Attività multidirezionale di Bakuchiol contro i meccanismi cellulari dell'invecchiamento facciale - Prove sperimentali per un approccio terapeutico olistico Parte 1

Astratto

Obbiettivo: L'invecchiamento cutaneo è un processo multifattoriale che comporta la formazione di specie reattive dell'ossigeno, infiammazione consecutiva con ridotta vitalità delle cellule epidermiche e dermiche e conseguente danno alla matrice extracellulare. Modalità di trattamento dermocosmetico efficaci dovrebbero idealmente affrontare questi tratti distintivi in ​​un approccio olistico. Qui, abbiamo determinato il corrispondente profilo di attività del bakuchiol, un meroterpene di origine vegetale, in una serie di studi in vitro, ex vivo e in vivo e lo abbiamo confrontato con il retinolo, attualmente considerato il gold standard nei cosmetici topici antietà.

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una forte capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità riducente rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento cutaneo. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e può eliminare le specie reattive dell'ossigeno, prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi e ha anche un buon effetto riparatore sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

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Metodi: La capacità antiossidante e il potere del bakuchiolo e del retinolo sono stati analizzati misurando la riduzione del 2,2′-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) tramite il suo decadimento dell'assorbimento e la spettroscopia di risonanza di spin elettronico, rispettivamente. Effetti sulla prostaglandina E2 (PGE2), sul fattore inibitorio della migrazione dei macrofagi (MIF), sul fattore di crescita dei fibroblasti 7 (FGF7), sul collagene di tipo I e VII (COL1A1, COL7A1), sui livelli di fibronectina (FN) e sulla metabolizzazione del tetrazolio idrosolubile 1 (WST-1) sono stati determinati nei fibroblasti dermici umani. La rigenerazione epidermica è stata valutata utilizzando un modello di guarigione della ferita in vitro. I livelli di proteina FN sono stati analizzati ex vivo dopo il trattamento con una formulazione contenente bakuchiol, retinolo o veicolo utilizzando un liquido per bolle di aspirazione. Il miglioramento delle condizioni della pelle è stato determinato in vivo in uno studio comparativo su faccia divisa dopo l'applicazione di bakuchiol o veicolo.

Risultati: Contrariamente al retinolo, il bakuchiol ha dimostrato un'elevata efficacia antiossidante. I livelli di PGE2 e MIF sono stati significativamente ridotti sia dal bakuchiol che dal retinolo. Il bakuchiolo, ma non il retinolo, ha aumentato significativamente i livelli di proteina FGF7. I livelli di metabolizzazione del WST-1 sono stati significativamente aumentati dal bakuchiolo e dal retinolo. L'applicazione di Bakuchiol e retinolo ha portato a un aumento significativo dei livelli di proteine ​​COL1A1, COL7A1 e FN. Le ferite integrate con bakuchiol ma non con retinolo hanno mostrato un aumento significativo della rigenerazione dell'epidermide. Clinicamente, le aree trattate con una formulazione contenente bakuchiol hanno mostrato un aumento statisticamente significativo dei valori della proteina FN dopo un'applicazione di 4-settimane rispetto alle aree non trattate e alle aree trattate con veicolo.

Conclusione: Questi dati forniscono la prova dell'efficacia multidirezionale del bakuchiol contro le caratteristiche cellulari dell'invecchiamento cutaneo. Il suo profilo di attività condivide alcune caratteristiche comuni con il retinolo, ma dimostra diversi effetti positivi finora sconosciuti nei nostri studi, vale a dire la stimolazione del componente critico della matrice extracellulare FN e l'accelerazione della rigenerazione epidermica e della guarigione delle ferite.

