Analisi metabolomica basata su NMR per gli effetti dell'integrazione di -chetoglutarato sui mioblasti C2C12 in diversi stati energetici

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1. Introduzione

Il muscolo scheletrico è l'organo più grande del corpo umano e svolge le normali attività della vita.Allenamento prolungatoo patologicol processi di malattie inducono danni muscolariOfornitura di energia muscolare insufficiente, in questo momento, il ripristino della forza e della funzione muscolare è particolarmente importante. Vari integratori alimentari sono stati impiegati per promuovere l'ipertrofia del muscolo scheletrico e migliorare le prestazioni sportive [1]. Essendo l'intersezione del metabolismo del carbonio organico e dell'azoto e contemporaneamente un intermedio critico nel ciclo del TCA, il -chetoglutarato (AKG) ha mostrato effetti pleiotropici per migliorare le prestazioni muscolari in esperimenti clinici e su animali [2-9]. Ad esempio, AKG può ridurre il danno della mucosa intestinale [8] e l'infiammazione [9], attenuare ilsviluppo del cancro colorettale[4] e la fibrosi epatica [5], promuovono la crescita [6] e riducono la morbilità eritardare l'invecchiamento[7]. Lavori precedenti hanno dimostrato che l'integrazione di AKG può alleviare la perdita muscolare mediante somministrazione parenterale in un modello traumatico di pazienti sottoposti a sostituzione totale dell'anca [2] e promuovere l'ipertrofia muscolare e la sintesi proteica attraverso le vie di segnalazione Akt/mTOR [10,11]. Nel caso della distrofia muscolare di Duchenne, l'integrazione con AKG può prevenire l'atrofia muscolare e la disfunzione attraverso la via mediata da PHD3/ADRB2- [12]. Il nostro lavoro precedente ha anche dimostrato che l'integrazione con AKG può facilitare profondamente la proliferazione dei mioblasti C2C12 e alleviare l'atrofia dei miotubi C2C12 coltivati ​​in un mezzo privo di glucosio [13]. Dato che il glucosio è la principale fonte di energia per mantenere le normali funzioni fisiologiche del muscolo scheletrico, gli effetti dell'integrazione di AKG per migliorare le prestazioni muscolari dipendono in gran parte dal livello di glucosio nel muscolo scheletrico. Le differenze degli effetti indotti da AKG nel muscolo scheletrico tra diversi stati energetici non sono chiare.

AKG partecipa alla sintesi di aminoacidi, vitamine eacidi organiciEmetabolismo energeticonel corpo, che comporta la conversione di AKG in glutammato da parte della glutammato deidrogenasi e la successiva amidazione del glutammato con ammoniaca da parte della glutammina sintetasi. L'AKG fornisce l'energia per la crescita cellulare attraverso il ciclo TCA e la fosforilazione ossidativa e promuove il metabolismo cellulare e la segnalazione interagendo con il suo recettore OXGR (un recettore accoppiato a proteine ​​G) sulla membrana cellulare [14,15]. Inoltre, l'AKG può regolare il metabolismo ossidativo mitocondriale e promuovere lo stato epigenetico permissivo mediando la transizione precoce dello stato cellulare embrionale e lo sviluppo delle cellule germinali [16]. Inoltre, l'AKG indotto dall'esercizio può stimolare il suo recettore OXGR1 nelle ghiandole surrenali per controllare la termogenesi e la scomposizione dei trigliceridi nel tessuto adiposo e produrre effetti benefici sul metabolismo [17].

