Funzione neuroendocrino-immune della Cistanche Deserticola e dei suoi prodotti per la cottura a vapore di vino di riso nel modello di ratto indotto da glucocorticoidi-Ⅰ

1. Introduzione

Cistanche deserticola, chiamato "ginseng del deserto", è una medicina tradizionale cinese utilizzata da secoli come erba yang-tonica pertonificante il rene e rafforzamento dello yang[1]. Otto specie e una variazione diCistanche Herba sono stati registrati in Cina e soloCistanche deserticolaYC Ma eCistanche tubulose(Schenk) I Wight sono registrati nella Farmacopea cinese [2]. Lo hanno dimostrato gli studi farmacologiciCistanches Herbamostrato neuroprotettivo [3], immunomodulatore [4], cardioprotettivo [5], antifatica [6], antinfiammatorio [7], epatoprotettivo [8], antiossidante [9], antibatterico [10], lassativo [11] e antitumorale effetti [12]. L'ampio spettro di attività biologiche riportate di questo genere è stato attribuito alla sua composizione fitochimica complessa e varia.Cistanche deserticolacontiene glicosidi feniletanoidi, iridoidi, polisaccaridi [13], ecc. Il contenuto di glicosidi feniletanoidi è il più alto nei materiali medicinali originali [14].

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La lavorazione della Materia Medica Cinese (CMM) è una tecnica farmaceutica tradizionale per soddisfare i diversi requisiti di trattamento, dispensazione e preparazione secondo la teoria della medicina tradizionale cinese. Questi prodotti trasformati vengono chiamati pezzi di decotto, che vengono utilizzati nelle cliniche. L'elaborazione mira a migliorare l'efficacia nel ridurre la tossicità dei farmaci grezzi. Nel 2015 la Farmacopea cinese ha registrato che le fette spesse di Cistanche (CD) e le Cistanche al vapore di vino di riso (WCD) potrebbero essere utilizzate come pezzi di decotto in clinica. Il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che l’effetto lassativo è stato alleviato e gli effetti antietà e rinvigorenti del rene-yang sono stati migliorati dopo che Cistanche è stata cotta a vapore con vino di riso [15].

La funzione dell’asse ipotalamo-ipofisi-ghiandola surrenale-timo (HPAT) è disordinata nella sindrome da deficit di rene-yang [16]. I pazienti con deficit del rene-yang presentano anche una vasta disfunzione immunitaria. La disfunzione dell’asse HPA è strettamente correlata all’immunodeficienza. La teoria della rete neuroendocrino-immune (NEI) mostra che i sistemi immunitario e neuroendocrino condividono molti ligandi e recettori [17] e l'ipotalamo è considerato il perno per collegare il sistema neuroendocrino con il sistema immunitario.

In questo studio, abbiamo replicato il deficit del rene-yang in ratti modello con iniezione di corticosteroidi esogeni ed esplorato il meccanismo del deficit del rene-yang in risposta a diversi prodotti trasformati di Cistanche deserticola dal punto di vista della funzione endocrino-immunitaria.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiali e reagenti

Cistanche deserticola è stata raccolta da Alashan Neimenggu nel 2019.5 e identificata come steli carnosi essiccati di Cistanche deserticola YC Ma dal Prof. Yanjun Zhai (Scuola di Farmacia, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Liaoning, Cina). Gli esemplari dei voucher sono stati conservati nel Centro tecnologico di ingegneria di elaborazione di Liaoning.

I composti standard di ajugol sono stati acquistati da Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Cina); cistanoside F,echinacoside, cistanoside A e isoacteosidesono stati acquistati da Must Company (Sichuan Cina); acteoside è stato acquistato da Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Cina). Acetonitrile e metanolo di grado MS sono stati acquistati da Merck KGaA (Darmstadt, Germania). L'acido formico di grado HPLC è stato acquistato da Merck KGaA (Darmstadt, Germania). Il vino di riso è stato acquistato da Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Cina).

