Un nuovo test multi-biomarcatore per il monitoraggio quantitativo non invasivo del danno renale

Drew Watson¹, Giosuè YC Yang^1,2,3et al

Astratto:L'attuale standard di cura misura perrenefunzione, proteinuria e creatinina sierica (SCr) sono scarsi predittori di stadio inizialerenepatologia. Misure in grado di rilevarecronicorenepatologianelle sue fasi iniziali sono necessari per consentire l'intervento terapeutico e ridurre gli esiti avversi dicronicorenepatologia. Abbiamo sviluppato il Kidney Injury Test (KIT) e un nuovo KIT Score basato sulla misurazione composita e sulla convalida di più biomarcatori su un set unico di 397 campioni di urina. Il test viene eseguito su campioni di urina che non richiedono elaborazione nel sito di raccolta e senza sequenziamento o amplificazione del target. Abbiamo cercato di verificare che il test KIT predefinito, il punteggio KIT e le soglie cliniche fossero correlate con quelle stabilitecronicorenepatologia(insufficienza renale cronica) e possono fornire informazioni predittive sullo stato precoce di danno renale al di là e al di là delle sole misurazioni della proteinuria e della funzione renale. Le analisi statistiche su sei marcatori di DNA, proteine ​​e metaboliti sono state eseguite su un sottogruppo di campioni residui di urine spot coninsufficienza renale cronicache ha soddisfatto i controlli di qualità delle prestazioni del test dei pazienti che frequentavano i laboratori clinici dell'Università della California, San Francisco (UCSF) come parte di uno studio prospettico in corso approvato dall'IRB. I criteri di inclusione includevano una selezione di pazienti con confermainsufficienza renale cronicae normali controlli sani; i criteri di esclusione includevano informazioni incomplete o mancanti per la classificazione del campione, ritardi logistici nel trasporto/trattamento dei campioni di urina o un volume di campione basso e danno renale acuto. Regressione logistica multivariata direnelesionele statistiche sul rapporto di stato e verosimiglianza sono state utilizzate per valutare il contributo del punteggio KIT per la previsione direnelesionestato e stadio dell'insufficienza renale cronica, nonché valutare il potenziale contributo del punteggio KIT per l'individuazione della fase inizialeinsufficienza renale cronicaal di sopra e al di là delle tradizionali misure di funzionalità renale. I campioni di urina sono stati elaborati da un'immunosonda proprietaria per misurare il DNA privo di cellule (cfDNA), il cfDNA metilato, la clusterina, il CXCL10, la proteina totale e la creatinina. Il punteggio KIT e il gruppo di rischio del punteggio KIT stratificato (alto contro basso) avevano una sensibilità e specificità per il rilevamento dello stato di danno renale (sano oinsufficienza renale cronica) del 97,3% (IC 95%: 94,6–99,3%) e del 94,1% (IC 95%: 82,3–100%). Inoltre, nei pazienti con funzionalità renale normale (tasso di filtrazione glomerulare stimato (eGFR) > 90), il KIT Score identifica chiaramente quelli con fattori di rischio predisponenti perinsufficienza renale cronica, che non è stato rilevato da eGFR o proteinuria (p < 0.001).="" il="" punteggio="" kit="" scopre="" un="" carico="" di="" danno="" renale="" che="" potrebbe="" essere="" ancora="" incompleto,="" aprendo="" la="" porta="" a="" una="" diagnosi="" precoce,="" un="" intervento="" e="" una="" conservazione="" della="" funzione="">

Parole chiave:Saggio KIT; cronicorenepatologia; biomarcatore; non invasivo; urina; eGFR; cfDNA

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1. Introduzione

Cronicorenepatologia(CKD) è un problema di salute pubblica mondiale, con un carico globale di 850 milioni di persone.insufficienza renale cronicaviene ora riconosciuta come una "epidemia nascosta", poiché la maggior parte dei pazienti con stadi iniziali di insufficienza renale cronica (~11% della popolazione adulta mondiale) non viene riconosciuta, poiché non hanno sintomi e non sono consapevoli del loro aumentato rischio di problemi cardiaci, infezioni , ricovero e insufficienza renale. Pertanto, l'insufficienza renale cronica spesso non è considerata un grave problema di salute, anche se colpisce il doppio del numero di diabetici (422 milioni) e oltre 20 volte il numero di persone con cancro (42 milioni) o HIV/AIDS (36,7 milioni).

CKD is defined as a reduced renal reserve, persisting for >3 mesi e/o una diagnosi precedente di una condizione con un rischio noto direnedamage [1]. CKD is defined in a five-stage classification system for the assessment of kidney injury as patients advance towards the need for dialysis or transplantation [2]. The current standard of care tests, the blood-based serum creatinine (SCr) assay (and its use to calculate the estimated glomerular filtration rate or eGFR [3]) and protein in the urine, detect CKD 3–5 (eGFR of s60 mL/min/1.73 m2 of body surface area). However, most cases of CKD 1–2 (CKD >60 ml/min/1,73 m2 di superficie corporea) non vengono rilevati. L'eGFR ha una scarsa sensibilità per il rilevamento precoce di CKD, poiché la ridondanza intrinseca della riserva renale maschera l'aumento precoce della SCr. Le biopsie renali, spesso innescate con stadi più avanzati di CKD, hanno valore per valutare la patologia, ma sono invasive, costose [4] e non possono essere utilizzate per il monitoraggio seriale della progressione di CKD.