Tuttavia, sono stati condotti pochi studi per rivelare i cambiamenti metabolici indotti da AKG del muscolo scheletrico in diversi stati energetici e i meccanismi metabolici sottostanti. Recentemente, l'analisi metabolomica è stata impiegata per chiarire sistematicamente i meccanismi molecolari alla base degli effetti benefici dell'integrazione nutrizionale. Le alternanze di metaboliti che agiscono come prodotti a valle della trascrizione genica possono riflettere intuitivamente i cambiamenti metabolici complessivi. Come tecniche particolarmente adatte per rilevare quantitativamente alterazioni dei livelli di metaboliti in biofluidi, tessuti e cellule, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) 1H ad alta risoluzione è stata ampiamente applicata nelle analisi metabolomiche. Significativamente, la profilazione metabolomica basata su NMR presenta diversi vantaggi come l'elevata riproducibilità, la misurazione quantitativa senza pregiudizi e la comoda preparazione del campione [18,19]. In precedenza, abbiamo eseguito analisi metabolomiche basate su NMR per chiarire sia gli effetti dell'integrazione di creatina sui mioblasti C2C12 [20], sia gli effetti dell'integrazione di alanil-glutammina sui mioblasti danneggiati dalla privazione di energia [21].

2. Risultati

2.1. Proliferazione e differenziazione dei mioblasti C2C12 con integrazione di AKG

Le cellule di mioblasto C2C12 coltivate in un normale terreno di crescita con e senza integrazione di AKG sono state raggruppate come Nor-A e Nor, mentre quelle in terreno di crescita a basso contenuto di glucosio con o senza integrazione di AKG sono state raggruppate come Low-A e Low. Coerentemente con lo studio precedente [10], le cellule Nor-A con integrazione di AKG a una concentrazione di 2 mm hanno mostrato una vitalità cellulare significativamente migliorata rispetto alle cellule Nor (Figura S1).

Pertanto, la concentrazione di AKG di 2 mm è stata utilizzata negli esperimenti per valutare i cambiamenti indotti da AKG nella proliferazione e differenziazione dei mioblasti. Rispetto alle cellule Nor, le cellule basse hanno mostrato un tasso di proliferazione profondamente diminuito a causa della carenza di energia (Figura 1A). Anche se l'integrazione di AKG non ha causato una morfologia significativamente diversa dei mioblasti nei due stati energetici, non solo ha migliorato il tasso di proliferazione delle cellule basse coltivate in un mezzo a basso contenuto di glucosio, ma ha anche migliorato quello delle cellule Nor coltivate in un mezzo normale secondo studi precedenti [10,12]. I numeri di cellule per una data area sono stati contati per i quattro gruppi di mioblasti (n=4 per il gruppo): Nor, 563,8 ± 10.4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Basso, 493,8 ± 14,5; LA basso, 547,0 ± 11,7 (Figura 1B). Vale la pena notare che le cellule Low-A non mostravano numeri di cellule statisticamente diversi dalle cellule Nor, indicando che l'integrazione di AKG potrebbe recuperare i numeri di cellule per i mioblasti in condizioni di coltura a basso contenuto di glucosio (Figura 1B).

Figura 1, Capacità di proliferazione e differenziazione dei mioblasti C2C12 nelle condizioni di coltura normale e bassa. coltura del glucosio. (A) Morfologie dei mioblasti. (B) Numeri di cella corrispondenti al pannello A (n=4). (C) Viabilità cellulare relativa alle cellule Nor analizzate mediante saggio di proliferazione cellulare MTS (n=5). (D) Espressioni di MyoD1 nei mioblasti analizzati mediante western blot. L'anticorpo anti-GAPDH è stato utilizzato per standardizzare la quantità di proteine ​​in ciascuna corsia. (E) Analisi statistica corrispondente ai pannelli (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Inoltre, è stato eseguito il test MTS per confrontare quantitativamente i tassi di proliferazione dei quattro gruppi di cellule (Figura 1C). Le cellule basse avevano un tasso di proliferazione nettamente ridotto rispetto alle cellule Nor, indicando che il mezzo a basso contenuto di glucosio sfavoriva la proliferazione delle cellule. Significativamente, l'integrazione con AKG ha migliorato i tassi di proliferazione delle cellule Nor-A e Low-A rispetto alle cellule Nor e Low, rispettivamente. Si noti che le cellule Low-A hanno mostrato una capacità di proliferazione inferiore rispetto alle cellule Nor, il che implica che l'integrazione con AKG ha ripristinato solo parzialmente la proliferazione delle cellule coltivate in un terreno a basso contenuto di glucosio

