Imaging multicolore delle proteine che legano il calcio nei calcoli renali umani per chiarire gli effetti delle proteine sulla crescita dei cristalli
Mar 21, 2022
Renela malattia dei calcoli è un disturbo comune, che colpisce l'1,7-14,8% della popolazione almeno una volta nella vita1,2. Fino al 50% dei casi, questa malattia si ripresenta entro 5 anni dal primo episodio. Nonostante l'importanza di questo problema di salute, la terapia preventiva per la formazione di calcoli non è disponibile. Comprendere la patogenesi direnela formazione di calcoli è essenziale per ridurre l'occorrenza e il ripetersi direnemalattia della pietra3. Circa l'80 per cento direnei calcoli sono calcoli di ossalato di calcio (CaOx)4,5. I calcoli di CaOx erano costituiti da circa il 90 percento di fase minerale, ovvero CaOx che è ulteriormente classificato in ossalato di calcio monoidrato [Ca(C2O4)·H2O](COM) e ossalato di calcio diidrato [Ca(C2O4)·2H2O](COD) e una frazione relativamente piccola di materia organica, che è stata considerata Department of Nephro‑Urology, Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University, 1‑Kawasumi, Mizuho‑cho, Mizuho‑Ku, Nagoya 467‑{12}}, Giappone . 2Institute for Advanced Co‑Creation Studies, Osaka University, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Giappone. 3Scuola di specializzazione in ingegneria, Università di Osaka, 2‑1, Yamadaoka, Suita 565‑0871, Giappone. 4Scuola di specializzazione in scienze della vita e dell'ambiente, Università della prefettura di Kyoto, 1‑5, Hangi‑cho, Shimogamo, Sakyo‑ku, Kyoto, Kyoto 606‑8522, Giappone. 5Dipartimento di Scienze della Terra, Università di Tohoku, 6‑3 Aza‑Aoba, Aramaki, Aoba‑ku, Sendai 980‑8578, Giappone. 6 Museo Nazionale della Natura e della Scienza, 4‑1‑1 Amakubo, Tsukuba 305‑0005, Giappone. 7Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217‑14, Hayashi‑cho, Takamatsu, Kagawa 761‑0395, Giappone. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3‑1‑11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577‑0849, Giappone. 9Institute of Laser Engineering, Osaka University, 2‑6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565‑0871, Giappone. *E-mail: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-{59}}-cu.ac.jp
Parole chiave:rene; calcolo renale; malattie renali; renale; fisiologia renale
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come matrice proteica6. La patogenesi direnela formazione di calcoli comprende processi a più fasi che coinvolgono interazioni complesse tra componenti minerali e matrice proteica7,8. Sono state identificate più di 100 specie di proteinerenepietre9–11. Tra questi, è noto che diverse proteine, in particolare quelle leganti il calcio, svolgono ruoli essenziali nei processi di formazione di calcoli CaOx12-16. Gli effetti specifici di queste proteine sono stati studiati intensamente in molte fasi della formazione della pietra, inclusa la nucleazione dei cristalli, la crescita dei cristalli, l'aggregazione dei cristalli e l'adesione dei cristalli, con numerosi studi di cristallizzazione in vitro17–19. Gli studi in vitro sono utili per valutare gli effetti di specifiche proteine sulle fasi specifiche della formazione dei calcoli. Tuttavia, negli ambienti di formazione di calcoli reali, il numero di proteine funziona simultaneamente e la composizione dell'urina nelle concentrazioni di proteine, ioni calcio e ossalato fluttua. Questa preoccupazione ci ha motivato a indagare sul vero essere umanorenepietre per trovare i reali effetti delle proteine sulla crescita dei cristalli. Nella maggior parte degli studi precedenti, l'identificazione delle proteine inrenele pietre sono state condotte con la spettroscopia di massa dopo la frantumazione e l'estrazione9–11. Pertanto, le informazioni sulla distribuzione spaziale delle proteine nella pietra vengono perse. In indagini molto limitate, l'identificazione delle proteine inrenecalcoli è stato condotto con sezioni affettate di calcoli renali in cui i cristalli di CaOx sono completamente rimossi mediante decalcificazione20,21. Questo approccio è utile per trovare la distribuzione di una proteina inrenecalcoli che potenzialmente aiutano a comprendere gli effetti proteici specifici sulla formazione di calcoli. Tuttavia, un'enorme quantità di informazioni sulla formazione di pietra, registrata inrenecristalli di pietra, si perde in questo metodo. L'importanza delle informazioni minerali dei calcoli renali che possono essere acquisite mediante l'identificazione delle fasi cristalline e le classificazioni della struttura cristallina condotte utilizzando sezioni di fette e sezioni sottili levigate direnepietre con microscopia ottica è stato dimostrato da più di 70 anni di studi precedenti22,23.
