Effetto neuroprotettivo dell'estratto di Bu-Shen-Huo-Xue contro l'apoptosi indotta da glucosio elevato nelle cellule PC12

Per maggiori informazioni:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Studio di ricerca sull'integrazione della medicina tradizionale e occidentale, First Hospital, Università di Pechino, Pechino, Cina.

2Laboratorio statale chiave di farmaci naturali e biomimetici, Scuola di scienze farmaceutiche, Università di Pechino, Pechino, Cina.

Mette in risalto

La neurotossicità indotta da glucosio elevato (HG) è implicata nella patologia didiabeticoencefalopatia (DE). Nel nostro studio, l'estratto di Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), una formula polierboristica, mostraneuroprotettivol'attività sulle cellule PC12 indotte da HG e i possibili meccanismi possono essere associati alla soppressione della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), nonché alle vie di segnalazione della caspasi mediata dai mitocondri e delle vie di segnalazione MAPK JNK/p38. Questo studio fornisce un agente promettente per il trattamento della DE nelle applicazioni cliniche.

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Astratto

Obiettivo: studiare l'effetto neuroprotettivo dell'estratto di Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), una formula polierboristica, contro la neurotossicità indotta da alto glucosio (HG) nelle cellule PC12. Metodi: sono stati eseguiti il ​​test di vitalità cellulare, il test della lattato deidrogenasi (LDH), il rilevamento di specie reattive dell'ossigeno (ROS), Hoechst 33258, la doppia colorazione di acridina arancione (AO)/bromuro di etidio (EB) e il dosaggio del potenziale di membrana mitocondriale (MMP). Inoltre, mediante western blot sono stati rilevati Bax, Bcl-2, caspasi-3, cleaved caspase-3, PARP, cleaved PARP, citocromo c e MAPKs (Mitogen-Activated Protein Kinases). Risultati: l'estratto di BSHX ha aumentato la vitalità cellulare e ha ridotto la perdita di LDH in modo dipendente dalla concentrazione nelle cellule PC12 indotte da HG. Inoltre, l'estratto di BSHX ha ridotto il livello di ROS intracellulare, aumentato il potenziale della membrana mitocondriale, regolato le espressioni di Bax e Bcl-2 e inibito il rilascio del citocromo c dai mitocondri. Inoltre, l'estratto di BSHX ha attenuato l'attivazione di caspasi-3 e PARP e ha inibito le fosforilazioni di c-Jun N-terminal chinasi (JNK) e p38 MAPKs. Conclusione: l'estratto di BSHX ha mostrato un significativo effetto neuroprotettivo sull'apoptosi indotta da HG nelle cellule PC12. Questo effetto può essere associato alla soppressione della generazione di ROS, nonché alle vie di segnalazione della caspasi mediata dai mitocondri e delle vie di segnalazione MAPK JNK/p38.

Parole chiave:encefalopatia diabetica, medicina tradizionale cinese, estratto di Bu-Shen-Huo-Xue,neuroprotettivo, glucosio alto

Abbreviazione: AO: arancia acridina; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Encefalopatia diabetica; DM: diabete mellito; DMSO: dimetilsolfossido; EB: bromuro di etidio; ERK: chinasi proteiche regolate extracellulari; HG: glucosio alto; JNK: c-giugno chinasi N-terminale; LDH: lattato deidrogenasi; MAPK: chinasi proteiche attivate da mitogeni; MWP: prescrizione Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-Dimetiltiazol-2-yl] 2, 5-difeniltetrazolio bromuro; PBS: soluzione salina tampone fosfato; PBST: soluzione salina tamponata con fosfato, 0,1 percento Tween 20; ROS: specie reattive dell'ossigeno; T2DM: diabete mellito di tipo 2; MTC: medicine tradizionali cinesi