Corticosterone (CAS: 50-22-6, purezza > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pillole chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), ACTH di ratto, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 e IL-10 kit ELISA sono stati acquistati da Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Il kit ELISA per cortisolo di ratto è stato fornito da BOSK Co., anticorpo CD4 di ratto, anticorpo CD8a (nn. 561833 e 559976), lisato RBC (Solarbio, R1010), soluzione tampone PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM e primer -actina a monte e a valle sono stati forniti dal kit di trascrizione inversa Guangzhou Invitrogen Co. (n. RR037A) e il kit di sintesi cDNA (n. 10000068167) sono stati forniti da Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Cloroformio, isopropanolo, etanolo al 75% e uretano le soluzioni erano tutte analiticamente pure e prodotte da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. L'acqua ultrapura è stata prodotta dal sistema Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, USA).

2.2. Strumenti sperimentali

Un marcatore enzimatico (Thermo, modello 3530911931), lavapiatti automatico (modello HBS- 4009), misuratore di forza push-pull con display digitale (modello VICTOR- 50N), centrifuga di congelamento ad alta velocità (modello Sigma 3k15 ), spettrofotometro ultramicro (modello B-50Q), amplificatore genetico (modello L96G), PCR quantitativa a fluorescenza in tempo reale (modello StepOne), citometro a flusso (modello AC66051710132), microtomo a paraffina (modello Laika), microscopio (Olympus , modello BS-53) e uno strumento per acqua pura (modello F7JA36507).

2.3. Preparazione di campioni per UPLC-Q-TOF-MS ed esperimenti farmacologici

WCD è stato elaborato dallo stesso batch diCistanche deserticolanel nostro laboratorio. Per la preparazione del WCD, pezzi di CD secchi (5 mm di spessore) (100 g) sono stati infusi con vino di riso (30 mL), cotti a vapore ad alta pressione (1,25 kPa) per 4 ore e quindi essiccati a 55 gradi.

Le polveri grossolane di CD e WCD sono state immerse in 10 volte etanolo al 95% per 0,5 ore, estratte a riflusso 3 volte ogni volta per 1 ora, e filtrate, e i filtrati 3 volte sono stati combinati. L'etanolo è stato recuperato sotto pressione ridotta e l'estratto è stato ottenuto per la somministrazione. L'estratto (1 mL) è stato aggiunto al 50% di metanolo, portando il volume totale a 20 mL, e conservato a 4 gradi per l'analisi del contenuto.

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2.4. Condizioni UPLC-QqQ-MS per l'analisi di estratti CD e WCD

2.4.1. Condizioni analitiche LCThMS

Per eseguire l'acquisizione e l'elaborazione dei dati è stato utilizzato il sistema UPLC-MSThMS con il software MassLynx 4.1 Analyst. La colonna analitica era una Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a una temperatura di 40 gradi C. La fase mobile era una soluzione acquosa di 0, 1% di acido formico (A) e acetonitrile contenente 0,1% di acido formico (B). Il gradiente di eluizione era 0,00–1,00 min con 3% B, 1,01–2,00 min con 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min con 12% B, 3,01–4.00 min con 15% B, 4,01–5.00 min con 20% B, 5,01–6.00 min con 22 % B, 6,01–8,00 min con 25% B e 8,01–9,00 min con 10% B. La velocità di flusso era 0,3 mLTh min e il volume di iniezione era 1,0 μL.

Lo spettrometro di massa triplo quadruplo Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) è stato utilizzato in modalità ioni negativi. Il gas di desolvatazione era azoto con una portata di 500 LThh ad una temperatura di 250 gradi. Tutti i composti rilevati sono stati misurati nella modalità di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM); La Tabella 1 mostra i parametri energetici e la Tabella 2 mostra le curve di calibrazione per i componenti analizzati.

2.4.2. Preparazione delle sostanze di riferimento

Tubuloside A (3,02 mg), echinacoside (3,00 mg), 2′-acetilatteoside (2,34 mg), acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanoside F ( 2,14 mg), salidroside (3,39 mg), acido geniposidico (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) e catalpol (2,39 mg) sono stati sciolti in metanolo per preparare una soluzione madre. La soluzione madre è stata diluita con metanolo per ottenere le concentrazioni appropriate per le soluzioni standard di lavoro. Tutte le soluzioni preparate sono state conservate a 4 gradi prima dell'uso.

2.5. Preparazione e raggruppamento di modelli animali

Ratti maschi SD (180–220 g) sono stati acquistati da Liaoning Changsheng Biotechnological Co., numero di permesso animale: SCXK (Liao) 2015–0001. Tutti i ratti sono stati mantenuti con libero accesso al cibo e all'acqua a 25 gradi e con un'umidità relativa del 30–50%. Gli animali sono stati ospitati per 7 giorni prima degli esperimenti.