L'assenza dell'analisi per valutare le distribuzioni proteiche con cristalli di CaOx incontaminati inrenepietre è stato un notevole ostacolo per la comprensione della formazione della pietra. La valutazione coordinata delle distribuzioni proteiche e delle fasi/morfologie cristalline può fornire informazioni significative sulla storia della formazione dei calcoli. La colorazione a immunofluorescenza multipla (colorazione multi-IF) è stata utilizzata per mostrare la distribuzione di due o più proteine in molti tipi di tessuti molli di campioni biologici24. L'applicazione della tecnica ai tessuti ossei, che sono composti da cristalli porosi di fosfato di calcio, ha anche fornito informazioni significative sulla regolazione dinamica dell'omeostasi minerale ossea25. Tuttavia, questo non è stato utilizzato per indagarerenepietre composte da cristalli densi e duri, sebbene sia stata utilizzata una singola colorazione di immunofluorescenza per mostrare la distribuzione di una proteina specifica in decalcificazionerenepietre che non conservano informazioni minerali20,21. Questo studio ha studiato le condizioni che consentono la colorazione multi-IF direnecampioni di pietra per conservare le informazioni minerali originali. Abbiamo studiato la distribuzione di tre diverse proteine, osteopontina (OPN),renaleframmento di protrombina 1 (RPTF-1) e calgranulina A (Cal-A), in sezioni sottili di calcoli CaOx. Queste proteine sono comuni nella maggior parte dei calcoli di CaOx e sono note come proteine che legano il calcio che potenzialmente influenzano la formazione di calcoli di CaOx26–28. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio in cui più proteine della matrice sono co-visualizzate in arenecalcolo. Interpretiamo ulteriormente i diversi effetti in vivo di ciascuna proteina sulla crescita dei cristalli di CaOx in base alle loro distribuzioni, proprietà fisico-chimiche e ai complessi cambiamenti dell'ambiente fisico di ciascuna proteina durante la formazione di calcoli di CaOx.
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Risultati
Sulla base dell'osservazione microscopica accoppiata con l'analisi FT-IR, i domini delrenei campioni di pietra sono stati classificati in tre tipi di tessitura coerenti con quanto riportato in Schubert e Brien23: tessitura irregolare composta da cristalli di COD euedrico (Tipo 1, indicato come aggregato di COD euedrico; Fig. 1c), tessitura a mosaico composta da COM ad orientamento irregolare cristalli (Tipo 2, denominato COM mosaico; Fig. 1f) e cristalli COM laminati concentricamente (Tipo 3, denominato COM concentrico; Fig. 1i). La maggior parte dei campioni di pietra CaOx osservati consisteva in queste tre strutture (Tabella 1). Il protocollo di colorazione Multi-IF utilizzato per i campioni biologici è stato applicato all'analisi di sezioni sottili direnecampioni di pietra preparati con un tipico metodo geologico. Per l'applicazione, la condizione di mordenzatura della sezione sottile prima della colorazione è stata regolata ed è stato riscontrato che la visualizzazione ha avuto successo solo quando la sezione sottile lucidata è stata leggermente mordenzata (con una soluzione di citrato a pH 6.{1}} per 1 minuto ) prima del tipico processo di colorazione. La colorazione multi-IF ha consentito la co-visualizzazione di tre proteine in diversi colori (OPN: verde, RPTF-1: blu e Cal-A: rosso) nelle tre diverse trame di pietra.