Sfondo

Negli ultimi anni, l'encefalopatia diabetica (DE), una complicanza del diabete mellito (DM) che si verifica nel sistema nervoso centrale (SNC), ha ricevuto ampia attenzione. La DE può essere associata a diversi fattori di rischio come l'età, la durata e il controllo glicemico del diabete [1, 2]. Le manifestazioni cliniche della DE sono cambiamenti morfologici e fisiologici nel cervello e la conseguente disfunzione cognitiva. L'iperglicemia, lo stress ossidativo e l'infiammazione cronica possono essere le importanti cause patogene della DE [3]. Sebbene un numero crescente di esperimenti abbia dimostrato che l'iperglicemia sostenuta a lungo termine può accelerare l'invecchiamento cerebrale, la precisa patogenesi della DE è inesplorata.

L'apoptosi è una morte cellulare programmata controllata dai geni per mantenere la stabilità del microambiente. Le proteine ​​coinvolte nell'apoptosi includono la famiglia Bcl-2, le caspasi, p53, ecc. La famiglia Bcl-2 è divisa in due categorie, una che promuove la morte cellulare, come Bax, e l'altra che resiste all'apoptosi, come Bcl-2. Possono regolare l'apoptosi attraverso la via di segnalazione della caspasi, che è una reazione di amplificazione a cascata del substrato di idrolisi finita irreversibile della caspasi [4-6]. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che l'apoptosi indotta da alto glucosio (HG) è associata a disfunzione mitocondriale, danno al DNA e produzione eccessiva di specie reattive dell'ossigeno (ROS) [7]. Uno studio su topi diabetici ha mostrato che la proteina chinasi (AMPK) attivata dall'adenosina 5'-monofosfato (AMPK), un recettore intracellulare di energia e stress, potrebbe inibire l'apoptosi mediata da ROS. Inoltre, prove crescenti hanno dimostrato che l'inibizione delle chinasi proteiche attivate da mitogeni (MAPK) potrebbe essere benefica per l'inibizione dell'apoptosi neuronale. Un altro rapporto ha mostrato che le vie di segnalazione della chinasi N-terminale c-Jun (JNK), delle chinasi proteiche regolate extracellulari (ERK), p38 MAPK possono potenzialmente regolare l'apoptosi neuronale [8,9].

Basato sulla teoria della medicina tradizionale cinese,renela carenza di essenza e la stasi ematica sono considerate come patogenesi di base della DE. Pertanto, la strategia del nutrimentorenie l'attivazione del sangue è comunemente usata nelle applicazioni cliniche per DE. Precedenti studi potrebbero confermare che la prescrizione modificata di Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), una prescrizione che mira a nutrirereni, può migliorare il deterioramento cognitivo e proteggere i neuroni riducendo la tossicità A [10, 11]. La prescrizione Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), in cui viene aggiunta la sanguisuga sulla base di MWP, è specificamente formulata pernutrirerenie attiva il sangue. Studi recenti hanno dimostrato che la prescrizione di BSHX può migliorare la sindrome da deterioramento della memoria dei pazienti con DM, suggerendo potenti proprietà neuroprotettive [12]. Tuttavia, il meccanismo farmacologico dettagliato per BSHX rimane poco chiaro. In questo studio, miriamo a osservare l'effetto protettivo dell'estratto di BSHX sulle cellule PC12 indotte da HG ed esplorare i potenziali meccanismi molecolari.

Metodi

Materiali e reagenti

Tutte le erbe sono state acquistate da Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Pechino, Cina) e autenticate dal Dr. PF Tu, farmacognosista, secondo la farmacopea cinese (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-yl] 2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) proveniva da Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Un kit di analisi della lattato deidrogenasi (LDH) è stato acquistato dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanchino, Jiangsu, Cina). Il kit di colorazione doppia Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromuro (EB) e Hoechst 33258 sono stati ottenuti da Solar Co., Ltd. (Pechino, Cina). Un kit di analisi del potenziale della membrana mitocondriale con JC-1, 2, 7-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) è stato acquistato dal Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Cina). Anticorpi primari per caspasi-3, caspasi scissa-3, PARP, PARP scissa, citocromo C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK e -tubulina sono stati ottenuti dalla tecnologia di segnalazione cellulare (Boston, MA, USA).

