). Questa sovraregolazione FoxP3 era funzionale perché le cellule Th17 trattate con MTHFD2i hanno acquisito capacità soppressiva quando co-coltivate con CD8^piùCellule T (Figura 3D). L'MTHFD2i può quindi promuovere i fenotipi simili a cellule FoxP3 e Treg nelle cellule Th17. L'MTHFD2i ha anche migliorato la differenziazione delle cellule Treg indotte. Le cellule Treg sono state differenziate con una gamma di concentrazioni di fattore di crescita trasformante b (TGF-b) in presenza di MTHFD2i. Ad ogni concentrazione testata tranne la più alta, l'espressione di FoxP3 è aumentata con il trattamento MTHFD2i (Figure 3E e 3F). Questo fenotipo è stato mantenuto anche con il trattamento MTHFD2i ritardato (Figura 3G).

Figura 3. La carenza di MTHFD2 induce l'espressione di FoxP3 e promuove uno spostamento verso la fosforilazione ossidativa

(A) Espressione di FoxP3 nelle cellule Th1 e Th17 trattate con MTHFD2i 72 ore dopo l'attivazione (media ± SD, ANOVA unidirezionale, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali).

(B) Espressione di FoxP3 nelle cellule Th1 e Th17 attivate per 24 ore e quindi trattate con veicolo o 500 nM MTHFD2i per 48 ore (media ± SD, test t non accoppiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali).

(C) Espressione di FoxP3 nelle cellule Th1 e Th17 da WT e CD4DMthfd2 72 h dopo l'attivazione (media ± SD, test t non accoppiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali).

(D) Saggio di soppressione che misura la capacità soppressiva aberrante delle cellule Th17 trattate con MTHFD2i. Le cellule Th17 pretrattate sono state co-coltivate con cellule T CD8 più colorate con CTV per misurare la proliferazione dopo l'attivazione con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 (media ± SD, ANOVA unidirezionale, n=3 replicati biologici) .

(E) Espressione di FoxP3 nelle cellule Treg differenziate con un intervallo di concentrazioni di TGF-b e trattate con MTHFD2i (media ± SD, test t non accoppiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali).

(F) Grafici di citometria a flusso per i dati tabulati in (E).

(G) Espressione di FoxP3 in cellule Treg attivate e differenziate con basse concentrazioni di TGF-b per 24 ore e quindi trattate con MTHFD2i per 48 ore (media ± SD, test t spaiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali ).

(H) Seahorse XF Cell Mito stress test eseguito su cellule Th17 e Treg trattate con MTHFD2i (media ± SD, n {3}} replicati biologici). (I) ECAR basale, OCR basale, OCR massimo e OCR/ECAR basale rapporto misurato in (H) (media ± DS, test t non accoppiato, i dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con 6 replicati biologici totali). I risultati statisticamente significativi sono etichettati (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p percentuale 0,001).

Le cellule Treg hanno un metabolismo mitocondriale maggiore rispetto alle cellule Th17 (Michalek et al., 2011). Per determinare le conseguenze metaboliche del trattamento con MTHFD2i, le cellule Th17 e Treg sono state valutate mediante analisi del flusso extracellulare. L'MTHFD2i ha aumentato il tasso di consumo di ossigeno (OCR) basale e massimo delle cellule Th17 per indicare uno spostamento verso la respirazione mitocondriale (Figura 3H). Al contrario, le cellule Th17 e Treg avevano un tasso di acidificazione extracellulare basale (ECAR) ridotto con il trattamento MTHFD2i, suggerendo una ridotta glicolisi (Figura 3I). Il rapporto basale tra OCR e ECAR è aumentato significativamente nelle cellule Th17 e Treg perché l'MTHFD2i ha spostato il programma metabolico dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa. Questi dati mostrano che l'MTHFD2i migliora l'espressione di FoxP3 nelle cellule Th17 e nelle cellule Treg differenziate in condizioni di TGF-b basso e sposta le cellule Th17 in un metabolismo più simile alle cellule Treg.

La carenza di MTHFD2 nei linfociti T umani CD4 più diminuisce la proliferazione e la vitalità delle cellule Th17 aumentando l'espressione di FOXP3 e smorzando l'attività di mTORC1

Per testare la traducibilità dei risultati di cui sopra in cellule umane, CD4^piùLe cellule T isolate dal sangue periferico di donatori sani sono state differenziate in vitro in cellule Th1, Th17 e Treg e trattate con veicolo o MTHFD2i dal momento dell'attivazione. La proliferazione è stata ridotta in modo significativo nelle cellule Th17 e Treg trattate con MTHFD2i (Figura 4A) e anche le cellule Th17 hanno mostrato una maggiore apoptosi (Figura 4B). La diminuzione della proliferazione nelle cellule Th17 è stata ricapitolata con un approccio genetico utilizzando un piccolo RNA interferente (siRNA) (Figure 4C e S2G). Simile alle cellule murine, l'espressione di FOXP3 era più alta nelle cellule Th17 umane trattate con MTHFD2i e tendeva più in alto nelle cellule Treg umane trattate con MTHFD2i (Figure 4D e S2H). Dato che l'asse mTORC1-AMPK è fondamentale per la differenziazione delle cellule Th17 e Treg, è stata misurata anche la fosforilazione della proteina ribosomiale bersaglio mTORC1 S6 (fosfo-S6). Ciò ha mostrato una ridotta attività di mTORC1 nelle cellule Th17 con MTHFD2i o siMTHFD2 (Figura 4E). Pertanto, la perdita della capacità proliferativa e l'induzione dell'espressione di FOXP3 nelle cellule Th17 e Treg possono essere ricapitolate nel CD4 umano primario^piùcellule T.

Figura 4. La carenza di MTHFD2 altera la proliferazione e induce l'espressione di FOXP3 nelle cellule Th17 umane

(A) Proliferazione misurata mediante diluizione CTV in sottoinsiemi di cellule T umane CD4 più trattate con veicolo o 2 mM MTHFD2i per 72 ore dopo l'attivazione con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 (test t accoppiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 5 –6 donatori sani).