Abbiamo scoperto che ogni proteina mostrava un modello di distribuzione caratteristico a seconda della sua posizione in COM e COD. Sono stati trovati aggregati di COD euedrico in 7 campioni su 15 (Tabella 1). Gli aggregati tetraedrici di COD erano presenti prevalentemente alla periferia di CaOxrenepietre (Fig. 1a–c). È noto che i cristalli di Tese COD hanno una forma bipiramide tetragonale composta da {101} facce29. Molte delle bipiramidi COD hanno anche {110} faccia sulla punta di entrambe le piramidi (Fig. 2b e Fig. S1 supplementare). Un'immagine di colorazione multi-IF dei cristalli di COD è mostrata in Fig. 2a e OPN si presenta periodicamente sulla faccia {110} di COD, come mostrato dalle frecce bianche in Fig. 2c. Questa faccia è la stessa faccia della punta bipiramidica che non compare nella tipica crescita dei cristalli COD in vitro29. RPTF-1 è apparso come strati paralleli lungo la faccia {101}, con intervalli di µm, come mostrato dalla freccia gialla in Fig. 2d. Questa faccia cristallina è caratteristica della tipica crescita del COD29. Cal-A era presente al di fuori dei cristalli COD, senza mostrare alcun adsorbimento preferenziale su facce specifiche (Fig. 2e). Gli stessi schemi di distribuzione sono stati osservati in altri campioni di pietra (Figura complementare S2). La texture COM del mosaico è la texture più prevalente nelle pietre CaOx (Fig. 1d–f). Questa trama è stata osservata in 12 campioni su 15 (Tabella 1). La colorazione multi-IF del mosaico COM è mostrata in Fig. 3a, b. OPN e RPTF-1 erano presenti in tutti i cristalli COM (Fig. 3c, d). Al contrario, Cal-A era presente esclusivamente lungo i bordi dei grani (cioè sulle superfici dei grani COM) (Fig. 3e). Abbiamo ulteriormente analizzato un profilo di intensità di linea delle proteine, come mostrato in Fig. 3a, per valutare in dettaglio ciascun modello di distribuzione delle proteine (linea gialla in Fig. 4a). OPN e RPTF-1 hanno mostrato intensità più elevate nell'area cristallina, mentre Cal-A ha mostrato un'intensità inferiore nell'area
area cristallina (Fig. 4b). L'elevata intensità di Cal-A è stata osservata esclusivamente lungo i confini del cristallo. Queste distribuzioni proteiche sono state osservate in molti campioni, sebbene le dimensioni e le forme dei grani COM differissero (Figura complementare S3). Il COM concentrico è anche una trama tipica nelle pietre CaOx (Fig. 1g–i). Abbiamo trovato questa texture in 10 campioni su 15 (Tabella 1). OPN, RPTF-1 e Cal-A sono stati distribuiti in strati concentrici (Fig. 5a). OPN e RPTF-1 erano presenti come strati costanti e regolari in tutti i cristalli COM, creando un intervallo di scala µm (Fig. 5b, c). Al contrario, la distribuzione Cal-A era composta da strati irregolari e ad intervalli relativamente ampi situati nella superficie esterna della pietra (Fig. 5d). L'osservazione SEM ha mostrato uno strato di gap vicino a ciascuno strato Cal-A (Fig. 6a, b). Entrambe le superfici che creavano lo spazio vuoto erano occupate da minuscoli depositi chiaramente distinti dai principali cristalli COM che componevano il COM concentrico (Fig. 6c, d). I profili di intensità della linea di queste proteine nella COM concentrica hanno mostrato picchi in ciascun profilo proteico (Fig. 4c, d). I profili di OPN e RPTF-1 erano simili (vale a dire, 5,58±2,70 µm/strato di OPN e 5,99±2,56 µm/strato di RPTF-1) (Tabella Supplementare S1). Tuttavia, i livelli Cal-A avevano intervalli notevolmente ampi (cioè 23,17±18,57 µm/strato) rispetto a OPN e RPTF-1. Modelli e intervalli di distribuzione simili sono stati osservati nella maggior parte degli altri 9 campioni, sebbene lo strato Cal-A non sia stato visto in alcuni campioni (Figura complementare S4 e Tabella S1).