PAROLE CHIAVE

anti-invecchiamento, bakuchiol, fondatezza dell'affermazione in vivo/ex vivo/in vitro, retinolo, fisiologia/strutture della pelle

INTRODUZIONE

La pelle invecchiata è caratterizzata da rughe, pigmentazione irregolare, rugosità cutanea e lassità. Questi segni clinici sono il risultato di alterazioni strutturali e metaboliche causate da processi di invecchiamento intrinseco ed estrinseco. L'invecchiamento intrinseco è stato attribuito a fattori quali accorciamento dei telomeri, infiammazione cronica, singole mutazioni del DNA mitocondriale e radicali liberi [1]. La pelle invecchiata comporta inoltre una riduzione dei suoi sistemi antiossidanti[2]. Inoltre, il tasso di proliferazione cellulare diminuisce a causa del processo di invecchiamento biologico che porta alla perdita della struttura e della funzione della pelle. L'invecchiamento estrinseco è principalmente innescato dall'irradiazione UV e dagli influssi ambientali. Questi insulti provocano danni alla pelle che rafforzano il declino cronologico e accelerano l'invecchiamento cutaneo. La pelle umana perde ulteriormente la capacità di far fronte alle condizioni infiammatorie durante l'invecchiamento, determinando uno stato proinfiammatorio cronico.

L'applicazione topica di retinoidi come acido retinoico, retinale o retinolo è considerata il gold standard clinico per un efficace trattamento antietà [3, 4]. I meccanismi molecolari dei retinoidi sono stati ampiamente descritti [5-10]. I retinoidi topici riducono efficacemente i segni visibili dell'invecchiamento come rughe, lassità o rugosità [4, 11] e diminuiscono la depigmentazione della pelle fotodanneggiata, tra cui la Livedo reticularis e le lentiggini attiniche [12]. Tuttavia, il trattamento topico con retinoidi può portare a secchezza e irritazione della pelle dipendenti dalla concentrazione [13]. Poiché l'applicazione del retinolo provoca reazioni avverse minori rispetto ad altri retinoidi come l'acido retinoico [6, 14], è un principio attivo ampiamente utilizzato nel trattamento cosmetico dell'invecchiamento del viso.

A differenza del retinolo che è stato applicato nei prodotti per la cura della pelle dal 1984 [15], il bakuchiol ha guadagnato solo di recente l'attenzione come composto topico antietà. Bakuchiol è un meroterpene (Figura 1) che deriva dai semi di Psoralea corylifolia. È stato usato per secoli nella medicina tradizionale indiana e cinese [16, 17] ed è ben tollerato [18]. È stato suggerito che Bakuchiol esibisca funzioni simili al retinolo, poiché in un modello sostitutivo della pelle, entrambe le sostanze mostrano modelli di espressione genica simili in vitro [19] e un miglioramento del fotodanneggiamento cutaneo in vivo [20]. Pertanto, è stato anche definito un analogo retinoide funzionale di origine vegetale [21]. Ulteriori studi hanno dimostrato effetti antiossidanti [19, 22-24], antinfiammatori [19, 25-27], antibatterici [28] nonché antiproliferativi e antitumorali [29, 30] del bakuchiol.

Per migliorare e ritardare efficacemente i processi multifattoriali di invecchiamento cutaneo, è necessario affrontare diversi meccanismi cellulari in un approccio integrato. Bakuchiol modula simultaneamente vari bersagli rendendolo un composto promettente in questo senso. Poiché gli stress ossidativi e infiammatori sono strettamente correlati all'invecchiamento cutaneo, la loro prevenzione da parte del bakuchiol potrebbe favorire la condizione generale della pelle. Tuttavia, la qualità delle attuali prove scientifiche è stata recentemente valutata criticamente [31]. In questo contesto, abbiamo determinato le capacità (i) antiossidanti e (ii) antinfiammatorie di bakuchiol e retinolo ed esaminato la loro capacità di migliorare il metabolismo cellulare e la sintesi del fattore di crescita 7 riassunto come (iii) attività cellulare. Abbiamo ulteriormente analizzato se il bakuchiolo e il retinolo influiscono sull'espressione di alcuni componenti ECM (iv) e migliorano (v) la rigenerazione e la riepitelizzazione dell'epidermide. Infine, è stato condotto uno studio in vivo per verificare la capacità clinica antietà del bakuchiol nella pelle umana.