Preparazione dell'estratto di BSHX

BSHX è costituito da sette componenti medicinali (Tabella 1). Per la preparazione dell'estratto di BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) e Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) sono stati miscelati nella proporzione di 8:8:4:1:2:1:8 e immersi in un volume totale di 10 volte (v/p) acqua distillata per 30 minuti , quindi fatto bollire per 1 ora e fatto bollire di nuovo per 1 ora in un volume totale di 5 volte (v/p) acqua distillata. I supernatanti sono stati combinati ed essiccati mediante liofilizzazione. L'estratto secco finale era il 25 percento (p/p) del peso delle erbe grezze e un campione di voucher è stato depositato nel Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Peking University Health Science Center, Pechino, Cina.

Coltura cellulare

Linee cellulari di feocromocitoma di ratto (cellule PC12) sono state ottenute dalla Peking Union Medical College Cell Bank (Pechino, Cina) e coltivate in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Pechino, Cina) integrato con il 10% di siero bovino fetale (Biowest, Francia ) e 1% di penicillina-streptomicina (100×, Macgene, Pechino, Cina) in un'incubatrice umidificata contenente il 95% di aria e il 5% di CO2 a 37 gradi.

Esempio di trattamento

Nel test preliminare, le cellule PC12 sono state trattate con estratto di BSHX (20, 50, 100 mg/L) da solo per 48 h per valutare la citotossicità. Per l'analisi dell'effetto neuroprotettivo dell'estratto di BSHX contro la neurotossicità indotta da glucosio elevato (HG), le cellule PC12 sono state co-trattate con l'estratto di BSHX (20, 50, 100 mg/L) e HG (75 mM) per 48 ore, seguite dal saggio MTT per la vitalità cellulare. Tutti gli altri test sono stati eseguiti nelle stesse condizioni con l'intervallo di concentrazione dell'estratto di BSHX da 20 a 100 mg/L.

Test di vitalità cellulare

Le cellule PC12 sono state seminate in 96-piastre a pozzetti a una densità di 3,5 × 103 cellule per pozzetto. Dopo incubazione con estratto di BSHX (con o senza HG) per 48 ore, il supernatante è stato rimosso ed è stata aggiunta una soluzione di MTT (0,5 mg/mL). Dopo incubazione a 37 gradi per 4 ore, la soluzione MTT è stata rimossa e le cellule sono state sciolte in dimetilsolfossido (DMSO) per agitare 5 min. La densità ottica (OD) è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Vitalità cellulare ( percentuale )=[OD (trattamento) – OD (vuoto)]/ [OD (controllo non trattato) – OD (vuoto)] × 100 percento.

dosaggio LDH

Le cellule PC12 sono state coltivate e stimolate al trattamento con estratto di HG e BSHX come descritto in precedenza. Quindi, l'LDH rilasciato dalle cellule è stato rilevato utilizzando un kit LDH commerciale secondo le istruzioni del produttore. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm. LDH (U/L)=[OD (trattamento) – OD (vuoto)] / [OD (standard) – OD (vuoto)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Colorazione Hoechst 33258 e colorazione AO/EB

Per la colorazione Hoechst 33258, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Quindi le cellule sono state lavate con tampone fosfato salino (PBS) 3 volte e incubate con la soluzione di lavoro Hoechst 33258 (1 ug/mL) al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza (IX73, Olympus, Giappone) con lunghezza d'onda di eccitazione 352 nm/lunghezza di emissione 461 nm. Per la colorazione AO/EB, rimuovere il mezzo dalle 96-piastre a pozzetti e aggiungere la miscela AO/EB (100 ug/mL AO e 100 ug/mL EB mescolati) per 5 minuti al buio a temperatura ambiente. Quindi le cellule sono state lavate con PBS 3 volte. Le cellule sono state visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza sotto lunghezza d'onda di eccitazione 490 nm/lunghezza di emissione 530 nm per la colorazione AO ​​e lunghezza d'onda di eccitazione 520 nm/lunghezza di emissione 590 nm per la colorazione EB.