In questo studio, le proporzioni delle tre strutture nelle pietre CaOx e le distribuzioni delle tre proteine nelle tre strutture non avevano una chiara relazione con l'età e il sesso della pietra prima, sebbene la quantità delle pietre studiate non fosse sufficiente per l'analisi di correlazione . È noto che OPN, RPTF{0}} e Cal-A sono presenti nei calcoli di CaOx in base al rilevamento degli estratti di polveri di pietra con elettrolisi9–11. Le distribuzioni su microscala di OPN nei calcoli di CaOx decalcificanti con tecnica immunocitochimica hanno mostrato distribuzioni di OPN nelle lamelle concentriche nei calcoli di CaOx21,30. Il presente metodo ha visualizzato vividamente le posizioni di tre diverse proteine in "strati organici" precedentemente considerati (Fig. 7a, b). Il modello di distribuzione di OPN che mostriamo nel presente studio nella COM concentrica è coerente con le osservazioni precedenti. Abbiamo inoltre scoperto che il modello di distribuzione di RPTF-1 nella COM concentrica è quasi lo stesso di quello di OPN, mentre la distribuzione di RPTF-1 nei cristalli di COD è diversa da quella di OPN. Al contrario, il modello di distribuzione di Cal-A è completamente diverso dalle altre due proteine. Queste diverse distribuzioni su microscala di OPN, RPTF-1 e Cal-A registrano la storia della formazione di calcoli di CaOx.
Discussione
Il principale fattore di controllo dell'incorporazione delle proteine nei cristalli.Sia OPN che RPTF{{0}} erano presenti nei cristalli di COD euedrico, nei grani COM del mosaico e nel COM concentrico (Figg. 2a, 3a e 5a). Questa scoperta conferma che queste proteine sono incorporate sia nei cristalli di COD che in COM. Cal-A era presente all'esterno dei cristalli di COD euedrico e attorno ai grani COM del mosaico (Figg. 2e e 3e). Nel caso COM concentrico, uno spazio vuoto che si trova tipicamente attorno agli strati Cal-A suggerisce che gli strati Cal-A non sono inclusi nei cristalli ma distribuiti sulla superficie dei cristalli (Figg. 5d e 6a–d). Queste distribuzioni indicano che OPN e RPTF-1 tendono ad essere incorporati nei cristalli di CaOx, mentre Cal-A è difficilmente incorporato. L'adsorbimento e l'incorporazione delle proteine nei cristalli di CaOx sono teoricamente influenzati dalla forza di legame delle loro catene laterali di amminoacidi e da altre proprietà specifiche delle rispettive proteine come la carica elettrostatica negativa31,32. La carica netta indica che OPN e RPTF-1 hanno una carica più negativa di Cal-A, con punti isoelettrici di OPN, RPTF-1 e Cal-A di 3,5, 2,5–3.{{28} }, e 6,5–7,0, rispettivamente33–35. Te OPN, RPTF-1 e Cal-A sono noti per avere domini di legame del calcio36–38. Questi domini possono inoltre funzionare come siti di legame locale per le superfici cristalline in crescita. I domini leganti il calcio di OPN, RPTF-1 e Cal-A possono legare rispettivamente 10, 7 e 2 ioni calcio36–38. Quindi, la massa e le affinità locali di queste proteine con il Ca caricato positivamente sulla superficie di CaOx causano la diversa efficienza di incorporazione di queste proteine in CaOx, la crescita dei cristalli procede incorporando unità di crescita in passaggi e siti di piega che appaiono sulle superfici cristalline39,40 . La compatibilità albero-dimensionale tra le proteine e le superfici cristalline in crescita determinerebbe
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il grado di incorporazione delle proteine nella superficie del cristallo. Le proteine con una forte capacità di legame ai siti e ai passaggi di kink in crescita tendono ad essere incorporate nel cristallo in crescita in modo più efficiente41–43. Le distribuzioni attualmente riportate e le affinità di calcio delle tre proteine suggeriscono che la forte affinità di OPN e RPTF-1 facilita il legame e l'incorporazione nei cristalli di COD e COM. Al contrario, Cal-A, che ha un'affinità inferiore, aderisce solo alla superficie del cristallo ma non è incorporato nel cristallo. Uno studio precedente che ha mostrato tassi più elevati di incorporazione di peptidi nella COM da parte di più peptidi fosforilati supporta questa spiegazione43. Queste discussioni ci permetterebbero di prevedere la distribuzione di molte altre proteine in base alle loro proprietà di legame del calcio.