MATERIALI E METODI

Materiali di prova

Bakuchiol è stato ottenuto da Sytheon Ltd (Boonton, New Jersey, Stati Uniti). Il retinolo è stato acquistato da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Stati Uniti). Per gli esperimenti di coltura cellulare, entrambe le sostanze di prova sono state diluite di recente in DMSO (Merck, Darmstadt, Germania). Per le soluzioni stock di DMSO, la concentrazione applicata delle sostanze di prova era 1000-volte superiore alla concentrazione più alta applicata nella coltura cellulare, producendo 0,1% di DMSO nel mezzo o nel tampone. Ulteriori diluizioni sono state eseguite utilizzando terreni o tamponi con 0,1% di DMSO. Pertanto, tutti gli esperimenti di coltura cellulare sono stati eseguiti in presenza di 0,1% di DMSO. Per gli studi in vivo, il retinolo topico è stato formulato nello stesso veicolo del bakuchiol.

Studi in vitro

Determinazione della capacità antiossidante

Bakuchiol, retinolo (entrambi applicati a una concentrazione finale di 100μM) o il trolox standard elevato (Merck, concentrazione finale di 25μM) sono stati diluiti in DMSO. In breve, 30 μL di questi composti (concentrazione 10-volte superiore rispetto alla concentrazione finale del test) sono stati aggiunti a una 96-piastra a fondo piatto. Successivamente, 270μL di 39ug/mL DPPH (Merck, diluito in una miscela di acqua/etanolo 1:1) sono stati rapidamente aggiunti a ciascun pozzetto ottenendo una concentrazione finale del 10% di DMSO. Come controllo, la soluzione DPPH è stata incubata con DMSO privo di sostanze di prova. Inoltre, sono stati eseguiti controlli in bianco incubando bakuchiol o retinolo con acqua/etanolo (1:1) o solo la miscela acqua/etanolo (1:1) contenente il 10% di DMSO in assenza di DPPH. Dopo 10, 30 e 60 minuti, l'assorbanza a 524 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre multimodale Spark (Tecan, Männedorf, Svizzera). I segnali dei controlli in bianco sono stati sottratti.

Determinazione del potere antiossidante

Gli HDF sono stati seminati in {{0}}pozzetti con 150 000 cellule/pozzetto in un terreno da 2 mL contenente il 10% di siero di vitello e incubati per 24 ore. Successivamente, il vecchio mezzo è stato scartato e le cellule sono state trattate con un mezzo contenente il 2% di siero di vitello e bakuchiolo o retinolo in una concentrazione finale di 10 μM. Gli HDF di controllo sono stati integrati con lo 0,1% di DMSO privo di bakuchiolo o retinolo. I controlli in bianco sono stati eseguiti incubando un mezzo senza cellule. Dopo 24 ore, il mezzo condizionato è stato trasferito alle colonne spin del concentratore di proteine ​​Vivaspin (5000 MWCO; Sartorius, Göttingen, Germania) e concentrato approssimativamente 10-volte. I volumi di tutti i surnatanti medi sono stati equalizzati aggiungendo nuovamente il flusso attraverso. I livelli di proteina FGF7 del mezzo condizionato concentrato sono stati analizzati utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (Bio-Techne GmbH). Le misurazioni sono state eseguite utilizzando un lettore di micropiastre multimodale Spark (Tecan). I segnali ottenuti dai controlli in bianco sono stati sottratti e i livelli di proteina FGF7 sono stati normalizzati al numero totale di cellule che è stato determinato utilizzando un contatore di cellule (Sceptre, Merck).

Determinazione della metabolizzazione del WST-1

Gli HDF sono stati seminati in {{0}}pozzetti con 3000 cellule/pozzetto in terreno da 100 μL contenente il 10% di siero di vitello e incubati per 24 ore. Il mezzo impoverito è stato scartato e le cellule sono state trattate con 100 μL di terreno contenente retinolo o bakuchiol in una concentrazione finale di 1 μM o 10 μM, rispettivamente. Gli HDF di controllo sono stati integrati con lo 0,1% di DMSO privo di bakuchiolo o retinolo. Come ulteriore controllo, le cellule sono state trattate con il 10% di triton-X (Merck). I controlli in bianco sono stati eseguiti incubando un mezzo senza cellule. Dopo 72 ore, le cellule sono state colorate utilizzando il reagente di proliferazione cellulare disponibile in commercio WST-1 secondo le istruzioni del produttore (Merck). L'assorbanza è stata misurata a 450 e 620 nm utilizzando un lettore di micropiastre Tecan infinity M200 (Tecan). La differenza in queste misurazioni è stata utilizzata per l'analisi. I segnali dei controlli in bianco sono stati sottratti.