Rilevamento ROS intracellulare

Per il rilevamento dei ROS intracellulari, le cellule PC12 sono state seminate in 6-piastre a pozzetti a una densità di 5 × 105 e sottoposte a trattamento con estratto di HG e BSHX per 24 ore. Dopo l'incubazione di 24 ore, le cellule PC12 sono state lavate con il mezzo eagle modificato di Dulbecco privo di siero per 3 volte e aggiunte a 10μΜ 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (DCF-DA), che viene ossidato a fluorescente 2', 7'-diclorofluoresceina (DCF) da idroperossidi, a 37 gradi per 30 min al buio. Quindi, le cellule sono state lavate con PBS freddo 3 volte e risospese in PBS. Il livello intracellulare di ROS è stato rilevato misurando l'intensità media della fluorescenza mediante citometria a flusso (BD FACSCaliburTM, USA). Le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione erano a 488/525 nm. È stato contato un minimo di 10,{23}} eventi per campione. I valori sono stati espressi come assorbanza media normalizzata alla percentuale del valore di controllo.

Saggio del potenziale di membrana mitocondriale

La depolarizzazione mitocondriale è stata valutata utilizzando un kit di test JC-1 commerciale. Dopo essere state trattate con estratto di HG e BSHX, le cellule sono state incubate con la soluzione di lavoro JC-1 (1 ×) a 37 gradi per 15 minuti al buio. Quindi, rimuovere il supernatante e lavare le cellule 2 volte con la soluzione tampone JC-1 (1 ×). Le cellule sono state visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza con lunghezza d'onda di eccitazione 460 nm/lunghezza d'onda di emissione 530 nm per il monomero JC-1 (rilevato in cellule con mitocondri depolarizzati) e lunghezza d'onda di eccitazione 520 nm/lunghezza d'onda di emissione 590 nm per JC{{13 }} polimero (presente nei mitocondri polarizzati). Si riteneva che le cellule con fluorescenza verde (monomerica) avessero mitocondri depolarizzati; le cellule con fluorescenza rossa (polimerica) erano considerate avere mitocondri normali.

Analisi Western blot

Le cellule PC12 sono state raccolte e lisate in tampone RIPA freddo con un inibitore della proteasi cocktail 1 ×. Il supernatante è stato raccolto mediante centrifugazione ad alta velocità a 12,{4}} rpm per 10 min a 4 gradi . Le concentrazioni proteiche sono state determinate mediante il saggio Bradford. Le frazioni arricchite di citosol e mitocondri sono state isolate con il kit di isolamento dei mitocondri (Pierce, Rockford, USA) per l'analisi del citocromo c. Per altre proteine, i lisati cellulari totali sono stati separati mediante SDS-PAGE (10 percento -15 percento) e trasferiti su membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF). Le membrane di fluoruro di polivinilidene sono state quindi bloccate con latte scremato al 5% e incubate con gli anticorpi primari indicati a 4 gradi per una notte. Le membrane sono state lavate con PBST (soluzione salina tamponata con fosfato, 0,1 percento di Tween 20) tre volte e incubate con anticorpi secondari a temperatura ambiente per 2 ore. Quindi, le membrane sono state lavate con PBST altre tre volte e visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente potenziato e scansionate con il sistema di imaging digitale Kodak (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA).

analisi statistica

Tutti i valori sono espressi come media ± deviazione standard (SD). La significatività delle differenze tra i valori medi è stata determinata mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) utilizzando il pacchetto statistico per le scienze sociali (SPSS 16.{2}} software). P < 0.05="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" controllo="" è="" stato="" considerato="" statisticamente="">

