Proprietà neuroprotettive dell'4-aminopiridina

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Michael Dietrich, PhD, Hans-Peter Hartung, MD, PhD, FRCP e Philipp Albrecht, MD

Astratto

In quanto antagonista dei canali del potassio voltaggio-dipendenti (Kv), l'4-aminopiridina (4-AP) viene utilizzata come terapia sintomatica in diversi disturbi neurologici. Il miglioramento della funzione visiva e delle capacità motorie e il sollievo dall'affaticamento nei pazienti con SM sono stati attribuiti a 4-AP. La sua formulazione a rilascio prolungato (fampridina) è stata approvata per il trattamento sintomatico della disabilità motoria nella SM. Gli effetti benefici sono stati spiegati dal blocco dei canali Kv assonali, migliorando così la conduzione lungo gli assoni demielinizzati. Tuttavia, un numero crescente di prove suggerisce che 4-AP potrebbe avere proprietà aggiuntive oltre alla modalità d'azione sintomatica. In questa recensione, riassumiamo i dati preclinici e clinici sulle possibili caratteristiche neuroprotettive di 4-AP.

4-Aminopiridina nelle malattie neurologiche

Le aminopiridine sono un gruppo di monoammina e diammino derivati ​​della piridina, che inibiscono i canali del potassio voltaggio-dipendenti (Kv). In particolare, i 2 bloccanti dei canali del potassio ad ampio spettro 4-aminopiridina (4-AP) e 3,4-aminopiridina (3,4- DAP) sono stati utilizzati come nuove sostanze sperimentali in varie malattie neurologiche. Anche se 3,{10}}DAP è un antagonista più potente dei canali del potassio, 4-AP attraversa più prontamente la barriera ematoencefalica1 ed è clinicamente superiore nei pazienti con SM, in particolare per il miglioramento della funzione visiva,2 affaticamento ,3 cognizione,4 e velocità di deambulazione.1 Inoltre, 4-AP è stato segnalato per facilitare la conduzione neurale in malattie neurologiche diverse dalla SM.5,6

Effetti della cistanche: proteggere i neuroni

Negli assoni sani, i canali Kv1.1 e Kv1.2 sono raggruppati vicino ai nodi di Ranvier.7 Questi canali vengono esposti dopo la demielinizzazione e migrano attraverso il segmento demielinizzato. Allo stesso tempo, l'espressione di questi canali è aumentata di parecchie volte.8 Questa ridistribuzione errata dei canali Kv compromette la trasmissione dei potenziali d'azione, portando a una disabilità permanente. 4-AP blocca questi canali del potassio esposti e quindi migliora la trasduzione del segnale.9,10Il canale Kv1.3 è stato scoperto nei linfociti T umani,11 è risultato essere altamente espresso negli infiltrati infiammatori nel cervello della SM,12 ed è espresso su macrofagi, microglia e cellule T della memoria effettrice.13 I bloccanti dei canali Kv1.3 selettivi e non selettivi potrebbero quindi fornire proprietà immunomodulatorie inibendo la proliferazione cellulare e la secrezione di citochine proinfiammatorie.14 Studi precedenti al 2009 non sono riusciti a stabilire 4-AP come un trattamento sintomatico per la SM perché i livelli ematici dei farmaci nei pazienti erano imprevedibili, con dosi eccessive associate al rischio di crisi epilettiche e alterazione della coscienza.15-18 Pertanto, è stata sviluppata la fampridina, la formulazione a rilascio prolungato di 4-AP e è stato successivamente approvato per il trattamento sintomatico della disabilità motoria nella SM.19-23 È interessante notare che, più recentemente, un numero crescente di prove suggerisce che oltre a queste effetti sintomatici ely riconosciuti, 4-AP potrebbe avere proprietà protettive aggiuntive.