Molteplici fattori scatenanti e fattori di rischio iniziano la cascata direnedanno dentroinsufficienza renale cronica, con progressione a insufficienza renale (CKD 5). Ci sono oltre 10 milioni di persone in tutto il mondo che necessitano di una terapia di salvataggio del rene con il supporto per tutta la vita dalla dialisi o dal trapianto di rene. Sebbene la dialisi e il trapianto forniscano una sostituzione funzionale del rene, entrambi sono ancora gravati da diversi impatti negativi sulla morbilità e mortalità dei pazienti. C'è anche un marcato impatto della CKD su altri sistemi di organi nel corpo;insufficienza renale cronicai pazienti hanno maggiori rischi di infezioni, decessi cardiovascolari e cancro [5].

La diagnosi precoce del danno renale è fondamentale, poiché il trattamento ininsufficienza renale cronica1-2 può provocare la conservazione renale invertendo o rallentando la progressione del danno renale [6]. Attualmente, i test delle urine disponibili non sono in grado di rilevare bassi livelli di danno renale [7-14] e sono stati valutati principalmente nel danno renale acuto (AKI), con scarsa discriminazione per CKD [9]. Pertanto, esiste un'esigenza critica insoddisfatta di sviluppare una diagnostica sensibile, quantitativa e non invasiva per rilevare la CKD 1–3. La diagnosi precoce e il trattamento precoce dell'insufficienza renale mitigherebbero il carico globale della malattia e ridurrebbero l'enorme onere finanziario sui bilanci sanitari nazionali [15-21].

The primary aim of this study was to perform an assessment of multiple novels and known urine biomarker measurements to conduct an inexpensive, portable assay, called the Kidney Injury Test (KIT) in consecutive patients presenting with CKD at a large tertiary health care system, and develop and independently validate a quantitative KIT Score to reflect the diferent CKD stages. The KIT assay performance was also directly compared to the current standard of care tests (eGFR and proteinuria). A secondary aim was to explore the accuracy of the KIT assay to detect and quantitate kidney injury in CKD 1–2, i.e., subjects with normal eGFR (>60) ma con fattori di rischio predisponenti per CKD. Questo rapporto descrive il processo di selezione dei biomarcatori, lo sviluppo dell'algoritmo e la convalida indipendente del punteggio KIT come una nuova diagnostica per la valutazione e la quantificazione di entrambi gli stadi iniziali e tardivi.renedanno.

2. Sezione Sperimentale

2.1. Selezione del paziente

L'urina residua e casuale è stata raccolta da 1169 pazienti sequenziali dai laboratori clinici dell'Università della California, San Francisco (UCSF), nell'arco di 3 mesi, da ottobre 2016 a gennaio 2017, come parte dei test clinici di routine al Parnassus e a Mission Bay laboratori clinici del campus. La selezione dei campioni per una diagnosi di CKD è stata arricchita selezionando campioni di urina ottenuti dalle cliniche di nefrologia, diabete o cardiologia dell'UCSF. Per facilitare il potere statistico, lo studio è stato arricchito per i pazienti ad aumentato rischio di malattia renale, utilizzando i seguenti criteri: il paziente aveva una diagnosi confermata di CKD (ICD10 codice N18 [22]), nessuna diagnosi di CKD ma una diagnosi attuale di diabete , ipertensione o malattia autoimmune, nessuna CKD ma una storia familiare positiva di CKD, nessuna CKD ma di età superiore ai 60 anni o da uno status di minoranza etnica. I pazienti con AKI non sono stati inclusi in questo studio, con il seguente razionale: (1) questo primo studio su KIT è focalizzato sullo sviluppo e la convalida delle metriche quantitative e funzionali del punteggio KIT in un continuum cronico di progressione della malattia renale. L'AKI ha una traiettoria diversa con esordio acuto e risoluzione; (2) l'AKI può avere una risoluzione completa o incompleta della lesione, quindi la riduzione del punteggio KIT dopo la risoluzione dell'AKI diventerà clinicamente interpretabile quando gli intervalli di punteggio KIT sono stati stabiliti in questo documento per diversi stadi funzionali di CKD; (3) L'AKI è una delle cause del rischio di CKD, ma la maggior parte dei casi di CKD, come il diabete e l'ipertensione, non inizia con l'AKI. Uno studio del punteggio KIT in AKI è pianificato come studio di follow-up.

Ai fini dello sviluppo del KIT Score, la causa rilevante di CKD o il fattore di rischio predisponente per CKD è stata catturata dalle cartelle cliniche elettroniche (EHR), insieme alle variabili demografiche e SCr, per consentire il calcolo dell'eGFR [23]. Per ogni paziente è stata confermata la presenza e la causa della malattia renale attraverso una revisione clinica delle cartelle cliniche e di laboratorio. Le cause più comuni di insufficienza renale cronica in questa coorte sono state: malattie sistemiche immuno-mediate che possono causare danno renale (come nefrite lupica, artrite reumatoide, sindrome di Sjogren), ipertensione, diabete (tipo 1 e 2), malattia glomerulare (questi casi erano biopsia confermata con nefropatia da IgA, glomerulonefrite membranoproliferativa o glomerulosclerosi segmentaria focale) e uropatia ostruttiva (vescica neurogena, valvole uretrali posteriori e idronefrosi). Nella coorte di pazienti con insufficienza renale cronica, il 74,8% dei pazienti aveva 2 o più diagnosi cliniche rilevanti per lo sviluppo e la progressione di insufficienza renale cronica, mentre il 13,3% dei pazienti presentava diabete e ipertensione come fattori di rischio di doppia lesione renale in assenza di una diagnosi clinica di insufficienza renale cronica , che riflette l'elevata prevalenza di queste comorbidità nella popolazione generale. La causa dell'insufficienza renale cronica non è stata filtrata e sono state rilevate tutte le cause che contribuiscono all'insufficienza renale cronica.