Risultati

L'estratto di BSHX protegge le cellule PC12 dal danno cellulare indotto da HG

Per indagare se l'estratto di BSHX potesse proteggere le cellule PC12 dall'insulto di HG, abbiamo trattato le cellule PC12 con una gamma di concentrazioni di estratto di BSHX (20, 50 e 100 mg/L) per 48 ore in condizioni di HG (75 mM). La valutazione della vitalità cellulare utilizzando il test MTT ha mostrato che l'insulto HG ha causato una diminuzione significativa della vitalità delle cellule PC12 (la vitalità cellulare era di circa 56,9 ± 6,7 percento) e che il trattamento con estratto di BSHX ha prevenuto significativamente la morte cellulare in modo dipendente dalla concentrazione. La vitalità cellulare è aumentata all'87,8 ± 9,2 percento quando le cellule sono state trattate insieme con l'estratto di BSHX (100 mg/L) (Figura 1A). La lattato deidrogenasi (LDH) viene rilasciata dalle cellule danneggiate e può quindi essere utilizzata anche come indicatore di tossicità cellulare. Coerentemente con i risultati del test MTT, abbiamo scoperto che l'insulto di HG ha aumentato significativamente il rilascio di LDH dalle cellule PC12 e che il trattamento dell'estratto di BSHX ha impedito il rilascio di LDH in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 1B). Questi risultati suggeriscono che l'estratto di BSHX aumenta la vitalità cellulare nelle cellule PC12 indotte da HG.

L'estratto di BSHX inibisce l'apoptosi delle cellule PC12 attraverso la via dipendente dalla caspasi-9/3-

Per determinare l'effetto dell'estratto di BSHX sull'apoptosi cellulare, abbiamo usato il colorante del DNA Hoechst 33258 come saggio sensibile per l'apoptosi. I nuclei delle cellule normali colorate con Hoechst 33258 hanno mostrato una fluorescenza blu uniforme, mentre le cellule apoptotiche che la picnosi della nube di cromatina nucleare hanno mostrato particelle fluorescenti ipercromatiche e dense. La percentuale di apoptosi è stata calcolata in base al numero di cellule apoptotiche rispetto al numero totale di cellule. I nostri dati hanno rivelato che l'insulto di HG (75 mM) ha aumentato notevolmente la proporzione di cellule apoptotiche (51,7 ± 4,3 percento) e il trattamento dell'estratto di BSHX ha protetto in modo significativo l'apoptosi indotta da HG nelle cellule PC12 (Figura 2A). Questi risultati sono stati ulteriormente supportati dall'analisi della doppia colorazione AO/EB. AO entra sia nelle cellule normali che in quelle apoptotiche ed emette fluorescenza verde mentre EB entra solo nelle cellule apoptotiche ed emette fluorescenza rossa [13]. Il test AO/EB ha mostrato che la percentuale di cellule apoptotiche è aumentata significativamente dopo l'insulto di HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 percento) e è diminuita dopo il trattamento dell'estratto di BSHX nelle cellule PC12 (Figura 2B), suggerendo che l'estratto di BSHX potrebbe efficacemente inibire l'apoptosi delle cellule PC12 indotta da HG.

Quindi, abbiamo studiato l'effetto dell'estratto di BSHX sulla via della caspasi{0}}/PARP, una via importante per l'apoptosi correlata ai mitocondri [14]. Il western blot ha rivelato che l'insulto HG (75 mM) aumentava significativamente le espressioni delle forme attive di caspasi-3 e PARP e diminuiva le espressioni della caspasi totale{5}} e PARP nelle cellule PC12 e questo effetto era notevolmente invertito mediante trattamento con estratto di BSHX (Figura.2C), suggerendo che l'estratto di BSHX proteggeva efficacemente le cellule PC12 dall'apoptosi attraverso la regolazione della via della caspasi mitocondriale-dipendente-3/PARP.