Valutazione di 4-AP utilizzando modelli in vitro

In vitro, in numerosi modelli sono stati osservati effetti neuroprotettivi di 4-AP. Quando i motoneuroni (MN) si sono differenziati dalle cellule staminali pluripotenti indotte di pazienti con sclerosi laterale amiotrofica portatori di mutazioni del gene FUS e SOD1 sono stati esposti a 4-AP, gli squilibri dei canali ionici sono stati corretti, i livelli di attività neuronale aumentati, il reticolo endoplasmatico lo stress è diminuito e l'attivazione della caspasi è stata attenuata. I MN mutanti hanno mostrato correnti di sodio inferiori e rapporti Na più / K più, che potrebbero almeno in parte essere la ragione della loro ipereccitabilità. Questo è stato invertito dopo il 4-trattamento con AP, che ha portato a una diminuzione delle correnti di potassio e al ripristino dei modelli di attività spontanea e dell'input sinaptico nei MN.24 4-il trattamento con AP ha ridotto il rilascio di mediatori proinfiammatori dalla microglia umana infettata con amiloide- beta e neuroni dell'ippocampo di ratto in coltura protetti, bagnati in supernatanti da microglia trattata con beta-amiloide.25 Secondo quanto riferito, un derivato AP 4- ha ridotto l'accumulo di sinucleina, l'ossidazione, l'infiammazione e l'attivazione della chinasi Rho in un modello in vitro del morbo di Parkinson.26 Altri studi in vitro hanno riportato che 4-AP ha aumentato la fosforilazione della proteina legante gli elementi della risposta cAMP protetta dallo stress cellulare da glutammato, NMDA e 3-acido nitropropionico esercitato sui neuroni dei granuli cerebellari neonatali di ratto. Il glutammato porta a una ridotta vitalità anche nelle cellule precondizionate con 4-AP ma senza un'attivazione significativa della caspasi-3. Queste osservazioni hanno suggerito che 4-AP è principalmente efficace contro l'eccitotossicità necrotica.27 È stato anche dimostrato che protegge le colture neuronali primarie dalla privazione di ossigeno-glucosio o dalla tossicità dell'acido ouabain/DL-tre- -benzilossiaspartico.28

effetto neuroprotettivo di Cistanche

Studi preclinici in vivo su 4-AP

Diversi studi hanno studiato gli effetti protettivi di 4-AP in vari modelli di malattie (tabella 1). Nei modelli di schiacciamento del nervo di danno ai nervi periferici, il trattamento profilattico e precoce 4- AP ha richiesto il recupero della velocità di conduzione nervosa, ha promosso la rimielinizzazione e ha aumentato l'area assonale. Queste ultime osservazioni sono state spiegate da effetti simili a quelli che compaiono dopo la stimolazione elettrica, ad esempio, l'aumento dei livelli di fattore neurotrofico neuronale derivato dal cervello (BDNF).29 In un modello di malattia di Alzheimer, l'iniezione di amiloide-beta nell'ippocampo di Sprague Dawley i ratti hanno indotto un danno neuronale e una maggiore attivazione della microglia. È stato riscontrato che la somministrazione giornaliera di 1 mg/kg 4-AP sopprime l'attivazione microgliale e fornisce neuroprotezione. Ciò è stato attribuito alla capacità di 4-AP di bloccare la corrente K non inattivante che rettifica esternamente nella microglia attivata e di ridurre la produzione cellulare di citochine proinfiammatorie.25 Le indagini che utilizzano un modello in vivo di neurotossicità ippocampale indotta da kainato hanno rivelato solidi effetti neuroprotettivi di 4- {11}}AP che potrebbe essere abrogata dall'antagonista non competitivo del recettore NMDA MK-801 e dall'antagonista dell'adenosina A1 8-ciclopentilteofillina. Queste osservazioni suggeriscono che i recettori NMDA sono rilevanti per la 4-protezione mediata da AP in questo modello.30 In un modello animale di neuropatia autoimmune in ratti Lewis, 4-AP ha migliorato la gravità clinica e i risultati elettrofisiologici patologici. Gli autori hanno suggerito che la protezione assonale fosse fornita bloccando le correnti interne mediate dal sodio nella fase iniziale perché alti potenziali di membrana nella fase acuta dell'infiammazione possono essere neurotossici. Nella fase cronica, la conduzione nervosa è stata potenzialmente migliorata bloccando la corrente verso l'esterno mediata dal potassio.1

Nell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello di infiammazione del SNC immuno-mediata che replica le caratteristiche cardinali della SM, è stato riportato che il blocco del canale Kv inibisce l'attivazione dei linfociti T, potenzialmente bloccando i canali della sottofamiglia Kv1.3 e attenuando la demielinizzazione assonale e degenerazione agendo sul canale K.3.1 sull'astroglia, inducendo potenzialmente il segnale BDNF. ling. Nell'EAE indotta da proteine ​​proteolipidiche nei topi SJL,4-il trattamento con AP ha migliorato significativamente i punteggi digitali che sono stati confermati patologicamente. È stato osservato che l'espressione della proteina acida fibrillare gliale è sottoregolata nei 4- topi trattati con AP e l'attivazione delle cellule T e la polarizzazione Th1/17 sono state mitigate. Tuttavia, nel modello EAE cronico indotto dal peptide degli oligodendrociti mielinici (MOG) nei topi C57BL/6,4-AP non ha modificato il decorso dell'EAE.5 Un altro studio ha anche studiato gli effetti di {{19} }AP in un modello MOG-EAE in topi C57BL/6 e riportato effetti sintomatici ma non modificanti la malattia. Né un trattamento profilattico né terapeutico 4-AP ha attenuato la gravità del decorso EAE digitale, mentre 4- gli animali trattati con AP hanno mostrato una mobilità migliorata valutata mediante l'analisi dell'impronta e del rotarod. La demielinizzazione del midollo spinale, il danno neuronale e l'imaging MRI dei cambiamenti del volume cerebrale sono rimasti inalterati. Anche la proliferazione, la produzione di IL17 o IFN-y dei linfociti T CD4* non è stata influenzata.3