To avoid degradation of the biomarkers in the KIT assay, urine samples were either processed within an hour of collection or stored at 4 C and processed within 24 h. Samples were discarded or not included for analysis in this study if the sample volume was less than 2 mL, there were insufficient data to confirm patient CKD diagnosis, or there was a>24 h di ritardo nell'elaborazione del campione per motivi logistici. Dopo il processo di filtraggio di cui sopra, abbiamo avuto una selezione finale di 343 campioni di urina unici da 343 pazienti. Abbiamo anche ottenuto ulteriori campioni di urina da 54 controlli sani selezionati tra volontari in buona salute, con SCr normale, senza proteinuria e senza fattori di rischio identificabili di CKD. Lo studio ha aderito alle Dichiarazioni di Helsinki e Istanbul ed è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dell'UCSF (IRB 16-21108) e l'IRB ha rinunciato al requisito del consenso informato.

2.2. Metodi di analisi KIT

2.2.1. Elaborazione del campione

I campioni di urina sono stati raccolti in contenitori sterili (cattura pulita, vuoto intermedio), indipendentemente da ematuria o proteinuria micro o macroscopica. I campioni di urina sono stati centrifugati a 2000× g per 30 minuti a 4 oC. Il supernatante è stato separato dal pellet di urina contenente cellule e detriti cellulari. Il pH del supernatante è stato regolato a 7,0 utilizzando Tris–HCl e conservato a _80oC nel biorepository UCSF fino a ulteriori analisi.

2.2.2. KIT Biomarcatori

KIT immette misurazioni normalizzate di 6 biomarcatori urinari primari. Il primo biomarcatore era il DNA privo di cellule (cfDNA): come misura del carico apoptotico totale del danno renale [24], misurato da un'immunosonda chemiluminescente complementare oligonucleotidica 5' biotinilata per mirare specificamente ai frammenti di cfDNA nel danno renale [25]. Questo approccio supera i limiti della lunga elaborazione del campione, della costosa amplificazione della PCR [26], del rilevamento di SNP ([27,28] o dei metodi di sequenziamento del DNA [29], altrimenti impiegati per misurare il cfDNA nel sangue [27,30]. I marcatori misurati con ELISA includono il cfDNA metilato (m-cfDNA) per affinare la proporzione di cfDNA che può essere più rilevante per il danno parenchimale renale [31,32]; CXCL10, come marker di infiammazione [33–37]; clusterina, come marker di danno tubulare renale [38,39]; proteine ​​totali, come marker tardivo di danno glomerulare [40,41]; e creatinina, come marker normalizzante in quanto può essere influenzata dalla massa corporea, dalla nutrizione e/o dall'idratazione e utilizzata per evitare la necessità di una raccolta delle urine a tempo [42,43].

2.3. Analisi statistica

2.3.1. Sviluppo del punteggio KIT

Il campionamento casuale è stato utilizzato per suddividere la 397-coorte di pazienti in un set di addestramento (n=233, con 37 controlli sani), stratificato per stato di danno renale. La modellazione casuale della foresta è stata utilizzata per identificare le relazioni tra i diversi marcatori per il rilevamento di CKD ad alta sensibilità. I modelli predittivi sono stati addestrati utilizzando metodi statistici e di apprendimento automatico per lo sviluppo dell'algoritmo KIT Score, in tutti e sei i biomarcatori di DNA e proteine ​​selezionati e la partizione multidimensionale di queste misurazioni del test è stata basata su soglie cliniche identificate incorporando l'SCr e il rischio aggiuntivo noto variabili per CKD come razza, sesso ed età. Infine, un semplice modello lineare che incorpora la partizione risultante è stato sviluppato nel KIT Score con una soglia aggiuntiva per la valutazione del rischio basso e alto di CKD.

2.3.2. Convalida del punteggio KIT

Un sottogruppo di validazione indipendente di 164 pazienti, con 17 controlli sani, è stato successivamente utilizzato per validare in modo prospettico il test KIT pre-specificato e il punteggio KIT. La regressione logistica è stata utilizzata per confrontare il modello (completo) con gli attuali test standard di cura, le sole proteine ​​urinarie e l'eGFR. Un valore p < 0.01="" per="" il="" corrispondente="" test="" del="" rapporto="" di="" verosimiglianza="" è="" stato="" considerato="" significativo.="" sono="" state="" eseguite="" analisi="" di="" regressione="" logistica="" per="" valutare="" l'accuratezza="" della="" soglia="" del="" punteggio="" kit="" pre-specificata="" per="" i="" gruppi="" di="" rischio="" del="" punteggio="" kit="" categoriale="" (basso="" e="" alto).="" sono="" state="" calcolate="" la="" sensibilità="" e="" la="" specificità="" del="" punteggio="" kit="" quantitativo="" e="" qualitativo="" risultante,="" insieme="" agli="" intervalli="" di="" confidenza="" del="">

T-test and logistic regression were used to compare the pre-defined KIT Score and model patient status (individuals predisposed to CKD versus healthy subjects), to assess its ability to distinguish subjects with early stages of CKD (eGFR 60–90, CKD 2) and normal eGFR but with predisposing risk factors for developing kidney damage (>90, CKD 1), da volontari sani (eGFR > 90) che non hanno fattori di rischio predisponenti noti. Un valore p < 0,01="" è="" stato="" considerato="">