Assorbimento selettivo in vivo ed effetti inibitori di OPN e RPTF‑1 sulla crescita dei cristalli di CaOx.Si è ritenuto che i cristalli di COD euedrico presenti prevalentemente alla periferia della pietra CaOx crescano con una caratteristica tessitura laminata in cui il cosiddetto "strato di materia organica" e lo "strato minerale" si alternano durante la crescita dei cristalli44,45. Sebbene le ragioni esatte alla base dello spostamento dello strato rimangano poco chiare, le potenziali spiegazioni includono i cambiamenti ambientali nell'ospite umano,renefisiologia e cambiamenti biochimici delle urine e meccanismi di feedback cinetico che formano strutture di zonazione oscillatoria che si trovano nei minerali8. I risultati attuali mostrano che OPN e RPTF-1 costruiscono una trama laminata corrispondente alle facce {110} e {101} del COD come proteine intracristalline, rispettivamente, mentre Cal-A non è incluso nella trama laminata (Fig. 2c –e). Questa prova in vivo di adsorbimento/incorporazione selettiva in superficie di proteine su/inrenecristalli di pietra indica che le distribuzioni delle proteine non sono identiche al tradizionale "strato di materia organica" osservato dalla microscopia ottica (Fig. 7a). L'evidenza in vitro sull'adsorbimento selettivo di OPN sul cristallo di COD è stata riportata da Chien et al. (2009 e 2018)46,47. Secondo questi rapporti, l'OPN si lega alla tipica faccia cristallografica {110} del COD e si incorpora nella fase minerale, essendo coerente con i nostri risultati (Fig. 7b). L'adsorbimento/incorporazione selettiva superficiale è probabilmente il risultato della capacità di legare il calcio di ciascuna proteina e/o di differenti compatibilità molecolari tra i gruppi funzionali sulle molecole proteiche e la disposizione degli ioni reticolari su ciascuna superficie cristallina.
Secondo quanto riferito, la maggior parte delle proteine inibisce la crescita dei cristalli di CaOx durante la formazione di calcoli48,49. L'inibizione della crescita dei cristalli da parte dei peptidi è considerata attraverso lo step pinning e/o il kink blocking41–43. In precedenti studi in vitro, OPN e RPTF-1 sono noti per essere inibitori della crescita dei cristalli di CaOx48,49. Tuttavia, l'entità dell'inibizione inrenela formazione di pietre non è chiara.
La presente osservazione mostra che la maggior parte dei cristalli COD di calcoli renali hanno una tipica abitudine cristallina con {101} facce (Fig. 2b). Le superfici cristalline che hanno tassi di crescita relativamente lenti sono generalmente ben sviluppate40. Questo finanziamento indica che il tasso di crescita di {101} facce di COD è lento rispetto ad altre superfici (ad es. {110}). L'adsorbimento preferenziale di RPTF-1 che potenzialmente ha rallentato la crescita dei cristalli incorporata nel COD è stato trovato come una struttura laminata insieme a {101} facce (Fig. 2d). D'altra parte, abbiamo trovato {110} facce come strutture laminate OPN all'interno del cristallo COD (Fig. 2c). Le {110} facce sono apparse poiché la struttura laminata OPN è più sviluppata delle {110} facce dei cristalli COD privi di OPN ottenuti in uno studio in vitro46. La {110} faccia del COD con adsorbimento preferenziale di OPN non è la faccia cristallina che appare sul COD del tipico abito cristallino47. Pertanto, l'assorbimento di OPN su {110} decelererebbe estremamente il tasso di crescita della superficie relativa e la decelerazione era abbastanza lenta da far apparire le facce {110}. L'emergere delle facce {110}, in altre parole, cambia l'abito cristallino generale in molti campioni di calcoli renali. I cristalli COM appaiono come una trama a mosaico o una trama concentrica (Figg. 3a e 5a). Sia OPN che RPTF-1 sono presenti in modo omogeneo nei grani COM nella trama del mosaico (Fig. 3c, d). Pertanto, gli effetti di queste proteine sul tasso di crescita di questo tipo di COM non sono chiari. In COM concentrico, cristalli a listelli allineati radialmente dal centro verso l'esterno50. Le facce cristalline dei cristalli simili a listelli non sono chiare, ma la superficie esterna della COM sferica esposta all'urina dovrebbe avere le stesse facce cristallografiche. I risultati attuali mostrano chiaramente che OPN e RPTF-1 hanno profili di linea di distribuzione simili in cui si distribuiscono periodicamente nella COM concentrica come strati di intervallo di circa 4-6 µm di scala (Figg. 4c, d, 5b, c e Tabella Supplementare S1). Ciò indica che OPN e RPTF-1 hanno una differenza trascurabile nell'assorbimento e nell'incorporazione sulle facce cristalline specifiche di COM esposte all'urina. Precedenti lavori in vitro hanno mostrato che OPN ha effetti inibitori sulla crescita COM di {100}, {121} e {010} facce 51. Quando si considera questo effetto inibitorio, il risultato attuale indica che la crescita COM concentrica è stata inibita da OPN e possibilmente da RPTF-1 poiché RPTF-1 ha una capacità di legare il calcio simile e quindi ha un'efficienza di incorporazione simile a COM.