(B) Apoptosi misurata dall'annessina V in cellule CD4 più T umane trattate con MTHFD2i per 72 ore (test t accoppiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 5-6 donatori sani).

(C) Espressione di Ki-67 in cellule T umane CD4 più trasdotte con NTC o siMTHFD2 (test t accoppiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 4 donatori di pazienti sani).

(D) Espressione di FOXP3 in cellule T umane CD4 più trattate con MTHFD2i per 72 ore (test t accoppiato, i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 6-10 donatori sani).

(E) Modifica dell'espressione di fosfo-S6 nelle cellule T umane CD4 più trattate con MTHFD2i per 72 ore o trasdotte con siMTHFD2 (media ± SD, test t di un campione, dati rappresentativi di tre esperimenti indipendenti con 4-6 donatori sani). I risultati statisticamente significativi sono etichettati (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percento="">

Le cellule T si basano sulla funzione enzimatica MTHFD2 e i fenotipi possono essere salvati dal prodotto

MTHFD2 è necessario per il mantenimento del pool di formiato mitocondriale per la sintesi delle purine (Ma et al., 2017), ma può anche svolgere ruoli non enzimatici. Supportando l'attività enzimatica essenziale, il trattamento MTHFD2i ha portato all'assorbimento compensatorio del formiato dal mezzo nei sottoinsiemi di cellule T CD4 più (Figura 5A). L'unità 1C utilizzata per la sintesi del formiato è fornita dalla conversione della serina in glicina e la serina intracellulare accumulata mentre la glicina è stata esaurita con il trattamento MTHFD2i in tutti i sottoinsiemi (Figura 5B). Anche le concentrazioni di metionina sono state leggermente aumentate, suggerendo l'inibizione del ciclo della metionina. Come previsto, dato che la fase di conversione serina-glicina è a monte di MTHFD2, queste modifiche non sono state salvate dalla fornitura di formiato nel mezzo.

Figura 5. Gli effetti di MTHFD2i sui sottoinsiemi di cellule T vengono salvati dal formiato esogeno

(A) Assorbimento del formiato misurato mediante spettroscopia di risonanza magnetica 1 H (MRS) in sottoinsiemi di cellule CD4 più T trattati con veicolo o 500 nM MTHFD2i per 72 ore dopo l'attivazione (media ± SD, test t non accoppiato, i dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con 6 repliche biologiche totali).

(B) Modifica delle concentrazioni di serina, glicina e metionina nelle cellule CD4 più T trattate con 500 nM MTHFD2i o 500 nM MTHFD2i più 1 mM formiato per 4-6 h rispetto al veicolo, misurato mediante spettrometria di massa (media ± SD, n { {8}} repliche biologiche).

(C) Conteggio di cellule vive, vitalità ed espressione di CD25 in cellule CD4 più T trattate con MTHFD2i salvate con formiato 1 mM o soluzione di adenina e guanina purina 60 mM per 72 ore dopo l'attivazione (media ± SD, ANOVA unidirezionale, i dati sono rappresentativo di tre esperimenti indipendenti con 9 repliche biologiche totali).

(D) Conteggio delle cellule vive, vitalità ed espressione di CD25 in CD4 più cellule T da compagni di cucciolata WT o CD4DMthfd2 salvati con formiato o purine per 72 ore dopo l'attivazione (media ± SD, ANOVA unidirezionale, n=3 replicati biologici ).

Successivamente abbiamo testato se l'aggiunta di formiato o una soluzione di adenina e guanina purina potesse salvare la funzione enzimatica carente e invertire gli effetti a valle della carenza di MTHFD2. In effetti, il formiato di 1 mM ha ripristinato la proliferazione, la vitalità e l'attivazione nelle cellule trattate con MTHFD2i (Figura 5C). La supplementazione di purine ha salvato la proliferazione in tutti i sottogruppi e l'attivazione nelle cellule Th1 e Th17 ma non la vitalità in tutti i sottogruppi e l'attivazione nelle cellule Treg. Formate ha anche salvato la proliferazione, la vitalità e l'attivazione in CD4^ΔMthfd2Cellule T (Figura 5D). La ridotta produzione di citochine nelle cellule Th1 e Th17 trattate con MTHFD2i è stata invertita in quantità di veicolo con aggiunta di formiato o purina (Figura 5E). In particolare, la sovraregolazione aberrante di FoxP3 nelle cellule Th17 è stata salvata dall'aggiunta di purine ma non dal formiato, mentre l'aggiunta di formiato e purina ha ridotto l'espressione di FoxP3 al basale nelle cellule Treg differenziate con basse concentrazioni di TGF-b (Figura 5F). I fenotipi MTHFD2i sembrano dipendere dal mantenimento di MTHFD2 del formiato mitocondriale o dei pool di purine.

MTHFD2 regola l'attività di mTORC1 e la metilazione del DNA e dell'istone in CD4^piùcellule T

Nelle cellule tumorali immortalate, la carenza di MTHFD2 può portare all'accumulo degli intermedi di sintesi delle purine GAR, SAICAR e AICAR, che sono a monte delle fasi di formilazione mediate da 10-formilTHF (Ducker et al., 2016). CD4^piùI sottogruppi di cellule T sono stati coltivati ​​​​per 72 ore prima dell'esposizione a MTHFD2i per 4-6 ore. Questo breve lasso di tempo è stato scelto per evitare qualsiasi effetto secondario, comprese le modifiche compensative. Il trattamento transitorio MTHFD2i ha provocato l'accumulo di GAR, SAICAR e AICAR in tutti i sottoinsiemi (Figura 6A). Questo effetto è stato completamente salvato dall'aggiunta di formiato 1 mM, supportando un ruolo enzimatico di MTHFD2. Anche nucleotidi e nucleobasi, inclusa la guanina, sono stati esauriti dall'MTHFD2i e salvati dal formiato nelle cellule Th17 e Treg (Figura 6B).