3. Risultati

Dei 1169 pazienti reclutati e dei campioni di urina raccolti, 201 campione soddisfacevano i criteri di esclusione del basso volume di urina e sono stati sottoposti a triage da ulteriori analisi, lasciando 968 pazienti (dati demografici nella Tabella 1). La distribuzione della proteinuria in questi 968 pazienti (da 0 a 5469,73; mediana (IQR) di 4,69 (0–39,11) mg/mmol) e l'intervallo di eGFR (calcolato per tutti i pazienti con insufficienza renale cronica [23] (Figura 1C) ) evidenzia che abbiamo catturato lo spettro della malattia di CKD (Figura 1A). Da questa coorte, 397 pazienti e campioni unici sono sopravvissuti ai criteri di esclusione (vedi Metodi). Le eziologie della loro lesione renale comprendevano un'ampia e multipla gamma di malattie, con l'ipertensione come causa contribuente per il 42% dei pazienti (Figura 1B). Oltre il 60% dei pazienti ha avuto più di una causa che ha contribuito al danno renale. Dato che questa è una realtà per la maggior parte dei pazienti con insufficienza renale cronica, in particolare quando passano alle fasi successive dell'insufficienza renale cronica, il punteggio KIT è stato modellato per rilevare un danno renale indipendentemente dalla causa sottostante. Nonostante la proteinuria sia l'attuale gold standard per la valutazione non invasiva del danno renale, non c'era correlazione tra l'eGFR e il rapporto proteine ​​urinarie/creatinina (R2=0.0087) e, come dimostrato da altri ricercatori [44] ], la proteinuria era scarsa nelle fasi di classificazione dell'insufficienza renale cronica (Figura 2).

L'obiettivo principale di questo studio era sviluppare un punteggio KIT composito scalabile da {{0}} (basso rischio) a 100 (rischio alto) e valutare prospetticamente la capacità di un punteggio KIT quantitativo per l'individuazione di danno renale con un alto grado di sensibilità e specificità. Mostriamo che, sebbene le attuali misure della funzione renale (eGFR e proteinuria) siano predittive di CKD in stadio avanzato (Tabella 2), il ridimensionamento quantitativo del punteggio KIT da 0 (rischio più basso) a 100 (rischio più alto) fornisce informazioni predittive

sullo stato di danno renale al di sopra e al di là della proteinuria e della sola funzione renale (rapporto di probabilità x {0}}.507, p-value < 0,0001)="" e="" supera="" gli="" attuali="" test="" standard="" di="" cura="" (tabella="" 3).="" la="" creatinina="" urinaria="" è="" utilizzata="" a="" fini="" di="" normalizzazione="" nell'algoritmo="" kit="" e="" controlla="" le="" variazioni="" diurne="" e="" di="" idratazione="" (ovviando="" così="" alla="" necessità="" di="" qualsiasi="" campionamento="" delle="" urine="" a="" tempo)="" e="" non="" era="" significativa="" per="" lo="" stadio="" di="" ckd="" nelle="" analisi="" multivariate="" (valore="" p="0).">

We also developed a qualitative KIT Score, an approach that can have important implications for population kidney risk assessment. A pre-defined risk threshold of 18.5 was established in the training data, allowing the separation of the KIT Scores into low (s18.5) and high risk (>18.5) gruppi di danno renale. Ciò è stato confermato nel set di test per fornire informazioni predittive sullo stato del danno renale al di sopra e al di là della proteinuria e dell'eGFR (il rapporto di probabilità era x=44.244, p-value <>

La sensibilità e la specificità stimate del punteggio KIT per il rilevamento di CKD sono rispettivamente del 97,3% (CI 95% bootstrap: 94,6, 99,3%) e del 94,1% (CI 95% bootstrap: 82,3, 100%). Al contrario, la sensibilità e la specificità della proteinuria erano rispettivamente del 46,9% (bootstrap 95% CI: 38,8, 55,8%) e dell'88,2% (bootstrap 95% CI: 70,6, 100% ) per gli stessi campioni. Allo stesso modo, la sensibilità di SCr era del 65,6 percento (bootstrap 95 percento CI: 57,4, 73,8 percento). La stima dei valori predittivi negativi e positivi del KIT Score dipende dal tasso di prevalenza della malattia, pertanto il tasso di prevalenza dell'ipertensione può essere utilizzato come esempio. La prevalenza dell'ipertensione nella popolazione generale degli Stati Uniti è di circa il 33 per cento. Di conseguenza, il valore predittivo positivo e negativo stimato del punteggio KIT quantitativo per l'ipertensione sarebbe rispettivamente di circa 89,1% e 98,2%.

Mostriamo il contributo dei singoli biomarcatori al punteggio KIT di seguito (Tabella 4). L'abbondanza di cfDNA nelle urine era altamente variabile tra le diverse categorie di malattie renali e non era correlata in modo indipendente con lo stadio di CKD. Le correlazioni tra i singoli biomarcatori erano piccole (la più grande correlazione R2=0.14 era tra eGFR e proteine), suggerendo che ciascuno dei biomarcatori fornisce informazioni indipendenti per la previsione dello stato di danno renale. Le analisi dei componenti principali (PCA) (Figura 2B) chiariscono la relazione tra le combinazioni lineari indipendenti dei biomarcatori e la variabilità totale nelle misurazioni del test ed evidenziano l'importante contributo di m-cfDNA, cf-DNA e CXCL10 in quanto forniscono un valore indipendente nel generazione del punteggio KIT composito. La clusterina era l'unico biomarcatore dello stato di danno renale che non era significativo nelle analisi multivariate (p-value=0.1671). Questi fattori evidenziano che, nonostante i dati pubblicati sulle correlazioni tra l'abbondanza di cfDNA nel sangue e la disfunzione renale [27,28], il cfDNA urinario in questi contesti non sarebbe sufficiente, ed è utile includere più biomarcatori per lo sviluppo del punteggio KIT composito per Valutazione dell'insufficienza renale cronica.