Cento ratti sono stati divisi casualmente in 10 gruppi: gruppo di controllo in bianco (BC), gruppo di controllo modello (MC), gruppo di controllo positivo (PC), gruppo di controllo del vino di riso (WC), gruppo CD ad alte dosi (CD -HD), gruppo CD a dose media (CD-MD), gruppo CD a dose bassa (CD-LD), gruppo WCD ad alta dose (WCD-HD), gruppo WCD a dose media (WCD-MD) e Gruppo WCD a basso dosaggio (WCD-LD). Le dosi di CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD e CD-LDThWCD-LD erano rispettivamente 5,48 gTh(kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) e 1,37 gTh(kg ∙ d). La dose per il gruppo PC era 1,646 gTh(kg ∙ d) e per il gruppo WC, 1 mLTh100 g per 40 giorni. Il 6° giorno dopo la somministrazione, ai ratti è stata iniettata per via sottocutanea la sospensione acquosa di corticosterone (corticosterone + 0,1% dimetilsolfossido + 0,1% Tween-80 + 0,9% cloruro di sodio) eccetto per il gruppo BC [18]. La concentrazione di corticosterone era di 5 gThL e la dose era di 0,1 mLTh100 g. Ai ratti del gruppo BC è stata somministrata soluzione salina normale + 0,1% dimetilsolfossido + 0,1% Tween- 80 + 0,9% cloruro di sodio mediante iniezione alla stessa dose.

2.6. Determinazione delle funzioni dell'asse HPA

2.6.1. Test di peso, temperatura e potere di tenuta

Ogni 3 giorni veniva effettuato un test del peso e ogni 6 giorni veniva misurata la temperatura. durante l'esperimento. Al 39° giorno, la forza massima dell'arto posteriore è stata misurata mediante un misuratore di presa. I ratti sono stati posizionati su piattaforme lisce, facendo sì che i loro arti posteriori afferrassero il palo. I ratti afferreranno istintivamente qualsiasi oggetto per evitare di muoversi all'indietro quando la coda viene tirata finché la forza di trazione non supera la presa. Quando il ratto perdeva la presa, il preamplificatore poteva registrare automaticamente la massima forza di presa.

2.6.2. Determinazione del livello di T, CRH, ACTH, CORT e cortisolo nel siero

Un'ora dopo l'ultima somministrazione, i ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di uretano (20 gTh100 ml). Quindi, i campioni di sangue sono stati raccolti, centrifugati a 3500 r per 15 minuti per ottenere il siero e conservati a -20 gradi. Le concentrazioni di T, CRH, ACTH, CORT e cortisolo sono state misurate con kit ELISA per ratti secondo le istruzioni del produttore.

2.6.3. Osservazioni al microscopio

La struttura morfologica del tessuto della ghiandola surrenale è stata osservata mediante colorazione HE. Il tessuto surrenale è stato fissato in paraformaldeide al 10%, disidratato in etanolo, reso trasparente da una soluzione di xilene, incorporato con metodi convenzionali, tagliato a fette spesse 4 μm, deparaffinato con soluzione di xilene, idratato con il gradiente di etanolo e quindi colorato con ematossilina ed eosina soluzione colorante. Dopo essere stata resa trasparente con xilene, la lastra è stata sigillata con gomma neutra ed osservata al microscopio.

2.6.4. Colorazione immunoistochimica dell'espressione delle proteine ​​Bax, Bcl-2, Caspase-3, Fas e FasL nella ghiandola surrenale