Determinazione dei livelli di proteine ​​COL1A1 e COL7A1

Gli HDF sono stati seminati in {{0}}pozzetti con 10  000 cellule/pozzetto in 100 μL di terreno contenente il 10% di siero di vitello e incubati per 24 ore. Bakuchiol o retinolo sono stati diluiti in 100 μL di terreno senza siero di vitello e integrati nel presente terreno in una concentrazione finale di 1 μM o 10 μM, rispettivamente. Il controllo è stato integrato con 100 μL di terreno privo di siero, ottenendo una concentrazione dello 0,1% di DMSO corrispondente al trattamento con retinolo e bakuchiol. Come standard elevato, sono stati applicati 10 ng/ml di fattore di crescita trasformante (TGF-) e 11 ug/ml di ascorbato di sodio (entrambi Merck). I controlli in bianco sono stati eseguiti incubando un mezzo senza cellule. Dopo 4 ore, i livelli proteici COL1A1 e COL7A1 del mezzo condizionato sono stati analizzati utilizzando kit ELISA disponibili in commercio seguendo le istruzioni del produttore (Novus Biologicals, Littleton, Colorado, Stati Uniti). Le misurazioni sono state eseguite utilizzando un lettore di micropiastre multimodale Spark (Tecan). I segnali dei controlli in bianco sono stati sottratti. I livelli delle proteine ​​COL1A1 e COL7A1 sono stati normalizzati rispetto alla quantità totale di proteine ​​del lisato cellulare che è stata determinata utilizzando un kit di analisi dell'acido bicinconinico disponibile in commercio (Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore. Un prerequisito per l'utilizzo dei risultati era la reazione positiva delle cellule al TGF standard elevato e all'ascorbato di sodio.

Per l'analisi dei livelli della proteina COL7A1 dopo un tempo di incubazione prolungato, gli HDF sono stati seminati in 96-pozzetti con 3000 cellule/pozzetto in un terreno da 100 μL contenente il 10% di siero di vitello. Tutti i trattamenti, i controlli e l'analisi sono stati eseguiti come descritto sopra, con l'eccezione che il bakuchiolo e il retinolo sono stati utilizzati solo in una concentrazione finale di 10 μM. Le cellule sono state raccolte quando è stata raggiunta la subconfluenza, in particolare dopo 72 o 96 ore.

Determinazione dei livelli di proteina FN

Gli HDF sono stati seminati in {{0}}pozzetti con 10 000 cellule/pozzetto in 100μL di terreno contenente il 10% di siero di vitello e incubati per 24 ore. Il vecchio terreno è stato sostituito da un terreno contenente il 2% di siero di vitello e bakuchiol o retinolo in una concentrazione finale di 10 μM. Il controllo è stato integrato con lo 0,1% di DMSO privo di bakuchiolo o retinolo. I controlli in bianco sono stati eseguiti incubando un mezzo senza cellule. Dopo 24 ore, i livelli di proteina FN del mezzo condizionato sono stati analizzati utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, Stati Uniti). Le misurazioni sono state eseguite utilizzando un lettore di micropiastre multimodale Spark (Tecan). I segnali dei controlli in bianco sono stati sottratti. I livelli di proteina FN sono stati normalizzati alla quantità totale di proteina del lisato cellulare che è stata determinata come sopra.

Determinazione della rigenerazione epidermica in un modello di guarigione della ferita in vitro

Gli esperimenti sono stati condotti come descritto in precedenza [34]. Per il trattamento dei modelli di guarigione delle ferite, il bakuchiol o il retinolo sono stati diluiti in DPBS e aggiunti in una concentrazione finale di 100μM alla regione della ferita (5 μL per ferita). Le ferite di riferimento sono state integrate con la stessa quantità di DPBS contenente lo 0,1% di DMSO senza bakuchiolo o retinolo. Ulteriori ferite sono state lasciate non trattate come ulteriore controllo. I modelli di guarigione delle ferite sono stati incubati per 43 ore al 95% di umidità, 5% di CO2 e 37 gradi . Successivamente, i campioni sono stati congelati a scatto in isopentano pre-raffreddato con azoto liquido e conservati a -80 gradi. La riepitelizzazione è stata valutata in sezioni criostatiche colorate con ematossilina ed eosina misurando la lunghezza dell'epidermide rigenerata utilizzando un microscopio Leica DMLS (10×), una fotocamera CCD Leica MC 170 HD e il software Leica LAS V4.9 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania). La quantificazione è stata eseguita in cieco.