L'espressione della proteina di differenziazione miogenica 1 (MyoD1) viene solitamente utilizzata per caratterizzare la capacità di differenziazione delle cellule. Abbiamo quindi confrontato quantitativamente le espressioni di MyoD1 tra i quattro gruppi di cellule (Figura 1D). Le cellule basse hanno mostrato una capacità di differenziazione profondamente ridotta rispetto alle cellule Nor. Significativamente, la supplementazione di AKG ha aumentato le capacità di differenziazione delle cellule coltivate sia in mezzo normale che in mezzo a basso contenuto di glucosio, come indicato da un aumento di circa il 30% dell'espressione di MyoD1 nelle cellule Nor-A e Low-A. In particolare, le cellule Low-A non hanno mostrato un'espressione MyoD1 statisticamente significativamente diversa dalle cellule Nor, il che implica l'elevata efficienza dell'integrazione di AKG per ripristinare la capacità di differenziazione delle cellule coltivate in un mezzo a basso contenuto di glucosio.

Inoltre, abbiamo analizzato le capacità di differenziazione dei miotubi per i quattro gruppi di mioblasti C2C12. I miotubi si sono formati attraverso la fusione di mioblasti coltivati ​​in terreni di differenziazione normali e a basso contenuto di glucosio con o senza supplementazione di AKG (Figura S3). Le morfologie dei miotubi C2C12 hanno mostrato che la coltura a basso contenuto di glucosio ha compromesso la capacità di differenziazione dei miotubi delle cellule e l'integrazione di AKG potrebbe promuovere la differenziazione dei miotubi dei mioblasti coltivati ​​sia in un mezzo normale che in un mezzo a basso contenuto di glucosio.

2.2. Spettri NMR di estratti acquosi di mioblasti C2C12

Tipici spettri NMR 850 MHz 1H sono stati registrati su estratti acquosi derivati ​​dai gruppi Nor, Nor-A, Low e Low-A dei mioblasti C2C12 (Figura 2A). Un totale di 34 metaboliti è stato assegnato e riassunto nella Tabella S1. Le assegnazioni di risonanza dei metaboliti sono state confermate utilizzando gli spettri 2D 1H-13C HSOC e 1H-H TOCSY (Figure S4 e S5). L'ispezione visiva degli spettri NMR ha indicato che la coltura di mioblasti con l'integrazione di AKG ha provocato accumuli significativi di AKG intracellulare nelle cellule Nor-A e Low-A (Figura 2B).

Figura 2, Spettri medi di risonanza magnetica nucleare (NMR) a 850 MHz lH registrati su estratti acquosi derivati ​​dai gruppi Nor, Nor-A, Low e Low-A dei mioblasti C2C12. (A) Confronto degli spettri NMR medi dei quattro gruppi. Le scale verticali sono state mantenute costanti in tutti gli spettri lH NMR. La regione dell'acqua (4.7-5.2 ppm) è stata rimossa (B) Regioni amplificate locali dei picchi di a-chetoglutarato (AKG). Linea blu/verde/gialla/rossa: regioni spettrali dei gruppi Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, a-chetoglutarato; PC, O-fosfocolina; GPC, sn-glicero-3-fosfocolinaUDP-glucosio, uridina difosfato glucosio: CTP, sn-glicero-3-fosfocolina; NAD plus, nicotinammide adenina dinucleotide AXP adenina mono/di/trifosfato.