Figura 6. MTHFD2i provoca un accumulo di intermedi di sintesi delle purine che hanno smorzato l'attività di mTORC1 e alterato la metilazione del DNA e dell'istone

(A) Modifica delle concentrazioni di GAR, SAICAR e AICAR nelle cellule CD4 più T trattate con 500 nM MTHFD2i o 500 nM MTHFD2i più 1 mM formiato per 4-6 h rispetto al veicolo, misurato mediante spettrometria di massa (media ± SD, uno- modo ANOVA, n=3 repliche biologiche).

(B) Modifica delle specie del metabolismo dei nucleotidi nelle cellule Th17 e Treg trattate con MTHFD2i con o senza formiato per 4-6 ore rispetto al veicolo, misurate mediante spettrometria di massa (n=3 repliche biologiche).

(C) Immunoblot di fosfo-S6, S6, Rheb, fosfo-ACC, ACC, HIF-1a e b-actina in CD4 più cellule T trattate con MTHFD2i con o senza formiato per 72 ore dopo l'attivazione (dati rappresentativo di tre esperimenti indipendenti con n=3 repliche biologiche).

(D) Modifica dei metaboliti del ciclo TCA nelle cellule Th17 trattate con MTHFD2i con o senza formiato per 6 h rispetto al veicolo, misurata mediante spettrometria di massa (media ± SD, ANOVA unidirezionale, n {4}} replicati biologici).

(E) Mappe di calore del rapporto di controllo da H3K27me3 a IgG in ±10- regioni kb attorno ai promotori di geni noti UCSC nelle cellule Th17 e Treg trattate con MTHFD2i, misurate da CUT&RUN (dati raggruppati da 3 replicati biologici).

(F) Heatmap della frequenza mediana di metilazione del DNA del locus Foxp3 dal sito CpG nelle cellule Th1 e Th17 trattate con veicolo o MTHFD2i 500 nM e nelle cellule nTreg da compagni di cucciolata WT o CD4DMthfd2 (test di umore, n {7}} replicati biologici).

(G) Tabulazione di (F) per promotore prossimale, promotore distale e TSDR (test t accoppiato). Vedere anche le figure S3 e S4. I risultati statisticamente significativi sono etichettati (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percento="">

AICAR e nucleotidi sono regolatori consolidati dell'asse mTORC{0}}AMPK (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). In effetti, l'espressione di fosfo-S6 è stata ridotta con il trattamento MTHFD2i in tutti i sottoinsiemi e completamente ripristinata mediante l'aggiunta di formiato (Figure 6C e S3A). La proteina legante GTP Rheb, un attivatore obbligato di mTORC1, può essere sensibile alla disponibilità di guanina intracellulare (Emmanuel et al., 2017) e l'espressione di Rheb è stata smorzata con il trattamento MTHFD2i (Figure 6C e S3B). AICAR è un analogo dell'adenosina e un attivatore di AMPK (Rae and Mairs, 2019; Su et al., 2019). Tuttavia, 72 ore dopo l'attivazione, la fosforilazione dell'AMPK o dei suoi bersagli, l'acetil-coenzima A(CoA) carbossilasi (fosfo-ACC) e la chinasi attivante l'autofagia simile a Unc-51-(fosfo-ULK1), non è cambiata con il trattamento con MTHFD2i (Figure 6C, S3C e S3D). L'attività di mTORC1 promuove Th17 e attenua la differenziazione delle cellule Treg in parte attraverso l'induzione del metabolismo glicolitico HIF-1a-dipendente (Shi et al., 2011). Coerentemente con ciò, HIF-1un'espressione è stata ridotta nelle cellule Th17 trattate con MTHFD2i e CD4DMthfd2 (Figure 6C, S3E e S3F). Questi cambiamenti nell'attività di mTORC1 non erano associati ad alcun deficit nella segnalazione del TCR, come misurato dall'espressione di Nur77 con e senza ri-stimolazione (Figura S3G). L'attività del trasduttore di segnale e dell'attivatore della trascrizione 3 (STAT3), fondamentale per lo sviluppo delle cellule Th17, è rimasta invariata o aumentata leggermente con il trattamento con MTHFD2i (Figura S3H). La diminuzione dell'attività di mTORC1 e il passaggio dalla glicolisi alla fosforilazione ossidativa con il trattamento con MTHFD2i hanno suggerito cambiamenti nell'abbondanza relativa dei metaboliti del ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA). Le concentrazioni di succinato e fumarato sono state ridotte in modo significativo dall'MTHFD2i ma salvate dal formiato (Figura 6D).

I metaboliti del TCA sono noti inibitori delle demetilasi del DNA e dell'istone (Su et al., 2016) e l'esaurimento dei pool di succinato e fumarato può supportare uno stato ipometilato. La trimetilazione H3K27 (H3K27me3) attraverso il genoma è stata misurata mediante sequenziamento CUT&RUN (clivaggio sotto target e rilascio mediante nucleasi) (Skene e Henikoff, 2017). In effetti, le cellule Th17 trattate con MTHFD2i avevano ridotto H3K27me3 rispetto al veicolo (Figure 6E e S4A). La metilazione del DNA nel locus Foxp3 è stata anche misurata mediante sequenziamento del bisolfato per determinare se la metilazione differenziale ha contribuito alla sovraregolazione di FoxP3 indotta da MTHFD2i. Sebbene diversi loci CpG differissero nella frequenza di metilazione tra il veicolo e le condizioni MTHFD2i, non vi era alcun modello distinguibile nella regione demetilata specifica delle cellule Treg (TSDR). Inoltre, non c'erano differenze tra le cellule nTreg (CD4 più CD25 più) isolate dai topi WT e CD4DMthfd2 (Figura 6F), sebbene la purezza di ciascuna popolazione arricchita fosse bassa (Figura S4B). Tuttavia, si è verificata una significativa diminuzione della frequenza di metilazione del DNA sulla regione del promotore prossimale Foxp3 nelle cellule Th17 trattate con MTHFD2i rispetto al veicolo (Figura 6G), indicando un possibile miglioramento della trascrizione con MTHFD2i.