Le sezioni surrenali di ratto fissate in formalina e incluse in paraffina sono state deparaffinate e reidratate dopo essere state tagliate ad uno spessore di 4 μm. Per il blocco dell'attività della perossidasi endogena, le sezioni sono state preincubate in blocco di perossido di idrogeno per 10 min. Le sezioni sono state immerse in citrato 0,01 M (pH 6,0) e riscaldate fino all'ebollizione. Il processo è stato ripetuto dopo 5-10 minuti. Dopo il raffreddamento, le sezioni sono state lavate con PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 volte, lasciate a temperatura ambiente per circa 5 minuti e lavate con PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 volte. La soluzione bloccante di BSA al 5% è stata aggiunta a temperatura ambiente e il liquido in eccesso sulla sezione è stato eliminato 20 minuti dopo. Anticorpi primari diluiti specifici per FasTh FasL, Bcl-2ThBax e caspase-3 (diluiti 1:100 con PBS) sono stati aggiunti e incubati a 37 gradi per 1 ora o 4 gradi durante la notte. Le sezioni sono state lavate 2–3 volte con PBS (pH 7,2–7,6). Quindi sono state aggiunte IgG anti-topo di capra biotinilate e le sezioni sono state essiccate a 20–37 gradi per 20 minuti e lavate con PBS (pH 7,2–7,6) 4 volte per 5 minuti. Dopo un accurato lavaggio in PBS, le sezioni sono state incubate con una miscela di reagenti A e B per 30 minuti, incubate con PBS per 45 minuti e infine sviluppate con substrato DAB (DAKO) per 30 minuti prima di essere leggermente controcolorate con ematossilina, disidratata, e montato.

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2.7. Determinazione delle funzioni immunitarie

2.7.1. Calcolo dell'indice degli organi immunitari

Un'ora dopo l'ultima somministrazione, i ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di uretano (20 gTh100 ml), quindi la milza e la ghiandola del timo sono stati rimossi e pesati immediatamente sotto una cappa sterile. I coefficienti di peso della milza o del timo (%) � peso della milza o del timo (mg) Peso corporeo (g).

2.7.2. Rilevazione di sottoinsiemi di linfociti T nel sangue periferico

Splenociti ed emociti sono stati incubati con gli anticorpi monoclonali anti-CD4 (PE) e anti-CD8 (FITC) per 30 minuti al buio. Sono stati aggiunti 2 mL di lisato eritrocitario e la soluzione è stata miscelata mediante vortex. La soluzione è stata lasciata al buio per 10 minuti e centrifugata per 5 minuti. Il surnatante è stato scartato, quindi la soluzione è stata lavata 3 volte con PBS ghiacciato e risospesa nella soluzione permeabilizzante di PBS. Almeno 10.000 cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso entro 1 ora da ciascuna colorazione con Mab.

2.7.3. Determinazione del livello di IL-10, IL-6, IL-2, TNF- e IFN-c nel siero

Un'ora dopo l'ultima somministrazione, i ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di uretano (20 gTh100 ml) ed è stato prelevato il sangue dall'aorta addominale. Il sangue è stato centrifugato a 3500 giri per 15 minuti per ottenere il siero e conservato a -20 gradi. Le concentrazioni di IL-10, IL-6, IL-2, TNF- e IFN-c sono state rilevate con kit ELISA per ratti secondo le istruzioni del produttore.

2.8. Espressione di CaM nei tessuti dell'ipotalamo e dell'ipofisi

L'RNA totale è stato estratto dai tessuti dell'ipotalamo e dell'ipofisi mediante TRIzol. La trascrizione inversa è stata effettuata su 10 μL di RNA totale secondo le istruzioni del produttore. Uguali quantità di cDNA sono state analizzate tramite qPCR in presenza di colorante legante il dsDNA (Promega, USA) e il sistema CFX 96 Real-time PCR (Bio-Rad, USA) per esaminare i diversi geni nelle condizioni di attivazione iniziale a 95 gradi per 10 min, 40 cicli di denaturazione a 95 gradi per 15 s ed estensione di ricottura a 60 gradi per 1 min.

I primer per CaM e -actina sono riportati nella Tabella 1 e -actina è stata utilizzata come controllo interno. Ciascun campione è stato normalizzato utilizzando la differenza nelle soglie critiche (Ct) tra il gene bersaglio e l'actina. Per descrivere il risultato è stata utilizzata la seguente equazione: ΔΔCt� (gene bersaglio Ct - gene Ct -actina) gruppo sperimentale - (gene bersaglio Ct - gene Ct -actina) gruppo di controllo. I livelli di mRNA di ciascun campione sono stati quindi confrontati, utilizzando l'espressione del gene bersaglio 2- ΔΔCt. È stata calcolata la media dei risultati di ciascun gruppo (Tabella 3).

2.9. Analisi statistica

Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando il software SPSS (versione 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Le differenze tra i gruppi sono state analizzate con l'analisi della varianza a misure ripetute unidirezionali (ANOVA). I risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD) utilizzando il software GraphPad Prism (versione 6.0, San Diego, CA, USA). Le differenze con un valore P inferiore a 0.05 sono state considerate statisticamente significative.