2.3. Analisi dei dati multivariata per esplorare i profili metabolici cellulari

Abbiamo inoltre eseguito un'analisi dei dati multivariata sui dati spettrali NMR per la profilazione metabolica dei quattro gruppi di mioblasti C2C12. Per prima cosa abbiamo stabilito tre modelli PCA non supervisionati con i primi due componenti (PC1, PC2) per esaminare le tendenze di raggruppamento e rivelare differenze metaboliche tra i gruppi di mioblasti. I grafici del punteggio ThePCA mostrano che il profilo metabolico delle cellule coltivate in un mezzo a basso contenuto di glucosio era nettamente distinto da quello coltivato in un mezzo normale (Figura 3A) e l'integrazione di AKC ha modificato significativamente i modelli metabolici delle cellule coltivate sia in un mezzo normale che in mezzo a basso contenuto di glucosio (Figura 3B,C). Tuttavia, la differenza metabolica tra i gruppi Nor-A e Nor era maggiore di quella tra i gruppi Low-A e Low, il che implica che gli effetti dell'integrazione di AKG sul profilo metabolico dei mioblasti dipendono fortemente dallo stato energetico delle cellule.

Figura 3. Le analisi multivariate per gli spettri 'HNMR sono state registrate su estratti acquosi derivati ​​da mioblasti C2C12 dei gruppi Nor, Nor-A, Low e Low-A. (AC) Grafici dei punteggi PCA dei gruppi Low e Nor, dei gruppi Low-A e Low dei gruppi Nor-A e Nor; (DF) Grafici dei punteggi OPIS-DA dei gruppi Basso e Nor (R2: 0.999, 02: 0.996), dei gruppi Basso-Ae Basso (R2: 0.918: 02: 0.761), i gruppi Nor-A e Nor (R2: 0.927: 02: 0.838). I puntini di sospensione indicano il limite di confidenza del 95%.

Inoltre, abbiamo stabilito tre modelli OPLS-DA supervisionati per illustrare le separazioni metaboliche tra i quattro gruppi di mioblasti (Figura 3D-F). Come previsto, i modelli OPLSDA hanno massimizzato le distinzioni metaboliche tra i quattro gruppi riservando le informazioni sulle variabili ortogonali correlate e filtrando le informazioni sulle variabili ortogonali non correlate. Inoltre, abbiamo eseguito test di permutazione casuale (n=200) per valutare l'affidabilità dei modelli OPLS-DA (Figura S6), che indicano la validità dei modelli OPLS-DA stabiliti.

2.4. Identificazioni di metaboliti differenziali e importanti

Per confrontare quantitativamente i livelli di metaboliti tra i quattro gruppi di mioblasti C2C12, abbiamo calcolato i livelli relativi dei metaboliti identificati in base ai loro integrali relativi (Tabella S2). L'integrazione di AKG ha notevolmente aumentato i livelli intracellulari di AKG nei gruppi Nor-A e Low-A, ma non ha modificato significativamente quelli nel gruppo Nor e Low. Abbiamo condotto il test t di Student per identificare i metaboliti differenziali con un criterio di p <0.05 (Figura 4). Il confronto tra Nor vs. Low ha identificato 29 metaboliti differenziali (Figura 4A), inclusi 18 metaboliti potenziati (leucina, isoleucina, valina, acetato, glutammato, glutammina, metionina, aspartato, lisina, creatina, PC (O-fosfocolina) taurina, tirosina , fenilalanina, istidina, NAD plus , formiato, AXP) e 11 hanno rifiutato Metabo. liti (glutatione, piroglutammato, fosfocreatina, beta-alanina, GPC, glucosio, glicina, acetato, treonina, GTP, UDP-glucosio). Il confronto tra metaboliti differenziali Low-A vs. Low-identified (Figura 4B), inclusi 7 metaboliti aumentati (etanolo, AKGbeta-alanina, PC, taurina, glicina e GTP) e 3 metaboliti diminuiti (glutammina, lisina e mioinositolo). Il confronto tra Nor-A vs. Nor ha identificato 18 metaboliti differenziali (Figura 4C), inclusi 6 metaboliti up-regolati (AKG, piroglutammato, glutammina, lisina, glucosio, lattato) e 12 metaboliti down-regolati (alanina, acetato, glutatione metionina, fosfocreatina, PC, mioinositolo, glicina, treonina, GTP, UDP-glucosio e AXP).