Oltre a mantenere il pool di formiato intracellulare, l'attività di MTHFD2 contribuisce all'equilibrio redox cellulare attraverso la conversione di NAD^piùa NADH e NADP^piùa NADPH (Shin et al., 2017) e supporto della via di transsolforazione e successiva sintesi del glutatione. Le cellule Th17 trattate con MTHFD2i avevano concentrazioni ridotte di NAD^più, NADH, NADP^piùe NADPH, che è stato salvato con formiato (Figura S4C). Tuttavia, NAD^più/NADH e NADP^più/ I rapporti NADPH sono rimasti invariati in tutte le condizioni. Questo, combinato con la mancanza di cambiamento nelle specie reattive cellulari dell'ossigeno (ROS) e nel superossido mitocondriale (Figura S4D), suggerisce che è improbabile che i cambiamenti nello stato redox contribuiscano in modo importante al fenotipo MTHFD2i.

La carenza di MTHFD2 in vivo riduce la gravità di molteplici malattie infiammatorie

L'efficacia di MTHFD2 come bersaglio terapeutico è stata successivamente testata in un modello di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) dipendente dalle cellule T in vivo. I topi sono stati immunizzati e sfidati sull'orecchio con emocianina della patella del buco della serratura (KLH) per indurre l'infiammazione locale e trattati con veicolo orale o MTHFD2i. Il trattamento non ha mostrato tossicità evidente perché gli animali hanno mantenuto il loro peso (Figura S5A). È importante sottolineare che lo spessore e il peso dell'orecchio sono stati aumentati nei topi DTH di controllo ma non negli animali trattati con inibitori, indicando la protezione dall'infiammazione durante il trattamento con MTHFD2i (Figure 7A, 7B e S5B). Anche l'immunoglobulina G (IgG) specifica per KLH è stata ridotta alla dose più alta di inibitore, indicando potenziali effetti che si estendono alla funzione delle cellule B (Figura 7C).

Figura 7. Il targeting di MTHFD2 in vivo riduce la gravità della malattia nei modelli DTH, EAE e IBD

(A e B) Spessore relativo dell'orecchio (A) e peso della biopsia (B) 10 giorni dopo KLH con immunizzazione CFA e 3 giorni dopo KLH challenge per indurre DTH (ANOVA unidirezionale). I topi sono stati trattati due volte al giorno con 0, 100 o 300 mg/kg di MTHFD2i orale (media ± SEM, n {7}} replicati biologici).

(C) Concentrazioni di IgG specifiche per KLH il giorno 10 del DTH indotto da KLH (media ± SEM, test di Kruskal-Wallis, n=8 repliche biologiche).

(D) Punteggio clinico medio nel tempo nei compagni di cucciolata WT e CD4DMthfd2 immunizzati con MOG con CFA e PTX per indurre EAE (media ± SEM, test Mann-Whitney multipli, i dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti, ciascuno con 5 replicati biologici).

(E) Conteggio cellulare e frequenza delle cellule T CD4 più nel midollo spinale dei topi EAE al picco di gravità della malattia (media ± SEM, test t spaiato, i dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali).

(F) Espressione di CD25 e CD44 in CD4 più cellule T dal midollo spinale di topi EAE (media ± SEM, test t spaiato, n {3}} replicati biologici).

(G e H) Conteggio delle cellule di (G) T-bet più , RORgt più , FoxP3 più , FoxP3 più /T-bet più rapporto, FoxP3 più /RORgt più rapporto e (H) IL-17 più , IFNg più e IL-17 più IFNg più CD4 più cellule T dal midollo spinale di topi EAE (media ± SEM, test t non accoppiato, i dati sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti con 9 replicati biologici totali).

(I) Colorazione H&E, IHC anti-CD3 e Luxol Fast Blue (LFB) per la mielina nel midollo spinale di un topo WT senza immunizzazione e compagni di cucciolata WT e CD4DMthfd2 con EAE al picco della malattia (ingrandimento 2003, rappresentativo di 5 replicati biologici ).

(J) Variazione del peso corporeo nel tempo di Rag1^__/__i topi hanno iniettato ip con WT o CD4DMthfd2 naive CD4 più cellule T per indurre la colite IBD (media ± SEM, test t multipli, n=8 replicati biologici).

(K e L) Conteggio cellulare di (K) totale CD4 più linfociti T e (L) T-bet più , RORgt più e FoxP3 più CD4 più linfociti T da MLN di topi IBD (media ± SEM, test t spaiato n { {4}} repliche biologiche). Vedere anche le figure S5 e S6. I risultati statisticamente significativi sono etichettati (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" percento="">

Allo stesso modo, il doppio inibitore MTHFD1/2 LY345899 (Gustafsson et al., 2017) è stato efficace nel miglioramento della malattia in un modello EAE. L'EAE è stato indotto con MOG e PTX e i topi sono stati trattati quotidianamente con iniezione intraperitoneale (ip) di DMSO o LY345899. Il trattamento con inibitori ha portato a una significativa riduzione della gravità della malattia e del punteggio clinico cumulativo rispetto al veicolo (Figure S5C e S5D). I topi sono stati sacrificati il ​​giorno 26 e le cellule infiltranti il ​​midollo spinale sono state raccolte per il profilo immunitario. In particolare, significativamente meno CD45^più, CD4^piùe CD8^piùle cellule si sono infiltrate nel midollo spinale dei topi trattati con LY345899- (Figure S5E-S5G). Non ci sono state variazioni nella frequenza di ROR t^piùo FoxP3^piùcellule tra i CD4 infiltranti^piùCellule T (Figura S5H). Tuttavia, si è verificata una diminuzione della frequenza delle cellule IFNg più IL-17 più e un aumento delle cellule IL-17 più (Figura S5I), suggerendo un possibile passaggio a un fenotipo meno patogeno.