CXCL10 is a key inflammatory cytokine dysregulated in immune-mediated renal injury [45–51]. To evaluate where CXCL10 identifies a specific cause of CKD, such as immune-mediated causes of renal injury from systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-positive vasculitis, we evaluated which CKD categories had a high abundance of urinary CXCL10. Interestingly, only ~30% of the immune-mediated cohort had very high CXCL10 values (>100 pg/mL), mentre, in molti campioni di danno renale immuno-mediato, questi valori erano bassi e possono riflettere la remissione della malattia o l'esposizione all'immunoterapia. Con nostra sorpresa, circa il 30 percento delle coorti ipertese e diabetiche aveva anche livelli urinari elevati di CXCL10, senza alcuna malattia sistemica immuno-mediata identificata. Non c'era alcuna associazione tra i livelli urinari di CXCL10 e lo stadio di CKD.

Figure 2C displays the KIT Score, shown here as a function of CKD stage (based on the eGFR) and matched with presence (red dots) or absence (black dots) of proteinuria (threshold cut of urine protein/creatinine ratio of >0.2). The healthy controls are marked in green and are shown in a pre-CKD 1 or CKD 0 stage where the eGFR is >90 ml/min/1,73 m2 come in CKD 1, senza proteinuria o rischio identificato di danno renale. È importante notare che circa il 15% dei controlli sani testati qui ha un lieve aumento del punteggio KIT (appena sopra la soglia di rischio elevato di 18,5). In questa fase dello studio, non siamo in grado di identificare se questi controlli sani con punteggi KIT più elevati abbiano fattori di rischio non rilevati per danno renale, poiché tutti i soggetti sono stati resi anonimi.

La tabella 5 mostra una ripartizione del punteggio KIT medio per stadio di CKD e per i volontari sani, e si nota una traiettoria significativa di aumento del punteggio KIT con l'avanzamento dello stadio di CKD. Il punteggio KIT può facilmente distinguere CKD 1 e 2 (28,9; IC 95%: 27,9, 29,9) da volontari sani senza CKD (11.0; IC 95%: 9,5, 12,6); valore p < 0.00001).="" rispetto="" ai="" controlli="" sani,="" esiste="" una="" forte="" associazione="" tra="" il="" kit="" score="" e="" la="" predisposizione="" al="" danno="" renale,="" anche="" nei="" soggetti="" con="" funzione="" renale="" normale="" in="" ckd="" 1="" (egfr=""> 90), con un rapporto di probabilità di x=148.4 (valore p LR < 0,0001)="" e="" una="" soglia="" di="" analisi="" di="" 18,5="" avevano="" una="" sensibilità="" e="" specificità="" di="" 92,9="" (ic="" esatto="" al="" 95%:="" 87,0%,="" 96,7%)="" e="" 94,4%="" (ic="" esatto="" al="" 95%:="" 84,6,="" 98,8%),="" rispettivamente.="" questo="" stesso="" effetto="" è="" stato="" ulteriormente="" amplificato="" per="" la="" capacità="" dei="" test="" kit="" di="" rilevare="" sia="" ckd="" 1="" che="" 2,="" con="" un="" rapporto="" di="" verosimiglianza="" x="196.5" (valore="" p="" lr="">< 0,0001),="">

the >18.5 KIT Score threshold having a sensitivity of 95.8% (exact 95% CI: 92.2, 98.1%) for early CKD detection. A total of 60% of patients in CKD 1 have elevated KIT Scores >18.5, anche se hanno una funzione renale "normale" e nessuna proteinuria. Questi sono esattamente i pazienti target che vogliamo catturare con il test KIT poiché la loro insufficienza renale cronica allo stadio iniziale non sarebbe rilevata dagli attuali test standard di cura. Infatti, il KIT Score identifica il 92% dei pazienti con insufficienza renale cronica 1 che non hanno proteinuria come affetti da danno renale precoce. In CKD 2–3, sebbene circa il 60% dei pazienti non presenti proteinuria, il KIT Score rileva tutti i pazienti come ad alto rischio e fornisce diverse misure quantitative per il carico di lesioni di CKD di ciascun paziente. In CKD 4–5, la proteinuria e i punteggi KIT sono più concordanti poiché il danno renale è avanzato e la proteinuria è riconosciuta come un marker tardivo di danno renale.

Pertanto, questi risultati collettivi dimostrano chiaramente che il test raggiunge i suoi obiettivi primari e secondari di predire il danno renale con una sensibilità maggiore rispetto agli attuali test standard di cura (eGFR, SCr, proteinuria) e, a differenza dei nostri attuali test clinici, il KIT Score può identificare accuratamente gli stadi precoci di CKD negli screening della popolazione.