3. Risultati sperimentali

3.1. Analisi UPLC-QqQ-MS

Per ottenere la migliore separazione, forma dei picchi e un breve tempo di analisi, nel nostro esperimento preliminare sono state studiate le condizioni cromatografiche, tra cui colonna, fase mobile e programma del gradiente. I cromatogrammi tipici con la modalità MRM sono presentati nella Figura 1.

Dalla Tabella 4, possiamo vedere che il contenuto di glicosidi feniletanoidi nel WCD è aumentato rispetto a quello di CD, soprattutto per l'echinacoside e l'acteoside, mentre il contenuto di iridoidi è diminuito nel WCD.

3.2. Regolamento per la funzione dell'asse HPA

3.2.1. Test di peso, temperatura e potere di tenuta

I ratti del gruppo MC e dei gruppi sperimentali hanno mostrato gradualmente sintomi di carenza di rene-yang dopo aver ricevuto corticosterone. I sintomi, come perdita di peso, ipotermia, perdita di lucentezza dei capelli, abbattimento dello spirito, ritardo nella risposta e una significativa diminuzione del consumo di acqua e dell'attività, sono migliorati notevolmente nei gruppi CD e WCD. La Figura 2 (a) mostra le variazioni di peso. Il peso di ciascuno dei gruppi di farmaci è aumentato, soprattutto nei gruppi CDHD e WCD-HD. L'aumento di peso nel gruppo MC è stato il più basso. La Figura 2(b) mostra le variazioni di temperatura, che sono state le più basse nel gruppo MC, e la temperatura è aumentata nei gruppi WCD-HD, WCD-MD e WCD-LD.

La Figura 2 (c) mostra che il potere di tenuta è aumentato per il gruppo BC e ciascuno dei gruppi sperimentali, e il gruppo WCD-MD è stato il più alto, il che ha dimostrato che i segni di debolezza indotti dalla carenza di rene-yang sono migliorati dopo la somministrazione.

3.2.2. Livelli di T, CRH, ACTH, CORT e cortisolo

La Figura 3 mostra che rispetto a quelli del gruppo BC, il livello di T, CRH, ACTH e CORT nel siero del ratto è diminuito (P < 0.01) e il livello di cortisolo è diminuito (P < 0.05) nel gruppo MC. Rispetto a quelli del gruppo MC, il livello di T nei gruppi WCD-HD e WCD-MD è aumentato (P < 0.01), il livello di CRH nel WCD-LD, WCD-MD e gruppi WC migliorati (P ​​<0.01), contenuto di ACTH aumentato nei gruppi CD-HD, WCD-MD e WCD-HD (P <{0,01), livello CORT aggiornato nei gruppi Gruppi CD-MD, WCD-MD e WCD-HD (P < 0,01) e migliorato nei gruppi CDHD e WCD-LD (P < 0,05), e il livello di cortisolo è aumentato in ciascuno dei gruppi di farmaci.

3.2.3. Risultati dell'osservazione al microscopio

Il tessuto della ghiandola surrenale può essere diviso nello strato corticale e nello strato midollo. Gli strati corticali comprendono strati globulari, fasci e reticolari. Le cellule contengono più lipidi e lo strato midollare è costituito principalmente da cellule di feocromocitoma e da una piccola quantità di tessuto fibroso. Come mostrato nella Figura 4, abbiamo scoperto che tutto era normale nel gruppo BC, mentre nel gruppo MC la corteccia surrenale presentava evidente iperplasia, atrofia cellulare e aumento della densità. La striscia bulbosa si ispessì e la zona fascicolare traslucida, la stretta zona reticolare e le cellule più piccole mostrarono una colorazione non uniforme e una congestione capillare. Nel gruppo PC erano visibili i confini corticale e midollare. Le cellule delle bande globulari e dei fasci erano disposte uniformemente e la struttura morfologica era stata ripristinata. Lo stesso recupero migliore è stato osservato nei gruppi WCD e gli effetti nel gruppo WCD-MD sono stati migliori rispetto a quelli dei gruppi WCD-HD e WCD-LD. La morfologia della ghiandola surrenale nei gruppi CD non era buona come quella nei gruppi WCD.

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