Per testare direttamente la dipendenza intrinseca delle cellule T da MTHFD2 in vivo, i compagni di cucciolata WT e CD4DMthfd2 sono stati sottoposti a tre diversi modelli: EAE, malattia infiammatoria intestinale (IBD) e malattia allergica delle vie aeree. L'EAE è stato nuovamente indotto con MOG e PTX e, simile all'esperimento dell'inibitore, i topi CD4DMthfd2 avevano significativamente ridotto la gravità della malattia in 26 giorni (Figura 7D). Una coorte separata è stata eutanasia al picco della malattia il giorno 15 dopo l'induzione per la fenotipizzazione delle cellule T (Figure S6A e S6B). Sebbene CD4^piùo CD8^piùLa conta delle cellule T è rimasta invariata nella milza (Figura S6C), l'infiltrazione di cellule T CD4 più nel midollo spinale è stata notevolmente ridotta (Figura 7E). Le cellule CD4 più T infiltranti il ​​midollo spinale nei topi CD4DMthfd2 avevano un'espressione CD25 simile a quella del WT ma ridotta espressione di CD44, indicando un'attivazione parzialmente compromessa (Figura 7F). I numeri di T-bet^più, le cellule ROR t plus e FoxP3 plus (Figura 7G), nonché le cellule IL-17 plus e IFNg plus (Figura 7H), sono state ridotte anche nel midollo spinale dei topi CD4DMthfd2 rispetto al WT. In particolare, i rapporti tra FoxP3 plus e T-bet plus e RORgt plus cellule erano elevati nei topi CD4DMthfd2 rispetto al WT al picco della malattia, rispecchiando i risultati in vitro dell'aumentata espressione di FoxP3 con carenza di MTHFD2 (Figura 7G). Sebbene la frequenza delle cellule che esprimono TF tra le cellule infiltranti abbia avuto una tendenza generale più alta, la frequenza dell'espressione delle citochine è rimasta invariata (Figure S6D e S6E). Istologia del midollo spinale di topi di controllo senza EAE e WT e CD4^ΔMthfd2i topi con EAE hanno mostrato una maggiore cellularità e positività CD3 nel midollo spinale nei topi WT che era associata alla demielinizzazione, come mostrato dalla colorazione Luxol Fast Blue (Figura 7I). Questi cambiamenti erano assenti nel controllo no-EAE e nel CD4^ΔMthfd2topi.

Il ruolo di MTHFD2 è stato successivamente testato in modelli di IBD e malattie delle vie aeree allergiche. WT e CD4DMthfd2 naive CD4 plus cellule T sono state trasferite a Rag1 / destinatari per avviare IBD. Sebbene i topi che hanno ricevuto cellule WT abbiano iniziato a perdere peso con il progredire dell'IBD, i destinatari di cellule T CD4DMthfd2 hanno continuato ad aumentare di peso (Figura 7J). Significativamente meno numeri e frequenze di cellule T CD4DMthfd2 sono stati trovati nella milza (Figura S6F) e nei linfonodi mesenterici (MLN) che drenano il colon (Figure 7K e S6G). Anche il numero di cellule T-bet plus, ROR t plus e FoxP3 plus CD4DMthfd2 è diminuito negli MLN, ma la frequenza delle cellule FoxP3 plus è stata aumentata (Figure 7L e S6H). Tuttavia, non c'erano differenze nei rapporti di conteggio delle cellule FoxP3/T-bet e FoxP3/RORgt negli MLN in questo momento della fase avanzata (Figura S6I). Simile ai risultati di MTHFD2 come un modesto successo nello schermo CRISPR dell'infiammazione delle vie aeree in vivo (Figura 1C), i topi CD4DMthfd2 soggetti a malattia allergica delle vie aeree indotta da Alternaria avevano una tendenza alla diminuzione dell'abbondanza di neutrofili nel liquido di lavaggio bronchioalveolare (BALF), sebbene non sono state osservate modifiche nella conta dei linfociti BALF, degli eosinofili e dei macrofagi (Figura S7A).

Infine, l'effetto dell'MTHFD2i è stato testato sull'attività immunitaria generale. OT-II CD45.2 specifico per OVA^piùCD4^piùLe cellule T sono state trasferite adottivamente in CD45.1^piùtopi, che sono stati quindi immunizzati per via sottocutanea con un'emulsione di OVA con adiuvante di Freund (CFA) completo e trattati quotidianamente con veicolo orale o MTHFD2i. Il peso corporeo è rimasto invariato in tutte le condizioni (Figura S7B). Espansione dell'OT-II CD45.2 trasferito^piùle cellule sono state leggermente ritardate nei topi immunizzati trattati con MTHFD2i ma hanno raggiunto il numero di veicoli entro il giorno 7 (Figure S7C-S7E). Tuttavia, la frequenza delle cellule IFNg plus è stata ridotta nei LN drenanti (Figura S7F). Questi dati mostrano che il trattamento in vivo con MTHFD2i consente l'espansione delle cellule T antigene-specifiche dopo la stimolazione acuta, sebbene con una produzione di citochine infiammatorie smorzata.

DISCUSSIONE

L'attivazione, la differenziazione e la funzione dei linfociti T richiedono un'appropriata riprogrammazione metabolica per soddisfare la maggiore richiesta delle cellule di energia, blocchi biosintetici e molecole di segnalazione. In questo studio, abbiamo studiato la funzione del metabolismo 1C nei linfociti T primari CD4 più. Utilizzando una combinazione di screening in vivo basato su CRISPR delle cellule T primarie e dati sull'espressione genica, MTHFD2 è stato identificato come un potenziale bersaglio per terapie antinfiammatorie. L'inibizione o carenza di MTHFD2 generalmente portava a una diminuzione della proliferazione delle cellule T CD4 più. In particolare, questo era associato all'induzione dell'espressione di FoxP3 e alla funzione soppressiva nelle cellule Th17, nonché a una maggiore differenziazione delle cellule Treg. Questi dati suggeriscono che MTHFD2 può funzionare come checkpoint metabolico nell'asse delle cellule Th17-Treg, con il trattamento MTHFD2i che cuce l'equilibrio da un fenotipo patogeno a uno più antinfiammatorio. In effetti, l'inibizione di MTHFD2 o il deficit genetico ha migliorato la gravità della malattia in molteplici modelli in vivo di autoimmunità e ipersensibilità.