4. Discussione

La forza trainante dietro lo sviluppo del test KIT e del punteggio KIT è stata il riconoscimento dell'enorme e crescente carico di danno renale non riconosciuto [52], aggravato dalla debolezza dell'attuale standard di test di cura [53] nello scoprire il carico reale e "nascosto" della malattia renale. Il monitoraggio del danno renale negli individui mediante il campionamento delle urine è sempre stato un obiettivo altamente auspicabile, poiché il segnale biologico dell'urina può fornire una finestra altamente informativa sulla salute del rene. Tuttavia, un test delle urine per predire il danno renale, indipendentemente dalla causa sottostante, rimane un'esigenza clinicamente insoddisfatta e una sfida biochimica da eseguire, poiché ci sono molte sostanze interferenti nelle urine come le proteasi [54,55], con conseguente degradazione dei biomarcatori e elevata varianza interindividuale nel pH delle urine, tutte cose che possono confondere lo sviluppo di un robusto test di laboratorio. Studi proteomici mirati [56-59], alimentati dal campionamento delle urine protocollato da studi clinici prospettici, nell'arco di un decennio (nei nostri laboratori presso la Stanford University e l'UCSF), hanno portato allo sviluppo di procedure operative standard (SOP) per la raccolta e la stabilizzazione delle urine , elaborazione, valutazione delle sostanze interferenti, conservazione e trasporto da siti distanti a un laboratorio centrale di elaborazione [60]. Inoltre, oltre un decennio di studi sulla proteomica delle urine trascrizionali e basati su LC-MS/MS [48,50,58,61-64] hanno portato a una comprensione biologica più profonda del danno renale attraverso diverse cause di CKD, che ha guidato la selezione di biomarcatori da includere nel test KIT per rappresentare la lesione in diversi compartimenti intra-renali.

Questa ricerca completa ci ha portato a sei biomarcatori: cDNA, cfDNA metilato, clusterina, CXCL10, creatinina e proteine ​​urinarie. Il DNA privo di cellule è stato riconosciuto come un marcatore sensibile del carico di malattia nel plasma di pazienti con malattie autoimmuni [65,66] e tumori [67]. Tuttavia, la loro utilità nel plasma è limitata nel contesto di molteplici malattie e morbilità, poiché il carico totale di cfDNA rifletterebbe i processi cumulativi di varie malattie, mentre la misurazione del DNA libero da cellule specifiche per organo o sito nel plasma richiede tecnologie di sequenziamento avanzate e bioinformatica [68,69]. Tuttavia, poiché il cfDNA nelle urine riflette in modo specifico i contributi del rene, il test KIT cfDNA consente il rilevamento estremamente sensibile del danno renale tramite un test ELISA economico. La misurazione dei frammenti metilati di cfDNA fornisce un'ulteriore specificità per quanto riguarda il tipo di lesione. Mentre l'ipermetilazione globale è stata associata a danno renale correlato al sistema immunitario e aumento della fibrosi, l'ipometilazione globale è associata al declino renale correlato all'invecchiamento e al danno da ischemia-riperfusione renale [31,32,70]. Come con la nostra logica nella misurazione del cfDNA, troviamo che i cambiamenti globali nello stato di metilazione del cfDNA consentono un'accurata discriminazione tra gli stati di malattia renale senza la necessità di sequenziamento loci-specifico o PCR.

CXCL10 è stato ben affermato come marker di danno immuno-mediato in una varietà di contesti grazie al suo ruolo di ligando per il recettore CXCR3 [33,34,37,45,51,71]. In precedenza abbiamo dimostrato che CXCL10 e cfDNA, misurati tramite il test KIT, possono rilevare la disfunzione cronica dell'allotrapianto polmonare nel trapianto di polmone così come il rigetto nel trapianto di rene [35,72,73]. Sorprendentemente, ciò che abbiamo trovato nel presente studio è che esiste un numero significativo di pazienti con malattie renali tradizionalmente non immuni, come l'ipertensione e il diabete di tipo 2, che avevano CXCL10 elevato, indicando potenzialmente un'utilità più ampia nell'individuazione di lesione renale allo stadio. Studi precedenti hanno identificato il diabete di tipo 2 come una componente significativa mediata da CXCL10-[74] e hanno identificato il CXCL10 prodotto da cellule endoteliali come un contributo all'ipertensione essenziale [75]. I nostri risultati suggeriscono che CXCL10 può identificare non solo i pazienti con danno renale immuno-mediato, ma anche quelli di altre cause, che tendono a presentarsi insidiosamente con sintomi clinici tardivi relativi alla progressione della malattia.

La proteina totale urinaria e la clusterina sono marcatori consolidati di disfunzione renale [38,40,41] e la creatinina è ben validata sul campo come biomarcatore normalizzante [42,43]. Sorprendentemente, troviamo che la clusterina, dopo analisi multivariate, non è significativa nel nostro modello di danno renale nel contesto degli altri nostri biomarcatori. Ciò può essere dovuto a una serie di cause, inclusa la sua correlazione con il rapporto tra proteine ​​totali e creatinina, i cui componenti sono già inclusi nel modello [38], nonché l'elevata variazione spot dovuta ai ritmi ultradiani del livelli plasmatici e urinari correlati di clusterina [76,77].

La diagnosi precoce di danno renale ha una ramificazione molto importante nel limitare il tasso di progressione dell'insufficienza renale cronica e avere un impatto positivo sull'assistenza sanitaria in tutto il mondo. Poiché i cambiamenti emodinamici renali sono estremamente sensibili alle perturbazioni sistemiche, una migliore gestione delle principali cause alla base dell'insufficienza renale cronica sarebbe un beneficio immediato, in particolare il migliore e stretto controllo della pressione sanguigna [78], la stabilità e uno stretto controllo dell'iperglicemia [79] e diagnosi precoce e immediata immunomodulazione per l'abrogazione dell'infiammazione e del danno renale nelle malattie sistemiche immuno-mediate come il lupus eritematoso sistemico [80] e l'artrite reumatoide [81]. Aumenti persistenti e precoci del punteggio potrebbero attivare l'imaging renale per valutare l'uropatia ostruttiva, con un intervento tempestivo per prevenire l'elevata pressione intrarenale e la progressiva fibrosi interstiziale renale e dropout tubulare. È molto probabile che la diagnosi precoce di danno renale si verifichi nell'ambito delle cure primarie, dove la disponibilità di un rapido throughput, un semplice test con una lettura quantitativa del punteggio di rischio renale può innescare un rinvio anticipato a un nefrologo per il controllo della pressione sanguigna, la dieta modificazione, trattamento della malattia vascolare coronarica e/o periferica, causa alla base dell'insufficienza renale cronica e considerazione delle terapie di conservazione renale [82,83]. La possibilità di monitorare quantitativamente la risoluzione del punteggio KIT nel tempo offre l'opportunità di monitorare la risoluzione del danno renale. Oltre alla scelta di utilizzare farmaci o supporto per controllare meglio la malattia sistemica, i nuovi farmaci renoprotettivi, come gli inibitori SGLT2 e altri [84], evidenziano ulteriormente quanto sia cruciale essere in grado di rilevare un danno renale molto precoce, trattare e invertirlo.