L'estratto di BSHX inibisce la produzione intracellulare di ROS nelle cellule PC12 indotte da HG

Poiché l'HG potrebbe aumentare la formazione di ROS intracellulari [15], abbiamo testato il livello di ROS intracellulare per determinare se l'estratto di BSHX potesse inibire la generazione di ROS. C'è stato un aumento di 3.23-volte dell'intensità media della fluorescenza osservato nelle cellule PC12 che sono state esposte a 75 mM HG per 48 ore rispetto al controllo. Al contrario, il co-trattamento con l'estratto di BSHX ha ridotto significativamente l'intensità media della fluorescenza a circa 0.76-, 0.{{10}} e 0.{ {12}}piega del gruppo modello, rispettivamente, indicando che l'estratto di BSHX potrebbe inibire la produzione di ROS indotta da HG (Figure 3A, B).

L'estratto di BSHX mantiene l'omeostasi mitocondriale nelle cellule PC12 indotte da HG regolando l'espressione di Bax e Bcl-2

Il potenziale di membrana mitocondriale è un parametro importante della funzione mitocondriale utilizzato come indicatore della salute cellulare. JC-1 è un colorante cationico lipofilo che può entrare selettivamente nei mitocondri e cambiare colore in modo reversibile da verde a rosso all'aumentare del potenziale di membrana. Nelle cellule sane con un elevato potenziale di membrana mitocondriale, JC-1 forma spontaneamente complessi noti come aggregati J con intensa fluorescenza rossa. D'altra parte, nelle cellule apoptotiche con basso potenziale di membrana mitocondriale, JC-1 rimane nella forma monomerica, che mostra solo fluorescenza verde [16, 17]. Il rapporto tra fluorescenza verde e fluorescenza rossa può quindi riflettere la depolarizzazione mitocondriale. Nel nostro studio, il numero di cellule con mitocondri depolarizzati (fluorescenza verde) è stato significativamente aumentato dopo HG (75 mM) per 48 ore e questo aumento è stato invertito dal trattamento dell'estratto di BSHX in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 4A).

Successivamente abbiamo rilevato le distribuzioni mitocondriale e citoplasmatica del citocromo c, un attore chiave nella via dell'apoptosi dipendente dalla caspasi di attivazione. Abbiamo scoperto che l'insulto HG (75 mM) per 48 ore ha indotto una drammatica traslocazione del citocromo c dai mitocondri al citoplasma e questo trasferimento è stato significativamente prevenuto dal trattamento dell'estratto di BSHX (Figura 4B), indicando che l'estratto di BSHX potrebbe inibire il rilascio di citocromo c dai mitocondri.

Inoltre, le proteine ​​della famiglia Bcl-2 sono importanti regolatori di varie vie apoptotiche. Bcl-2 può inibire l'apoptosi cellulare causata da una varietà di fattori citotossici ed è l'inibitore del rilascio del citocromo c dai mitocondri al citoplasma. Tuttavia, Bax, in quanto membro della famiglia Bcl-2, è un fattore pro-apoptosi. Quando viene indotta l'apoptosi, Bax migra dal citoplasma ai mitocondri e distrugge l'integrità mitocondriale [5, 18]. Nel nostro studio, il livello proteico di Bcl-2 è stato sottoregolato e Bax è stato sovraregolato dall'insulto di HG (75 mM) per 48 ore, questo effetto è stato invertito in modo dipendente dalla concentrazione dall'estratto di BSHX (Figura 4C). Tutti questi risultati sopra suggerivano che l'estratto di BSHX proteggesse le cellule PC12 dalla depolarizzazione mitocondriale indotta da HG regolando l'espressione di Bax e Bcl-2.