Il metabolismo 1C consiste nel metabolismo della serina-glicina, nel ciclo dei folati e nel ciclo della metionina ed è centrale in diversi processi, tra cui la sintesi de novo delle purine, la generazione di donatori di metile e la regolazione redox (Yang e Vousden, 2016). Il metabolismo dell'1C è fortemente impegnato con la stimolazione del TCR (Tan et al., 2017) e richiesto per supportare l'espansione delle cellule T (Ma et al., 2017). Il ciclo dei folati è compartimentato in componenti citosolici e mitocondriali. Nel citosol, MTHFD1 converte 5,10-metileneTHF, 10-formilTHF e formiato. Nei mitocondri, le stesse reazioni sono compiute da MTHFD2 e MTHFD1L. Questi intermedi risultanti vengono utilizzati per supportare le fasi di formilazione nella sintesi delle purine de novo. MTHFD1 e MTHFD2 possono anche modulare lo stato redox attraverso la generazione di NAD(H) e NADP(H) (Ducker e Rabinowitz, 2017). Sebbene alcuni tipi cellulari mostrino flessibilità nel passare alla sorgente citosolica in condizioni di disfunzione della via mitocondriale (Ducker et al., 2016), in precedenza è stato proposto che le cellule T dipendessero principalmente dalla via mitocondriale per fornire unità 1C e specie riduttive (Ron- Harel et al., 2016). È stato anche dimostrato che le cellule T si basano sull'assorbimento della serina e le risposte immunitarie in vivo possono essere modulate dalle quantità di serina nella dieta. Gli effetti della fame di serina sono mediati limitando la biosintesi delle purine anche in presenza di percorsi di salvataggio intatti e possono essere aggirati fornendo glicina e formiato (Ma et al., 2017). I nostri dati si aggiungono a questi risultati e indicano MTHFD2 come un regolatore critico che influenza il CD4^piùProliferazione e differenziamento dei linfociti T.

Echanicoside

Sebbene il metabolismo 1C svolga un ruolo ampio nel metabolismo cellulare, abbiamo scoperto che alcune funzioni erano distinte per selezionare sottoinsiemi di cellule T. Tutte le cellule T umane e murine hanno proliferato in misura minore con carenza di MTHFD2, indicando una funzione condivisa per MTHFD2 per supportare la crescita e la divisione delle cellule T. Gli effetti della carenza di MTHFD2 sulla differenziazione dei linfociti T e sulla funzione effettrice, tuttavia, differivano in ciascun sottoinsieme testato. Le cellule Th1 hanno mostrato una differenziazione alterata con ridotta induzione di T-bet e ridotta produzione di citochine. Le cellule Th17 avevano anche una differenziazione alterata e una ridotta produzione di citochine. Sebbene ROR t non fosse alterato, le cellule Th17 carenti di MTHFD2- hanno sovraregolato la cellula Treg TF FoxP3 e hanno acquisito la capacità di sopprimere la proliferazione delle cellule T CD8 più attivate. Le cellule Treg hanno mostrato una maggiore differenziazione in condizioni di TGF-b basso. È ormai accertato che ciascuno di questi sottoinsiemi può avere requisiti metabolici distinti (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). I nostri dati mostrano che MTHFD2 è richiesto selettivamente anche per le cellule Teff promuovendo il destino e la funzione delle cellule Treg. È da notare che questi risultati differiscono dalle carenze di GLUT1, GLS o ASCT2 che alterano o alterano la differenziazione delle cellule Teff pur avendo effetti modesti per promuovere direttamente la differenziazione delle cellule Treg o la transdifferenziazione delle cellule Th17 in Treg (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya et al., 2014).

Questi destini distinti delle cellule T sembrano dipendere dall'attività enzimatica di MTHFD2 perché gli effetti della carenza di MTHFD2 sono stati salvati con formiato o nucleobasi puriniche. Sebbene non abbiamo riscontrato alcun effetto significativo dell'equilibrio redox alterato con carenza di MTHFD2, la sintesi delle purine de novo alterata sembra essere fondamentale. Il trattamento con MTHFD2i ha portato a una diminuzione delle concentrazioni di purine, in particolare di guanina, mentre induceva l'accumulo degli intermedi di sintesi delle purine GAR, SAICAR e AICAR. Questi intermedi richiedono la formilazione per un'ulteriore biosintesi e gli effetti sono stati salvati quando il metabolita formiato derivato da MTHFD2- è stato aggiunto al mezzo, supportando un meccanismo biochimico mirato per MTHFD2i. La sintesi de novo di nucleotidi per supportare la sintesi di DNA e RNA è essenziale per la proliferazione delle cellule T (Que´ me´ neur et al., 2003, 2004). Pertanto, una componente del meccanismo mediante il quale l'MTHFD2i compromette l'espansione delle cellule T sembra essere una generazione insufficiente di nucleotidi.

Flavonoide

La mancata sintesi di nucleotidi adeguati può sopprimere le cellule T effettrici attraverso molteplici meccanismi. AMPK e mTORC1 sono i principali motori della riprogrammazione metabolica con ruoli generalmente opposti nelle cellule Teff e Treg (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Mostriamo che il trattamento con MTHFD2i nelle cellule T ha portato all'accumulo acuto di AICAR, un metabolita noto come analogo dell'adenosina e attivatore di AMPK (Rae and Mairs, 2019; Su et al., 2019). Tuttavia, non c'erano prove di un aumento dell'attività AMPK nei punti temporali selezionati. Ciò può riflettere un'ulteriore regolazione dell'AMPK, ma AICAR può anche avere effetti indipendenti dall'AMPK (Dembitz et al., 2019). mTORC1 è anche sensibile alle concentrazioni di purine perché la ridotta disponibilità di guanina sopprime l'attività dell'attivatore mTORC1 Rheb (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). L'accumulo e la riduzione di AICAR nell'attività di mTORC1 possono quindi contribuire a una ridotta generazione di cellule Th1 e Th17 trattate con MTHFD2i e a una maggiore generazione di cellule Treg. La soppressione della segnalazione di mTORC1 può anche contribuire allo spostamento del programma metabolico dalla glicolisi alla respirazione mitocondriale e all'abbondanza alterata del metabolita del TCA nelle cellule Th17 trattate con MTHFD2i. La via mTORC1 svolge un ruolo centrale nella promozione del metabolismo anabolico e può guidare l'accumulo di TF ATF4, che, a sua volta, può indurre l'espressione di MTHFD2 (Ben-Sahra et al., 2016).