Figura 7. Schemi della distribuzione delle proteine in tre trame principali in CaOx. (a) La distribuzione della matrice proteica è considerata in studi precedenti (colore bianco: fase minerale colore nero: materia organica). (b) Distribuzione proteica specifica trovata nel presente studio (verde: osteopontina (OPN), blu: frammento di protrombina renale 1 (RPTF-1) e rosso: calgranulina A (Cal-A). COD idiomorfico di tipo 1, tipo 2 mosaico COM e COM laminati concentrici Type3.
Effetti inibitori in vivo di Cal‑A sulla crescita dei cristalli di CaOx.L'adsorbimento di Cal-A su specifiche facce cristalline di entrambi i cristalli COM e COD non è stato visto nel presente risultato (Figg. 2a e 3a). Cal-A ha una capacità di legare il calcio inferiore rispetto a OPN e RPTF-1 ed era presente all'esterno dei cristalli di COD euedrico e attorno ai grani COM del mosaico senza struttura laminata (Figg. 2a, e e 3a, e). Tuttavia, Cal-A è anche noto per inibire la crescita dei cristalli di CaOx in uno studio in vitro28. Tus, Cal-A potrebbe aver funzionato come una molecola di tensioattivo che influenza la morfologia e il tasso di crescita dei cristalli senza incorporarsi nel cristallo39,40,52. In condizioni normali di urina (cioè senza un'elevata concentrazione di Cal-A irregolare), Cal-A può avere un effetto inibitorio inferiore rispetto a OPN e RPTF-1 sulla crescita cristallina di COM e COD da OPN e RPTF{{17} } inibiscono lo sviluppo di gradini sulle facce di cristallo mediante il blocco e/o il blocco mediante incorporazione nei cristalli. Pertanto, la capacità di legare il calcio delle proteine nei calcoli renali aiuterebbe a valutare l'entità dei loro effetti inibitori sulla crescita di CaOx Nella COM concentrica, Cal-A ha mostrato strati non periodici che avevano distanze da 20 a 50 µm (Figg. 4c, d , 5d e la Tabella Supplementare S1). Il Cal-A è stato identificato nell'urina dei calchifici28. Pertanto, dovrebbero verificarsi naturalmente fluttuazioni nella sua concentrazione nelle urine. Tuttavia, a causa della sua minore affinità con gli ioni calcio, piccole fluttuazioni nella concentrazione di Cal-A potrebbero non essere registrate nella trama COM. Il Cal-A viene escreto nelle urine non periodicamente come proteine antinfiammatorie in risposta all'infammazione53,54. Pertanto, gli strati non periodici di Cal-A possono registrare occasionali concentrazioni elevate di Cal-A nelle urine a causa di cambiamenti ambientali irregolari, come infezioni, lesioni e sanguinamento. Il suo effetto inibitorio sulla crescita di COM dipenderebbe fortemente dalla sua concentrazione attorno ai cristalli in crescita poiché diversi peptidi hanno tale dipendenza dalla crescita dei cristalli di calcite42. Cal-A può decelerare debolmente la crescita di COM occupando parzialmente la superficie in crescita quando la sua concentrazione attorno al cristallo è bassa perché la proteina non è incline ad essere incorporata nel CaOx. Nella COM concentrica, gli strati gap circondati da minuscoli depositi trovati dall'osservazione SEM presentano luoghi quasi identici agli strati Cal-A trovati dall'imaging multi-IF (Fig. 6a-d). Pertanto, quando lo strato di Cal-A diventa spesso a causa della sua concentrazione irregolarmente elevata a causa di alcuni cambiamenti biologici, Cal-A può funzionare come un potente inibitore della crescita di CaOx occupando ampiamente la superficie in crescita. L'infiammazione, che è un fattore scatenante della secrezione di Cal-A, può anche influenzare una diversa fase della formazione di calcoli perché in esperimenti che utilizzano un topo modello con calcolo renale16.