I ritardi nell'individuazione delle lesioni renali e di conseguenza il rinvio dei pazienti rappresentano un ostacolo significativo all'inserimento di nuovi pazienti in regimi terapeutici efficaci mentre hanno ancora la possibilità di massimizzare i benefici delle terapie di conservazione della funzionalità renale. Per sottolineare quanti pazienti "perdono" l'opportunità di una diagnosi di CKD nelle prime fasi della loro malattia, i pazienti con ESRD si rivolgono al pronto soccorso a un tasso sei volte superiore al tasso medio nazionale per gli adulti statunitensi, la metà dei quali comporta il ricovero in ospedale [85]. Pertanto, oltre all'utilizzo del punteggio KIT per monitorare il recupero renale, è estremamente utile utilizzare questo test anche per monitorare la progressione del danno renale in modo che gli interventi possano essere effettuati secondo necessità per stabilizzare la progressione della traiettoria del punteggio KIT. L'osservazione che un terzo dei pazienti con eziologia di insufficienza renale cronica a causa di ipertensione o diabete ha anche un forte ambiente immunitario/infiammatorio come parte del loro danno renale suggerisce che l'apprezzamento dell'eterogeneità biologica di diverse malattie categoriali da parte dei singoli valori dei biomarcatori nel test KIT, e altri studi interrogativi, consentiranno approcci più personalizzati al trattamento per i pazienti con insufficienza renale cronica.

Sono in programma e sono in corso studi in base ai quali una valutazione seriale del KIT Score predefinito con il test KIT predefinito ci consentirà di valutare il valore dei singoli biomarcatori nel test durante il danno renale e il recupero renale. Inoltre, stiamo avviando collaborazioni con partner farmaceutici in cui la valutazione seriale del test KIT può essere utilizzata come mezzo per tracciare in modo non invasivo e accurato il danno renale precoce da nefrotossicità da farmaci, inerente a molti immunomodulatori, come la calcineurina inibitori [86] e agenti anti-TNF [87]; agenti chemioterapici come cisplatino [88], aminoglicosidi [89] e immunoterapie più recenti [90], nonché esposizione a mezzi di contrasto a radionuclidi per scopi di imaging [91]. Ulteriori coorti vengono assemblate per l'analisi in cui i pazienti sono stati seguiti longitudinalmente nel corso della progressione di CKD, il che ci consentirà di comprendere meglio la traiettoria granulare del punteggio KIT e possibilmente aiutare a perfezionare gli stadi di CKD.

Poiché i biomarcatori del test sono stati scelti e il test è stato sviluppato con l'intento specifico di rilevare un danno renale molto precoce, abbiamo anche osservato che il test KIT è in grado di rilevare che una piccola percentuale di controlli "normali" mostra punteggi KIT urinari che si aggirano a livelli elevati soglia di rischio di 18,5. Sebbene non sia confermato, è possibile che non si tratti di test noise e questi casi sono veri positivi con un'identificazione molto precoce del rischio di danno renale nello stadio pre-CKD 1 o CKD 0. Poiché il 96% delle persone con insufficienza renale cronica non si rende conto di averlo [92], una sfida significativa nello sviluppo di modelli di danno renale è l'elevata probabilità che i pazienti reclutati come controlli sani abbiano effettivamente una malattia renale allo stadio iniziale. Ad esempio, il progetto sulla longevità umana, guidato da Craig Venter con il test Health Nucleus, ha ampiamente sequenziato ed eseguito ulteriori test di screening di adulti senza sintomi e ha trovato correlazioni cliniche di potenziali malattie nel 21% dei partecipanti "sani" allo studio, inclusi quelli urologici /malattie renali, suggerendo la necessità di un maggiore screening. Ciò è particolarmente vero per le malattie in cui un intervento precoce può ritardare o addirittura invertire la progressione della malattia. Troviamo che l'insufficienza renale cronica e il danno renale nel loro insieme siano una malattia esemplare in cui questo è vero, poiché numerosi stili di vita e interventi terapeutici possono prevenire un'ulteriore progressione del declino della funzione renale [6,82,83,92].

Una limitazione dell'attuale disegno dello studio è l'uso di una popolazione arricchita per i soggetti con insufficienza renale cronica da un centro di cure terziarie. I soggetti ottenuti da più screening e contesti comunitari possono essere più rappresentativi della popolazione generale, in particolare per l'individuazione di insufficienza renale cronica allo stadio iniziale. Inoltre, lo studio è stato trasversale e potrebbe non aver rappresentato completamente l'insufficienza renale cronica allo stadio iniziale e avanzato. Sono previsti studi longitudinali che monitorano i pazienti con segni di insufficienza renale cronica allo stadio iniziale per una migliore valutazione delle capacità di diagnosi precoce del punteggio KIT e per l'impatto della diagnosi precoce sulla progressione di insufficienza renale cronica. Infine, potrebbe essere possibile aumentare ulteriormente il KIT Score con ulteriori biomarcatori per consentire una migliore diagnosi differenziale dell'insufficienza renale cronica e ridurre al minimo la necessità di misurare la creatinina sierica e la proteinuria.