Il flusso metabolico è legato alla regolazione epigenetica perché i metaboliti contribuiscono a molte modificazioni epigenetiche (Sharma e Rando, 2017), incluso il metabolismo 1C per generare il donatore di metile universale S-adenosil metionina (SAM) per la metilazione di proteine ​​e DNA. Gli esperimenti di tracciamento del carbonio nelle cellule T attivate, tuttavia, suggeriscono che le unità 1C derivate dalla serina esogena e derivata dal glucosio non contribuiscono in modo significativo al ciclo e alla metilazione della metionina (Ma et al., 2017). Il flusso metabolico può anche influenzare i modelli di metilazione attraverso cambiamenti nell'abbondanza dei metaboliti del TCA, inclusi alfa-chetoglutarato, fumarato e succinato. In particolare, fumarato e succinato inibiscono le demetilasi del DNA e dell'istone (Su et al., 2016). Coerentemente con l'esaurimento di questi metaboliti nelle cellule Th17 trattate con MTHFD2i, H3K27me3 è stato ampiamente ridotto in tutto il genoma e la metilazione del DNA è stata ridotta specificamente al promotore prossimale Foxp3, che potrebbe contribuire al fenotipo di transdifferenziazione. Il fenotipo di transdifferenziazione delle cellule Th17 non è stato salvato dall'integrazione di formiato, indicando che è probabile che ulteriori percorsi contribuiscano alla regolazione di FoxP3, ad esempio attraverso l'attività di altri meccanismi di rilevamento della concentrazione di nucleotidi

Acteoside (Verbascoside)

È stato anche segnalato che MTHFD2 svolge ruoli non enzimatici che possono contribuire alle azioni pro-infiammatorie di questo enzima. Nelle cellule tumorali, MTHFD2 può avere funzioni nucleari, co-localizzandosi con i siti di replicazione del DNA per promuovere la progressione del ciclo cellulare (Gustafsson Sheppard et al., 2015). Nelle cellule staminali murine, è stato dimostrato che MTHFD2 modula la riparazione del DNA per mantenere la stabilità genomica (Yue et al., 2020). Nel carcinoma a cellule renali, MTHFD2 si è rivelato cruciale per la riprogrammazione metabolica tramite la metilazione dell'mRNA (Green et al., 2019). Sebbene questi ruoli per MTHFD2 non si escludano a vicenda con i nostri risultati, la capacità del formiato di salvare molti dei fenotipi della carenza di MTHFD2 nelle cellule T suggerisce che l'attività enzimatica di MTHFD2 è il driver principale della proliferazione e del destino delle cellule T.

MTHFD2 è stato in gran parte considerato un bersaglio farmacologico in contesti antitumorali. Può anche essere un promettente bersaglio antinfiammatorio e offrire meno effetti avversi rispetto agli antifolati attualmente disponibili, data la bassa espressione nella maggior parte dei tessuti adulti. Ad esempio, un target di MTX, DHFR, è ampiamente espresso nei tessuti adulti (Nilsson et al., 2014). Pertanto, MTX può essere associato a una varietà di effetti avversi, inclusa la tossicità gastrointestinale. Inoltre, il meccanismo d'azione di MTX rimane poco compreso nonostante la sua vasta storia (Cronstein e Aune, 2020). L'espressione altamente regolata di MTHFD2 e il potenziale di ridondanza con il percorso citosolico MTHFD1 possono comportare una dipendenza selettiva di specifiche popolazioni cellulari da MTHFD2. I nostri risultati identificano MTHFD2 come un punto di controllo metabolico critico in CD4^piùcellule T. Sebbene vi sia un'ampia sovrapposizione tra la biologia delle cellule tumorali e la biologia delle cellule T in rapida proliferazione, troviamo che i sottoinsiemi di cellule T CD4 più mostrano una sensibilità aggiuntiva attraverso la modulazione della differenziazione e della funzione cellulare. È probabile che il targeting dell'MTHFD2 nelle terapie contro il cancro possa limitare l'immunità antitumorale. Tuttavia, impostazioni come il carcinoma colorettale, in cui l'infiammazione mediata dalle cellule Th17 contribuisce alla malattia, possono essere adatte a MTHFD2is. La sensibilità delle cellule T a MTHFD2is può essere una forma efficace di immunoterapia in contesti di CD4^piùL'infiammazione guidata dai linfociti T oltre il cancro e porta a un minor numero di effetti avversi rispetto agli agenti terapeutici attualmente disponibili.

Limiti di studio

L'MTHFD2i utilizzato in questo studio ha un valore IC50 di 0.0063 mM per MTHFD2 e 0,57 mM per MTHFD1; pertanto, non possono essere esclusi effetti fuori bersaglio minori della doppia inibizione di MTHFD2 e MTHFD1. Dato che la sovraregolazione aberrante di FoxP3 nelle cellule Th17 non è stata salvata dalla fornitura di formiato ma l'attività di mTORC1 lo era, il meccanismo alla base di questo fenotipo richiede ulteriori indagini. Inoltre, tutti i modelli in vivo sono stati eseguiti con trattamento MTHFD2i o ablazione genetica dal momento dell'induzione della malattia e la fenotipizzazione delle cellule T è stata eseguita in un unico momento. Per caratterizzare meglio l'effetto della carenza di MTHFD2 sulla patogenesi della malattia, ulteriori studi dovrebbero includere esperimenti nel corso del tempo con caratterizzazione seriale delle popolazioni di cellule T per determinare in modo più definitivo se i sottogruppi di cellule T CD4 più sono influenzati in modo differenziale in vivo. Infine, per migliorare la rilevanza di questo studio per le applicazioni cliniche, dovrebbe essere testata l'efficacia del trattamento con MTHFD2i iniziato dopo l'esordio della malattia.