La possibile applicazione dell'imaging multi-IF alla formazione complessiva di calcoli renali.Il presente lavoro ha ampliato l'applicazione dell'imaging multi-IF di proteine a campioni biominerali più duri, ad esempio calcoli renali. La nucleazione dei cristalli, la crescita dei cristalli, l'aggregazione dei cristalli e l'adesione dei cristalli sono stati considerati passaggi importanti nella formazione di calcoli renali. OPN, RPTF-1 e Cal-A sono riportati come inibitori della nucleazione, crescita e aggregazione di CaOx da studi in vitro48,49. L'attuale applicazione ampliata dell'imaging multi-IF fornisce prove in vivo dell'effetto inibitorio della crescita di CaOx da parte delle proteine implicate nei precedenti studi in vitro. Le indagini sugli effetti delle proteine in ciascuna fase sono state condotte da studi in vivo sui topi e da numerosi studi in vitro14,15,26. Ad esempio, un ruolo critico renoprotettivo dell'OPN come inibitore della formazione di cristalli e inibitore dell'adesione dei cristalli è stato riportato sulla base di esperimenti in vivo nei topi26 mentre, la promozione dell'adesione dei cristalli alle cellule epiteliali tubulari da parte dell'OPN e il miglioramento della pietra CaOx la formazione è stata segnalata sulla base di esperimenti in vivo più recenti utilizzando topi knockout OPN14,15. Una morfologia cristallina completamente diversa trovata nei calcoli renali di un topo knockout OPN supporta anche gli effetti dell'OPN in più fasi della formazione di calcoli renali. Il presente metodo di visualizzazione sarebbe utile nella valutazione degli effetti proteici in questi studi in vitro sui topi e anche utile nella valutazione delle diverse fasi della formazione di calcoli renali umani. Questa nuova analisi ci consentirebbe di interpretare gli effetti in vivo di diverse proteine sulla formazione di calcoli di CaOx che possono aprire una strada per l'esame patologico e la medicina personalizzata per gestire la malattia del calcolo renale umano.
Metodi
Dichiarazione etica. Il progetto di ricerca presentato in questo documento è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della scuola di specializzazione in medicina dell'università di Nagoya City. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Il consenso informato scritto di tutti i soggetti è stato ottenuto secondo procedure approvate dal comitato etico.
Raccolta pietre e preparazione sezioni lapidee. I calcoli renali sono stati raccolti dai pazienti e sono stati analizzati presso l'università cittadina di Nagoya in Giappone. Quindici campioni di calcoli renali CaOx sono stati selezionati dalle nostre migliaia di raccolte di calcoli renali umani sulla base delle informazioni della spettroscopia a infrarossi di massa (IR) e sono state preparate sezioni sottili. La composizione mineralogica bulk della pietra è stata stimata con l'analisi IR. A questa indagine sui calcoli renali è stata applicata una metodologia petrologica di sezionamento sottile, originariamente progettata per le indagini geologiche55. I campioni di calcoli renali sono stati interamente incorporati in resina epossidica e tagliati. La sezione trasversale è stata rettificata con abrasivi (SiC e Al2O3), quindi la superficie lucidata è stata fatta aderire a un vetrino utilizzando resina epossidica. È stato eseguito un secondo taglio per creare un campione di 1- mm di spessore parallelo al vetrino. Il campione è stato quindi lucidato fino a uno spessore di 20–30 µm e rifinito con la lucidatura mediante impasto liquido diamantato.