Studi in vivo I e II

Per entrambi gli studi in vivo, le raccomandazioni dell'attuale versione della Dichiarazione di Helsinki e le linee guida della Conferenza internazionale sull'armonizzazione della buona pratica clinica sono state osservate come applicabili a uno studio cosmetico. Il protocollo di studio I è stato approvato dal Comitato Etico Indipendente di Friburgo (codice feki 08/2610). In entrambi gli studi, tutti i volontari hanno fornito il consenso informato scritto. I soggetti avevano una pelle sana, appartenevano al tipo di pelle Fitzpatrick da I a III e l'inizio o il cambiamento del farmaco ormonale era un criterio di esclusione.

Durante un periodo di precondizionamento di 10-giorni e per l'intero periodo di studio, i soggetti dovevano astenersi dall'esposizione ai raggi UV nelle aree di test. Le attività che promuovono il sudore sono state proibite 24 ore prima delle valutazioni programmate.

Un ricercatore ha dimostrato la corretta applicazione delle formulazioni utilizzando una quantità che corrispondeva al normale regime di cura della pelle dei soggetti.

Studio I: Determinazione ex vivo dei livelli di proteina FN

Su 52 soggetti di sesso femminile, che sono stati arruolati in questo studio controllato dal veicolo, 33 soggetti hanno completato lo studio e i dati di 31 soggetti (30-64 anni, età media: 50,9 anni) sono stati inclusi nell'analisi dei dati. Gli abbandoni si sono verificati a causa della pandemia SARS-CoV-2 e per motivi personali (13 soggetti) nonché per reazioni di incompatibilità (cinque soggetti, causate dal trattamento con retinolo). Le reazioni di incompatibilità mediate dal retinolo e i problemi di campionamento hanno causato un numero diverso di soggetti testati per ciascuna condizione (vedere i risultati per i dettagli).

Sette giorni prima delle valutazioni programmate, era proibito l'uso di prodotti per la cura della pelle, detergenti e saponi sugli avambracci. Il primo giorno di studio, sono state stabilite quattro aree di prova sugli avambracci interni. Su due aree di prova, sono state applicate due formulazioni di verum per contenere rispettivamente {{0}},5 percento di bakuchiolo o 0,15 percento di retinolo. In un parere pubblicato dal Comitato scientifico per la sicurezza dei consumatori nel 2016, la concentrazione di retinolo applicata era considerata un trattamento cosmetico [35]. Nelle altre due aree di prova è stato utilizzato il veicolo corrispondente oppure l'area non è stata trattata. Il posizionamento dei luoghi di trattamento è stato permutato. Dopo 4 settimane di applicazione due volte al giorno delle formulazioni di prova, i volontari sono tornati all'istituto di prova. In ciascuna area del test, sono state generate tre bolle di aspirazione (7 mm di diametro) come precedentemente descritto [36, 37]. In breve, sulle aree di prova sono state posizionate ventose personalizzate per blister ed è stato applicato un vuoto di 550–850 mbar. Dopo circa 90-150 minuti, quando si sono formate le bolle di aspirazione, il vuoto è stato rilasciato e il fluido è stato aspirato dalla bolla usando un 24-ago di calibro. I fluidi sono stati congelati immediatamente a -80 gradi su ghiaccio secco fino all'analisi. I livelli di proteina FN sono stati quantificati nei campioni di fluido della bolla di aspirazione utilizzando un kit ELISA disponibile in commercio (sistemi di ricerca e sviluppo). Le misurazioni sono state eseguite utilizzando un lettore di micropiastre multimodale Spark (Tecan). I livelli di FN sono stati normalizzati rispetto ai livelli proteici totali dei campioni di liquido delle bolle di aspirazione che sono stati determinati come sopra.