Effetto dell'estratto di BSHX sull'apoptosi cellulare tramite le vie di segnalazione MAPK JNK/p38

Alcuni studi hanno dimostrato che l'aumento della produzione di ROS è stato associato all'attivazione delle vie MAPK, per innescare l'apoptosi cellulare9 [19, 20]. Quindi abbiamo studiato l'effetto dell'estratto di BSHX sulla via di segnalazione della chinasi proteica attivata dal mitogeno (MAPK) per determinare se l'estratto di BSHX potesse attenuare l'apoptosi indotta da HG. Come mostrato nella Figura 5, l'insulto di HG (75 mM) per 48 ore ha aumentato le fosforilazioni di c-Jun NH{9}} chinasi terminale (JNK) e p38 nelle cellule PC12, che sono state significativamente inibite dall'estratto di BSHX in una concentrazione- modo dipendente. Tuttavia, un risultato simile non è stato osservato con MAPK (Extracellular Regulated Protein Kinase (ERK). I risultati suggeriscono che l'estratto di BSHX potrebbe inibire l'apoptosi cellulare indotta da HG tramite le vie di segnalazione MAPK JNK/p38.

Discussione

L'encefalopatia diabetica (DE) è una complicanza comune del diabete mellito di tipo 2 (DM2). Può causare deterioramento cognitivo del cervello ed è un importante fattore di rischio di mortalità e disabilità nei pazienti con diabete mellito di tipo 2 in tutto il mondo [3]. Pertanto, è fondamentale studiare il meccanismo della DE e le sue strategie di prevenzione e trattamento.

In Cina, le medicine tradizionali cinesi (MTC) sono utilizzate da molti anni per il trattamento del DM e hanno mostrato un effetto curativo. Alcuni studi clinici suggeriscono che le MTC basate sul nutrimento dei reni e sull'attivazione di strategie del sangue possono sottoregolare la glicemia, promuovere la circolazione e migliorare la disfunzione cognitiva del cervello. La prescrizione BSHX è un rappresentante di questi MTC. Il nostro studio clinico preliminare ha dimostrato che la prescrizione di BSHX potrebbe migliorare efficacemente la glicemia, l'omocisteina (HCY) e la proteina C-reattiva ad alta sensibilità (hs-CPR) nel siero e migliorare la funzione cognitiva dei pazienti diabetici con decadimento cognitivo lieve (MCI) [12]. Tuttavia, mancano prove per dimostrare l'efficienza e il meccanismo farmacologico finora.

In questo studio, abbiamo scoperto che l'estratto di BSHX potrebbe attenuare la riduzione della vitalità cellulare indotta da HG, come misurata dal test MTT, LDH. Per esplorare ulteriormente l'effetto protettivo dell'estratto di BSHX sulla vitalità cellulare, abbiamo studiato l'apoptosi di Hoechst 33258 e l'analisi della colorazione AO/EB. I risultati hanno mostrato che l'estratto di BSHX potrebbe ridurre significativamente l'apoptosi indotta da HG. Come marker di apoptosi, caspase-3 e PARP erano significativamente aumentati dopo il trattamento con HG, ma l'attivazione di questi fattori pro-apoptotici è stata inibita dall'estratto di BSHX in modo concentrazione-dipendente. I risultati di cui sopra hanno indicato che l'estratto di BSHX ha avuto un effetto protettivo sul danno cellulare PC12 indotto da HG.

I ROS si formano durante il processo di fosforilazione ossidativa delle cellule e il suo aumento della produzione o il danneggiamento dei sistemi antiossidanti possono portare a stress ossidativo nelle cellule [21]. Gli studi hanno dimostrato che un alto livello di glucosio potrebbe dar luogo all'accumulo di ROS intracellulari e alla fine a una via di segnalazione apoptotica attiva. E il meccanismo comune delle complicanze diabetiche è lo stress ossidativo [22, 23]. I nostri risultati hanno mostrato che un alto livello di glucosio potrebbe portare all'aumento di ROS nelle cellule PC12, il che era coerente con studi precedenti [24]. Si ipotizza che la tossicità del glucosio elevato per le cellule possa essere raggiunta attraverso l'apoptosi indotta da ROS. I mitocondri sono i principali siti di produzione intracellulare di ROS e anche il principale organo bersaglio per l'attacco di ROS [25]. In condizioni patologiche, il rapido aumento di ROS può provocare disfunzione mitocondriale, collasso del potenziale della membrana mitocondriale e alla fine portare all'apoptosi cellulare [26]. Quindi abbiamo rilevato l'integrità dei mitocondri. I nostri risultati hanno mostrato che un alto livello di glucosio riduceva significativamente il potenziale della membrana mitocondriale, aumentava il rapporto Bax/Bcl-2 che controllava l'interruttore del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (MPTP) e promuoveva la fuoriuscita del citocromo c, mentre l'estratto di BSHX poteva invertire questi cambiamenti. Questi suggeriscono che il neuroprotettivo dell'estratto di BSHX contro le cellule PC12 indotte da HG può derivare dal mantenimento dell'integrità dei mitocondri.