Microscopia polarizzata e spettrofotometria infrarossa in trasformata di Fourier.Le caratteristiche ottiche di ciascun cristallo che compone i calcoli renali sono state osservate mediante microscopia polarizzata con sezioni di frammenti di pietra spesse 20-30 µm. L'indice di superficie di ciascun piano COD è stato determinato confrontando l'osservazione con la tipica forma del cristallo COD calcolata da VESTA56. Sulla base delle caratteristiche ottiche, i cristalli sono stati classificati, quindi analizzati con uno spettrofotometro a infrarossi a trasformata di Fourier (FT/IR6100, JASCO). L'intervallo del numero d'onda di misurazione era 7800–350 cm-1. Tutte le misurazioni sono state condotte a temperatura ambiente. La dimensione del punto di misurazione è stata impostata a 20 × 20 µm2. Le fasi cristalline sono state identificate in base allo spettro IR ottenuto con il database RRUFF.
Colorazione immunofluorescente multicolore della matrice proteica.Le sezioni di pietra utilizzate per l'analisi delle fasi minerali sono state utilizzate anche per l'analisi delle distribuzioni proteiche con colorazione Multi-IF. Le sezioni sottili sono state trattate con una soluzione di citrato (pH 6.0) per 1 minuto per un'incisione minima. La sezione è stata lavata con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi bloccata per 60 min in albumina di siero bovino all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato con Tween 20 (PBST). Dopo il blocco, la sezione è stata incubata con anticorpi primari per una notte a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari utilizzati erano anti-calgranulina A monoclonale di topo (diluizione 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), anti-osteopontina policlonale di coniglio (diluizione 1:100, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ), e il frammento 1 di protrombina monoclonale di pecora anti-umana (diluizione 1:500, Cedarlane Ontario, Canada, CL20111AP). La sezione è stata quindi lavata 3 volte con PBS per 10 minuti prima dell'incubazione con anticorpi secondari coniugati in modo fluorescente per 1 ora, al riparo dalla luce. Gli anticorpi secondari coniugati in modo fluorescente utilizzati sono stati anti-IgG di coniglio (H più L) adsorbiti incrociati coniugati ad Alexa Fluor 488, IgG anti-topo (H più L) adsorbiti in modo incrociato coniugati ad Alexa Fluor 546 e IgG anti-pecora (H più L) Adsorbito incrociato coniugato con Alexa Fluor 647. Dopo un ampio lavaggio 3 volte con PBS per 10 minuti, la fluorescenza è stata rilevata utilizzando una microscopia confocale a fluorescenza automatica (Nikon A1R). Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione raccolte includevano eccitazione di 487 nm (emissione raccolta tra 500 e 550 nm), eccitazione di 561 nm (emissione raccolta tra 570 e 620 nm) e 639 nm (emissione raccolta tra 663 e 738 nm) per OPN, RPTF{{ 46}} e Cal-A, rispettivamente. L'autofluorescenza (AF) è stata osservata da una parte dei campioni, ma l'intensità del segnale era di gran lunga inferiore rispetto ai segnali proteici discussi in questo studio. È stato anche valutato il legame di anticorpi non specifici alle proteine bersaglio. È stata confermata l'assenza di segnali IF dall'anticorpo non specifico. Sono stati eseguiti test di controllo negativi per valutare l'assenza di segnali falsi positivi (Figura complementare S5). Per la colorazione degli anticorpi, sono stati utilizzati controlli isotipici per rilevare qualsiasi legame non specifico. In particolare, gli anticorpi primari utilizzati per i controlli erano il controllo dell'isotipo mAb IgG XP di coniglio (DA1E) (segnalazione cellulare di diluizione 1:100), il controllo dell'isotipo mAb IgG1 di topo (G3A1) (segnalazione cellulare di diluizione 1:100) e l'isotipo IgG mAb di pecora (1 :100 diluizione Novus) utilizzando gli stessi anticorpi secondari marcati in modo fluorescente come sopra. I profili delle linee sono stati costruiti con ImageJ, mostrando il punto di contrasto più alto e più basso rispettivamente del 100 percento e dello 0 percento per ciascuna proteina.