Più recentemente, abbiamo dimostrato che, a parte i suoi effetti sintomatici sul miglioramento della conduzione neurale, 4- AP può prevenire la neurodegenerazione della retina durante la neurite ottica sperimentale indotta da peptidi MOG (EAEON) nei topi C5BL6.'Utilizzando la tomografia a coerenza ottica in vivo( OCT) imaging, test della funzione visiva e valutazione istologica, abbiamo osservato una riduzione dell'entità della degenerazione degli strati retinici interni nei modelli di EAEON, sia per la somministrazione profilattica che terapeutica 4- AP. In questo modello, 4-AP ha potenziato gli effetti del trattamento immunomodulatore con il modulatore del recettore della sfingosina-1- fosfato fingolimod, suggerendo modalità d'azione indipendenti. È ragionevole presumere che questo effetto non sia limitato al solo fingolimod e sia applicabile a 4-AP in combinazione con altri farmaci immunomodulatori per la SM. Nel nostro studio, l'istologia del nervo ottico ha rivelato che, contrariamente a fingolimod,4-AP non ha avuto un'influenza significativa sull'attivazione microgliale e/o sull'infiltrazione di linfociti o macrofagi, suggerendo che gli effetti protettivi non erano correlati a una modalità antinfiammatoria di azione. In linea con ciò, 4-il trattamento con AP non ha interferito con l'induzione dell'EAE, convalidata da un test di restimolazione dei linfociti T. Inoltre, abbiamo osservato una protezione significativa dalla neurodegenerazione della retina durante il trattamento con 4-AP anche nel modello di schiacciamento del nervo ottico non infiammatorio, mentre, qui, fingolimod non ha avuto alcun effetto. È interessante notare che, in vitro, 4-il trattamento con AP non è riuscito a proteggere direttamente le cellule gangliari della retina. Invece, l'istologia e gli esperimenti in vitro hanno indicato la 4-stabilizzazione mediata da AP delle cellule precursori della mielina e degli oligodendrociti. Questo effetto è stato associato a un aumento dell'afflusso di calcio e alla traslocazione nucleare del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT). È stato precedentemente dimostrato che 4-AP regola l'omeostasi del calcio aumentando i livelli di inositolo trifosfato e provocando così il rilascio di calcio dalle riserve di calcio intracellulari. Tuttavia, ulteriori studi su 4-AP in modelli demielinizzanti, ad esempio, trattamento con cuprizone o modelli murini transgenici con ablazione inducibile di oligodendrociti potrebbero essere utili per confermare queste condizioni. Gli studi esistenti su modelli animali di demielinizzazione si concentrano principalmente sulla capacità di 4-AP di ripristinare il potenziale d'azione, ma mancano ulteriori indagini sulle cellule oligodendrogliali (figura).

È importante ricordare che le dosi necessarie per ottenere questi effetti in vitro sono circa 100-1,000xsuperiori alla concentrazione raggiunta nei pazienti. Pertanto, meccanismi aggiuntivi o di altro tipo potrebbero essere rilevanti per le osservazioni effettuate in vivo e in vitro. Questi includono, ma non sono limitati a, una ridotta dissipazione di energia degli assoni demielinizzati a causa del blocco della perdita di potassio e capacità protettive e riparative più forti nel cervello indirettamente risultanti da una maggiore mobilità e da un maggiore esercizio.