Studio II: Determinazione in vivo del miglioramento delle condizioni della pelle

In totale, 43 donne volontarie sono state arruolate in questo studio comparativo di viso diviso controllato dal veicolo. Secondo le valutazioni mediche, i soggetti mostravano tipi di pelle misti (pelle secca, normale, grassa e mista). 34 soggetti (39-66 anni, età media: 56,2 anni) hanno completato lo studio e sono stati inclusi nell'analisi. Gli abbandoni sono stati causati da problemi tecnici e non conformità (otto soggetti), nonché da reazioni di incompatibilità (un soggetto, causato dal trattamento con veicolo e bakuchiol).

Due settimane prima dell'inizio dello studio e durante l'intero periodo di studio, ai volontari è stato richiesto di astenersi dall'utilizzare prodotti autoabbronzanti o trattamenti cosmetici intensivi per il viso (es. rimozione degli strati superficiali della pelle). Durante il periodo di precondizionamento di 10-giorni e durante tutto lo studio, ai soggetti è stato chiesto di astenersi dall'eseguire trucco permanente, trattamenti per ciglia e sopracciglia, maschere per gli occhi e cerotti. Tre giorni prima della prima valutazione, ai soggetti è stato chiesto di astenersi dall'utilizzare prodotti per la cura del viso. La sera prima della valutazione programmata, i soggetti dovevano interrompere l'applicazione di cosmetici decorativi.

Nei primi 7 giorni della fase di precondizionamento di 10-giorni, i soggetti hanno ricevuto un vasetto di crema contenente la crema veicolo dello studio (senza alcuna informazione sul contenuto) e l'hanno applicato due volte al giorno su tutto il viso. Al basale, i volontari hanno eseguito un'autovalutazione. In particolare, hanno valutato visivamente l'aspetto generale della loro pelle del viso osservandone la freschezza e la luminosità, nonché eventuali segni di invecchiamento cutaneo. Pertanto è stata applicata una scala analogica visiva che va da 1 (molto affaticato, invecchiato) a 10 (molto fresco, nessun segno di pelle invecchiata). Quindi, i soggetti hanno ricevuto due vasetti di crema in cieco contenenti il ​​verum (veicolo contenente lo 0,5% di bakuchiol) o il veicolo, rispettivamente, senza alcuna specificazione sul contenuto. Durante il periodo di studio di 12 settimane, un lato facciale è stato trattato due volte al giorno con verum mentre l'altro lato facciale è stato trattato due volte al giorno con il veicolo. L'assegnazione dei trattamenti ai siti di test è stata permutata. Dopo 12 settimane di uso regolare, i volontari hanno nuovamente eseguito l'autovalutazione come sopra indicato.

analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando Microsoft Excel per Office 365 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, Stati Uniti), SAS Software Package per Windows V9.4 (SAS Institute GmbH, Heidelberg, Germania) e GraphPad Prism V8 (GraphPad Software, San Diego , California, Stati Uniti).

La normale distribuzione dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Se la distribuzione normale è stata confermata, è stata eseguita un'analisi della varianza a misura ripetuta (RM-ANOVA) con confronto a coppie post hoc. Se l'ipotesi di normalità è stata rifiutata, i ranghi trasformati da Blom dei dati originali sono stati valutati utilizzando un RM-ANOVA con confronto a coppie post-hoc, oppure i dati originali sono stati valutati utilizzando un test di rango del segno di Wilcoxon. Tutti i test statistici erano bilaterali con un livello di significatività di alfa=0.05.

RISULTATI

Studi in vitro

Determinazione degli effetti antiossidanti

Per analizzare gli effetti antiossidanti (i) del bakuchiol e del retinolo, abbiamo eseguito due diversi test utilizzando DPPH come molecola rivelatore.

Capacità antiossidante

La capacità antiossidante è stata determinata misurando la riduzione del DPPH attraverso il suo decadimento dell'assorbimento. Il Trolox di alto livello ha mostrato una capacità antiossidante significativamente elevata rispetto al controllo (p=0.0000 per tutti i punti temporali indicati) verificando la corretta misurazione (Figura 2a). Per quanto riguarda il controllo, anche l'assorbanza nei campioni trattati con bakuchiol è stata significativamente ridotta in tutti i punti temporali esaminati (10 min: p=0.0003, 30 e 60 min: p=0.0000 ) dimostrando una maggiore capacità antiossidante. Al contrario, il retinolo non ha mostrato una significativa capacità antiossidante rispetto al controllo.

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