Anche la via di segnalazione MAPK svolge un ruolo importante nell'apoptosi cellulare. JNK, ERK e p38 MAPK sono i membri più studiati della famiglia MAPK. Il loro principale modo di agire è fosforilare i loro siti specifici, regolando così l'apoptosi cellulare [8, 27, 28]. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che un'eccessiva produzione di ROS può innescare la fosforilazione di p38MAPK [29-31] e che i ROS possono indurre o mediare l'attivazione delle vie MAPK [32]. Diversi stimoli cellulari che inducono la produzione di ROS anche in parallelo possono attivare vie MAPK in più tipi cellulari [32, 33]. I potenziali meccanismi per l'attivazione di MAPK da parte di ROS possono includere l'inattivazione e la degradazione delle fosfatasi MAPK che mantengono il percorso in uno stato inattivo [19]. D'altra parte, per confermare ulteriormente se le vie MAPK sono state attivate dalla generazione di ROS, le cellule sono state pretrattate con antiossidanti (ad es. NAC, uno scavenger di ROS) per prevenire l'accumulo di ROS. E i risultati hanno mostrato che l'attivazione di MAPK era quasi inibita dopo la stimolazione cellulare con stimoli cellulari [32, 33], indicando il coinvolgimento dell'inattivazione dei ROS delle vie MAPK. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che quando le cellule sono state trattate con l'inibitore specifico di JNK SP600125, l'apoptosi indotta dalla cardiotossina III potrebbe essere bloccata [34]. Il nostro studio precedente ha scoperto che la prescrizione modificata di Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) potrebbe inibire l'attivazione di ERK/p38 MAPK nella microglia BV2 A-attivata [10]. Tuttavia, in questo studio, abbiamo scoperto che l'estratto di BSHX potrebbe inibire la fosforilazione di JNK e p38 MAPK e non abbiamo ottenuto lo stesso risultato con p-ERK. Ipotizziamo che le sanguisughe svolgano un ruolo diverso nell'estratto di BSHX. I risultati suggeriscono che un altro meccanismo protettivo dell'estratto di BSHX contro l'apoptosi nelle cellule PC12 indotte da HG potrebbe essere attraverso la regolazione delle vie di segnalazione MAPK JNK/p38.

Conclusione

L'estratto di BSHX, una formula polierboristica, mostra effetti neuroprotettivi sulle cellule PC12 contro l'insulto HG. L'estratto di BSHX ha efficacemente inibito l'apoptosi delle cellule PC12 indotta da HG riducendo la generazione di ROS intracellulare, mantenendo l'integrità della membrana mitocondriale e bloccando le vie di segnalazione della caspasi-3 e JNK/p38 MAPK (Figura.6). Collettivamente, i nostri risultati suggeriscono che l'estratto di BSHX è un agente promettente per il trattamento della DE nelle applicazioni cliniche.

Contributi dell'autore

Ha ideato e progettato gli esperimenti: Zeng KW, Wang XM. Effettuato l'esperimento: Zhao SY. Analizzati i dati: Zhao SY, Zeng KW e Wang XM. Contributi di reagenti/materiali/strumenti di analisi: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW e Wang XM. Ha scritto il pater: Zhao SY.

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