Inoltre, non è possibile escludere meccanismi immunomodulatori di 4-AP, soprattutto perché è stata dimostrata una ridotta attivazione dei linfociti T e polarizzazione Th1/17 nell'EAE indotta da PLP nei topi SJL.3 Inoltre, sono stati trovati studi preclinici di altri modelli di malattia un'attivazione attenuata e un rilascio ridotto di mediatori proinfiammatori da parte della microglia. Questi risultati controversi evidenziano i diversi meccanismi patologici dei diversi modelli animali, in cui le cellule immunitarie sono più o meno suscettibili alle strategie di trattamento. Le discrepanze tra i nostri risultati e le precedenti segnalazioni di effetti solo sintomatici nell'EAE indotta dal peptide MOG nei topi C57BL6" possono almeno in parte essere spiegate da (1) differenze di dosaggio perché altri usavano dosi di 100 ug e 600 ug/topo/giorno, considerando che abbiamo somministrato 250 ug/topo/giorno;(2)durata del trattamento (40,60 e 90 giorni da Göbel et al,* Moriguchi et al,3 e Dietrich et al, "rispettivamente); e (3) quantità di MOG utilizzata per l'immunizzazione perché abbiamo usato 200 ug MOG per topo, mentre altri usavano solo 100 ug MOG per topo. Ricerche recenti si concentrano sul ruolo del microbiota intestinale nell'influenzare l'induzione e la gravità dell'EAE alterando l'equilibrio dell'effettore e dei linfociti T e B regolatori. Il microbioma dei roditori può differire tra le strutture degli animali risultando in differenze nella gravità dell'EAE, nel decorso e forse anche nella risposta alle terapie. Presi insieme, questi fattori potrebbero spiegare l'eterogeneità dei risultati dello studio.

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Approccio clinico su 4-AP nei pazienti con SM

Diversi studi clinici a partire dagli anni '80 suggerivano già gli effetti benefici di 4-AP nelle persone con SM. Tra gli altri, hanno identificato il miglioramento delle funzioni motorie40-2 e visive-44 e l'affaticamento.5-7 Tuttavia, i limiti dello studio, l'assenza di un disegno di studio omogeneo e il numero ridotto di pazienti hanno impedito l'approvazione di {{ 5}}AP da parte delle autorità regolari e hanno portato a un uso off-label per più di 3 decenni.4 D'altra parte, alcuni di questi studi hanno facilitato lo sviluppo della formulazione a rilascio prolungato (SR-4-AP o fampridina) perché hanno riscontrato che i livelli plasmatici del composto originale a rilascio immediato erano incoerenti e imprevedibili. Il primo studio clinico con SR-4-AP è stato condotto nel 1997 da Schwid et al.,49 dimostrando un significativo miglioramento della velocità di deambulazione e una tendenza al miglioramento della forza muscolare.

Il sistema tecnologico a rilascio prolungato è stato sviluppato da Elan Pharmaceuticals. Ha utilizzato un cosiddetto sistema di assorbimento del farmaco a matrice, costituito da una matrice polimerica proprietaria che controlla il rilascio per diffusione e l'erosione da parte degli enzimi gastrointestinali. Ciò ha comportato livelli plasmatici di farmaco più bassi e una durata d'azione più lunga.1 Inizialmente, SR-4-AP è stato testato in 4 studi. Nel 2007, Goodman et al.1 hanno eseguito un range di dosaggio finale con incrementi di 5 mg da 10 a 40 mg due volte al giorno con 36 pazienti con SM. Nel Timed 25 Foot Walk Test (T25FW), non è stato osservato alcun cambiamento significativo, mentre un'analisi post hoc che converte i dati in velocità di camminata (piedi/s) ha raggiunto la significatività. Inoltre, è stato osservato un miglioramento della fatica auto-riferita. In uno studio di confronto delle dosi nel 2008 (randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo), Goodman et al.2 hanno reclutato 206 pazienti, ricevendo un placebo o dosi di 10,15 o 20 mg due volte al giorno. Anche in questo caso, l'analisi post hoc confrontando il miglioramento della velocità di deambulazione ha riscontrato esiti significativamente migliori per tutti i gruppi di trattamento individualmente e per tutti i pazienti trattati con SR-4-AP in pool rispetto al placebo. La forza della musa è stata migliorata per i gruppi trattati con 10-mg e 15-mg, ma non per i gruppi trattati con 20 mg rispetto ai soggetti con placebo. Nei 2 studi clinici di fase Ⅲ successivi (21-studio randomizzato in doppio cieco controllato con placebo, 301 pazienti e 14-studio clinico in doppio cieco controllato con placebo, 239 pazienti) con 10 mg due volte al giorno, i pazienti sono stati divisi in un gruppo responder e un gruppo non responder, definito da un miglioramento consistente su T25FW. In entrambi gli studi, l'aumento della velocità di deambulazione è stato significativo rispetto al gruppo non responder o placebo. Inoltre, c'è stato un miglioramento nel punteggio 12-Item MS Walking Scale(MSWS-12) per i rispondenti.2122