STAR★METODI

I metodi dettagliati sono forniti nella versione online di questo documento e includono quanto segue:

• TABELLA DELLE RISORSE CHIAVE

• DISPONIBILITA' DELLE RISORSE

• B Contatto di piombo

• B Disponibilità dei materiali

• B Disponibilità di dati e codici

  
  

• MODELLO SPERIMENTALE E DETTAGLI OGGETTO

• B Topi B Cellule T umane

• Linee cellulari B

  
  

• DETTAGLI DEL METODO

• B CD4 di topo in vitro^piùAttivazione e differenziazione dei linfociti T

• B Test di soppressione delle cellule Th17

• B CD4 umano in vitro^piùCondizioni di coltura dei linfociti T

• B Screening CRISPR B Metabolomica della spettrometria di massa

• B Spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica (1H-MRS)

• B Immunoblotting

• B CUT&RUN B EpigenDx Sequenziamento di bisolfito di nuova generazione mirato

• B Modelli EAE in vivo per IHC e citometria a flusso

• B Trattamento in vivo LY345899 nel modello EAE

• B Trattamento in vivo DS18561882 nel modello DTH B Modello IBD in vivo con WT e CD4^ΔMthfd2compagni di cucciolata

• B Modello di malattia allergica delle vie aeree in vivo con WT e CD4^ΔMthfd2compagni di cucciolata

• B Trattamento in vivo DS18561882 nel modello di immunizzazione con OVA

  
  

• QUANTIFICAZIONE E ANALISI STATISTICA

INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI

Ulteriori informazioni possono essere trovate online su https://doi.org/10.1016/j. immuni.2021.10.011.

RINGRAZIAMENTI

Ringraziamo i membri del laboratorio Rathmell per aver contribuito a questo progetto. Ringraziamo Thomas Aune per aver fornito dati RNA-seq e J. Cools (VIB) per aver fornito il costrutto pMx-U6-gRNA-GFP. Ringraziamo Max R. Van Belkum per aver progettato i primer qPCR MTHFD2. Ringraziamo Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman e Mark Manfredi di Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) per aver fornito il composto Raze 1459, che è stato utilizzato per corroborare i risultati (dati non mostrati). I diagrammi sono stati creati con BioRender. Riconosciamo la risorsa condivisa per la patologia traslazionale, supportata dalla concessione di supporto NCI/NIH Cancer Center 5P30 CA68485-19 e dalla concessione di strumentazione condivisa S10 OD023475-01A1, per Leica Bond RX. Questo lavoro è stato sostenuto dal William E. Paul Distinguished Innovator Award per la Lupus Research Alliance (a JCR), R01s DK105550 (a JCR), HL136664 (a JCR e DCN), CA217987 (a JCR), AI153167 (a JCR), AI137075 (per AKM), T32 DK101003 (KV) e T32 GM007347 (per AS).

CONTRIBUTI D'AUTORE

AS, GA e JCR hanno progettato la ricerca. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB e JCG-C. effettuato la ricerca. Dati analizzati AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR e JCR. AS e JCR hanno scritto il documento con i contributi degli altri autori.

DICHIARAZIONE DI INTERESSI

JCR è un fondatore, membro del comitato di consulenza scientifica e azionista di Sitryx Therapeutics; un membro del comitato consultivo scientifico e azionista di Caribou Biosciences; un membro del comitato scientifico di NirogyTherapeutics; si è consultato per Merck, Pfizer e Mitobridge negli ultimi 3 anni; e ha ricevuto supporto per la ricerca da Incyte Corp., CalitheraBiosciences e Tempest Therapeutics. JDR è co-fondatore e azionista di Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics e Farber Partners e consulente e azionista di Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, Barer Institute e LEAF Pharmaceuticals; ha ricevuto onorari di consulenza e finanziamenti per la ricerca da Pfizer e Rafael ed è l'inventore dei brevetti detenuti dall'Università di Princeton. AMC, PF e TB sono dipendenti di Sitryx Therapeutics.

INCLUSIONE E DIVERSITÀ

Abbiamo lavorato per garantire l'equilibrio sessuale nella selezione dei soggetti non umani. Uno o più degli autori di questo articolo si autoidentifica come una minoranza etnica sottorappresentata nella scienza. Pur citando riferimenti scientificamente rilevanti per questo lavoro, abbiamo anche lavorato attivamente per promuovere l'equilibrio di genere nel nostro elenco di riferimento. L'elenco degli autori di questo documento include contributori dal luogo in cui è stata condotta la ricerca che hanno partecipato alla raccolta dei dati, alla progettazione, all'analisi e/o all'interpretazione del lavoro.

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STAR★METODI

TABELLA DELLE RISORSE CHIAVE

DISPONIBILITA' DELLE RISORSE

Contatto di piombo

Ulteriori informazioni e richieste di risorse e reagenti devono essere indirizzate e saranno soddisfatte al completamento dell'appropriato MTA da parte del contatto principale, il dottor Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org).

Disponibilità dei materiali

I plasmidi e le linee di topo generati in questo studio saranno resi disponibili al completamento di un MTA appropriato su richiesta.

Disponibilità di dati e codici

I dati di sequenziamento CUT&RUN sono stati depositati presso GEO e sono pubblicamente disponibili alla data di pubblicazione (GSE180356). I dati della microscopia e le immagini western blot originali riportate in questo documento saranno condivisi dal contatto principale su richiesta. Eventuali informazioni aggiuntive necessarie per rianalizzare i dati riportati in questo documento sono disponibili al contatto principale su richiesta.

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