L'impatto economico positivo della diagnosi precoce di danno renale e del suo trattamento non può essere sottolineato. Quasi un terzo del budget di Medicare è destinato alla gestione dei danni e delle malattie renali negli Stati Uniti. La perdita della funzionalità renale nella CKD 5 aggiunge un onere fiscale aggiuntivo di ~$80,{2}} all'anno a causa del supporto della dialisi. Sebbene il trapianto renale consenta ai pazienti di uscire dalla dialisi, la carenza di donatori renali, vivi e cadaverici, il trapianto renale, con un costo della procedura iniziale di ~$100,000, seguito da costi di mantenimento dei farmaci di ~$20,{{ 6}}/anno, provoca solo una piccola ammaccatura nel budget Medicare per la dialisi [93]. Si prevede che la traiettoria per il numero di pazienti con insufficienza renale cronica continuerà a crescere in tutto il mondo, con tendenze maggiori nell'obesità, con conseguente aumento del numero di persone con ipertensione e diabete [94]. Inoltre, le variazioni etniche nelle malattie renali determinano problemi sanitari nazionali, richiedendo lo screening della popolazione con biopsie renali per la diagnosi precoce del danno renale da malattia renale IgA nel sud-est asiatico [95], dove la malattia renale da IgA è la prima causa di insufficienza renale . L'inclusione di un saggio non invasivo sensibile per il danno renale, in sostituzione di procedure bioptiche invasive, costose e ad alta morbilità, comporterebbe importanti benefici socioeconomici per queste popolazioni a rischio.

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In conclusione, questo studio fornisce il progetto per i biomarcatori del dosaggio KIT, il processo di sviluppo dell'algoritmo del dosaggio KIT, la definizione del punteggio KIT e le sue prestazioni per la diagnosi precoce del danno renale e il suo confronto diretto con l'attuale standard di test di cura. Questo studio propone che il test KIT potrebbe essere utilizzato (1) come test di screening quando vi è il timore di comorbidità note per aumentare il rischio di insufficienza renale cronica, come morbilità cardiovascolare, obesità, diabete, senza documentazione di anomalie renali funzione dai saggi correnti; (2) come test aggiuntivo per monitorare l'onere e l'accurata progressione dell'insufficienza renale cronica nei pazienti in cui gli attuali test standard di cura hanno già rilevato un danno renale, cioè pazienti con insufficienza renale preesistente nota in diversi stadi della malattia renale; (3) per consentire la valutazione sensibile del recupero da danno renale quando esposto a diverse terapie renoprotettive e opzioni di gestione. Sono necessari e pianificati ulteriori studi per lo screening longitudinale dei pazienti nel tempo per comprendere meglio la storia naturale della progressione dell'insufficienza renale cronica, i benefici della diagnosi precoce, dell'intervento e del monitoraggio e i punti di infezione in cui la lesione dell'insufficienza renale diventa fissa e progressiva .

Contributi dell'autore:MMS, JYCY, DW e TKS hanno progettato lo studio e gli esperimenti; JML, ID, VL, SS, DL, KS, RS, AC, PC.L. e ML hanno condotto esperimenti; DW, JYCY, RDS e MMS hanno analizzato i dati; DW, JYCY e MMS hanno realizzato le figure; JYCY, DW, RDS, TKS e MMS hanno redatto e rivisto il documento; tutti gli autori hanno rivisto criticamente il manoscritto per importanti contenuti intellettuali e hanno approvato la versione finale del manoscritto. L'MMS ha avuto pieno accesso a tutti i dati dello studio e si assume la responsabilità dell'integrità dei dati e dell'accuratezza dell'analisi dei dati.

Finanziamento:MMS e TKS hanno il supporto della ricerca dal NIH (NIAID e NIDDK). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta dei dati, nell'analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Ringraziamenti:Siamo grati per l'aiuto di medici, coordinatori clinici, personale di ricerca, pazienti e famiglie di pazienti.

Conflitto di interessi:MMS, DW e JYCY sono i fondatori di KIT Bio, Inc. (Los Altos, CA, USA), la cui proprietà intellettuale è di proprietà esclusiva di Regents, University of California San Francisco e concessa in licenza a KIT Bio. Tutti gli altri autori non dichiarano alcun conflitto di interessi

1. KIT Bio, 665 3rd Street, San Francisco, CA 94107, USA; drew@kit.bio (DW); joshua.yang@ucsf.edu (JYCY)

2. Dipartimento di Chirurgia, Università della California San Francisco, San Francisco, CA 94143, USA;

reuben.sarwal@ucsf.edu (RDS); tara.sigdel@ucsf.edu (TKS); juliane.liberto@ucsf.edu (JML);

izabella.damm@ucsfmedctr.org (ID); victorialouie11@gmail.com (VL); shristisigdel@gmail.com (SS); peichen@berkeley.edu (P.-CL)

3. Master in Medicina Traslazionale, Università della California Berkeley, Berkeley, CA 94720, USA; devonlivingstone@berkeley.edu (DL); Caterina_soh@berkeley.edu (KS); archakra@berkeley.edu (CA); liangmichael@berkeley.edu (ML)

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