In uno studio di estensione in aperto di questi studi, è stato dimostrato che il miglioramento clinico è andato perso dopo la sospensione del farmaco, ma è tornato 2 settimane dopo la ripresa della terapia di SR-4-AP.Ampyra/Fampyra, la formulazione in compresse di SR{ {3}}AP ha ricevuto la piena approvazione dalla Food and Drug Administration nel gennaio 2010 per migliorare la deambulazione nei pazienti con SM, ma solo un'autorizzazione all'immissione in commercio condizionata nel 2011 dall'Agenzia europea per i medicinali (EMA). Sulla base delle prove citate, l'approvazione era subordinata alla disposizione di fornire dati di efficacia e sicurezza più a lungo termine. Pertanto, sono stati avviati uno studio esplorativo di fase II (MOBILE) e uno studio di conferma di fase I (ENHANCE).

Nello studio esplorativo MOBLE con 132 partecipanti, è stato riscontrato un miglioramento della velocità Patient Global Impression of Change (PGIC), MSWS-12 e Timed Up and Go (TUG)23 Per valutare l'efficacia e la sicurezza a lungo termine di SR-4-AP, è stato condotto lo studio di conferma ENHANCE (10 mg due volte al giorno in 646 pazienti con SM). Oltre ai miglioramenti riportati nello studio MOBILE, gli autori hanno riscontrato un miglioramento significativo dei pazienti trattati con SR-4-AP sulla 29-Item MS Impact Scale.5 L'EMA ha successivamente concesso l'approvazione incondizionata di SR{ {11}}AP per il trattamento di pazienti con SM con disabilità motorie. Lo studio osservazionale di fase ENABLE con 901 pazienti ha dimostrato che il trattamento con SR-4-AP è benefico per i pazienti con SM grazie al funzionamento fisico auto-percepito e alla salute psicologica in un contesto reale2(tabella 2).

Sulla base dei promettenti dati preclinici sulla protezione dalla neurodegenerazione retinica descritti sopra, il nostro gruppo ha condotto uno studio OCT retrospettivo e multicentrico per confrontare longitudinalmente la neurodegenerazione retinica tra 52 pazienti in terapia continua 4-AP e 51 controlli che sono stati abbinati per tutte le covariate rilevanti utilizzando un algoritmo di corrispondenza predefinito. In linea con i dati sperimentali, durante la terapia 4-AP concomitante, la degenerazione dello strato di fibre nervose retiniche maculari è stata ridotta in 2 anni. Tuttavia, questi risultati devono essere confermati in studi di coorte indipendenti e idealmente prospettici, soprattutto perché la dimensione dell'effetto era bassa e i tassi di assottigliamento dello strato di fibre nervose retiniche peripapillari e delle cellule gangliari maculari/strato plessiforme interno non differivano in modo significativo tra i gruppi . Queste discrepanze di un effetto protettivo di 4AP solo sull'mRNFL, ma né in pRNFL né in McGill, non sono facilmente spiegabili. È importante ricordare che, poiché 4AP è autorizzato solo per migliorare la disabilità della deambulazione nei pazienti con EDSS 3.5-5, i tassi di cambiamento analizzati sono stati studiati nelle fasi successive della malattia e senza neurite ottica acuta. In un tale contesto, si verificano solo cambiamenti retinici molto sottili e sarebbero necessarie grandi coorti per rilevare gli effetti del trattamento. Pertanto, lo studio retrospettivo sui pazienti non era certamente sufficientemente potente per rilevare in modo affidabile gli effetti del trattamento protettivo e non sorprende che solo uno degli esiti sia risultato positivo. Probabilmente, l'mRNFL era lo strato più sensibile per il rilevamento degli effetti del trattamento.5"

In sintesi, un numero crescente di prove in vivo suggerisce che 4-AP, oltre ai suoi noti effetti sintomatici, prevenendo la neurodegenerazione può modificare il decorso della malattia dell'EAEON e forse anche dei pazienti con SM. Prove preliminari in vitro implicano il coinvolgimento dei livelli di calcio cellulare e della via NFAT, ma sono necessarie ulteriori indagini per chiarire gli esatti meccanismi molecolari alla base dell'effetto neuroprotettivo di 4-AP nella demielinizzazione infiammatoria immuno-mediata. Questi risultati possono avere un impatto marcato sulle strategie di trattamento della SM se confermati in uno studio clinico prospettico randomizzato controllato.

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