Figura 4. Le intensità relative dei metaboliti differenziali sono state identificate dai confronti a coppie tra i quattro gruppi di mioblasti C2C12. (A) Basso vs Né; (B) LA basso contro basso; (C) Nor-A contro Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} per ogni gruppo.

Inoltre, abbiamo utilizzato i modelli OPLS-DA per identificare importanti metaboliti con un criterio VIP > 1 (Figura 5). In totale, 12, 10 e 10 metaboliti importanti sono stati identificati dai modelli OPLS-DA di Nor-A vs. Nor, Nor vs. Low, Low-A vs. Low.

Figura 5. I punteggi VIP di metaboliti importanti sono stati identificati dai confronti a coppie tra i quattro gruppi di mioblasti C2C12. (A) Basso vs Né; (B) LA basso contro basso; (C) Nor-A contro Nor. Il carattere rosso/blu indica livelli aumentati/diminuiti del metabolita.

La combinazione dei metaboliti importanti identificati e dei metaboliti differenziali ha prodotto metaboliti caratteristici (Tabella 1). I confronti a coppie di Low vs. Nor, Low-A vs. Low e Nor-A vs. Nor hanno identificato rispettivamente 10, 6 e 10 metaboliti caratteristici, indicando che gli effetti dell'integrazione di AKG sui mioblasti erano strettamente associati all'energia stato delle cellule

2.5. Identificazione del metabolismo significativamente alterato

Percorsi Abbiamo eseguito l'analisi del percorso metabolico per identificare percorsi metabolici significativamente alterati (percorsi significativi) in base ai livelli di metaboliti identificati dai confronti a coppie tra i quattro gruppi di mioblasti C1C12 (Figura S7; Tabella 2 e Tabella S3). L'analisi di Nor vs. Low ha identificato 11 percorsi significativi: (1) metabolismo di alanina, aspartato e glutammato; (2) Metabolismo di glicina, serina e treonina; (3) Metabolismo del glutatione; (4) Metabolismo della D-glutammina e del D-glutammato; (5) Metabolismo dell'amido e del saccarosio; (6) metabolismo della beta-alanina; (7) Metabolismo della taurina e dell'ipotaurina; (8) Metabolismo della fenilalanina; (9) biosintesi di fenilalanina, tirosina e triptofano; (10) Metabolismo del nicotinato e della nicotinammide; (11) Metabolismo dell'istidina. Questo percorso significativo è stato associato al metabolismo energetico, allo stress ossidativo e al flusso anaplerotico del ciclo TCA.

L'analisi di Nor-A vs. Nor ha identificato solo i primi cinque percorsi significativi 1–5 escludendo gli altri sei percorsi 6–11. Diversamente, l'analisi di Low-A vs. Low ha identificato solo sei percorsi significativi: i primi quattro percorsi 1–4 condivisi dai confronti di Low vs. Nor, Nor-A vs. Nor; due percorsi 6-7 condivisi dal confronto tra Basso e Nor. Si noti che l'integrazione di AKG non ha alterato in modo significativo la via 5 (metabolismo dell'amido e del saccarosio) nelle cellule coltivate in un terreno a basso contenuto di glucosio, ma ha interferito con altre due vie (metabolismo della beta-alanina e metabolismo della taurina e dell'ipotaurina). Per visualizzare i cambiamenti indotti da AKG nei metaboliti caratteristici, abbiamo proiettato questi metaboliti su una mappa metabolica basata sul database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Figura 6). KEGG è stato ampiamente utilizzato come una delle principali risorse di dati per ricostruire reti metaboliche e mette in evidenza percorsi metabolici significativi. Sia i metaboliti caratteristici modificati che le vie metaboliche significativamente alterate forniscono nuove informazioni sui meccanismi molecolari alla base degli effetti dell'integrazione di AKG sui mioblasti C2C12.