Numerosi composti terapeutici sono stati isolati da risorse organiche naturalmente abbondanti

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Numerosi composti terapeutici sono stati isolati da risorse organiche naturalmente abbondanti, che possono offrire fonti economiche e sostenibili di composti con attività biologiche sicure ed efficaci. Nell'industria cosmetica sono ricercatissimi composti naturali con attività antietà. Pertanto, abbiamo preparato vari estratti dalle foglie di Rubusfraxinifolius e utilizzato saggi di inibizione enzimatica per isolare composti con effetti protettivi contro l'invecchiamento cutaneo. Due triterpenoidi sono stati isolati da Rubus fraxinifolius Poir. foglie. Le strutture sono state caratterizzate da analisi spettroscopiche (LC-ESI-MS, 1D/2D NMR) e confronto con i dati riportati. I composti 1 e 2 sono stati determinati come 2,3-O-glicole etilenico,19-idrossiuri-12-en-23,28-acido dioico e 2,{{15} }O-propandiolo,19-idrossiuri-12-en{19}}acido oico. L'estratto e gli isolati di metanolo sono stati valutati per i loro effetti inibitori su elastasi e tirosinasi. I composti 1 e 2 hanno inibito l'elastasi con ICso 122,199 ug/mL e 98,22 ug/mL, e hanno anche inibito la tirosinasi con ICso 207,79 ug/esercito e 221,51 ug/mL, rispettivamente. L'aggancio molecolare ha dimostrato che entrambi i composti hanno affinità con gli enzimi.

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Sebbene siano difficili da ottenere, le sostanze antietà naturali che sono sicure per l'uomo possono essere raccolte in modo economico e sostenibile da abbondanti risorse naturali. Circa 700 specie di Rubus (Rosaceae) sono distribuite a livello globale, anche se poche specie si trovano ai tropici. Questo genere contiene sostanze nutritive (zucchero, vitamine, ecc.), metaboliti secondari (triterpenoidi, flavonoidi, polifenoli, ecc.), e svolge numerose attività anti-invecchiamento (antiossidante, elastasi formica, tirosinasi formica, anti-collagenasi, anti-UV, antinfiammatorio, cicatrizzante, ecc.)1. Inoltre, le specie Rubus hanno anche riferito di contenere diversi triterpeni con varie attività biologiche -'.

In Indonesia, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) è distribuito in Java, Borneo, ecc., e popolarmente noto come 'urbano.cos'è la cistancheInoltre, alcuni agricoltori locali raccolgono queste piante e i frutti di bosco vengono solitamente consumati freschi o congelati. Il nostro studio precedente ha dimostrato che l'estratto di stelo di R. frascinifolius ha l'attività di inibire l'elastasi, la tirosinasi e come antiossidante8. Alcune altre indagini hanno anche mostrato che la foglia e il frutto di R. fraxinifolius hanno una potente attività antiossidante? 10. Tuttavia, lo studio di R. fraxinifolius è stato poco studiato e non sono stati riportati studi sui componenti chimici.

Cistanche può antietà

L'elastasi è un enzima della serina proteasi, che ha un ruolo cruciale nella formazione di rughe o cedimenti della pelle attraverso la degradazione della fibra elastica dermica (elastina) e causa la perdita di elasticità della pelle. Uno di questi è l'elastasi derivata dai fibroblasti cutanei. Pertanto, come moderatori della degradazione della fibra di elastina che causa l'invecchiamento della pelle, gli inibitori dell'elastasi hanno attirato l'attenzione come agenti per i preparati cosmetici,12. La melanogenesi è mediata dalla tirosinasi e regola la biosintesi della melanina attraverso una reazione a due stadi. Nella fase iniziale, la L-tirosina viene idrossilata a L-3,{5}}diidrossifenilalanina (L-DOPA). Nella seconda fase, la L-DOPA viene ossidata nel corrispondente O-chinone. Pertanto, i composti naturali con attività inibitoria della tirosinasi sono comunemente usati nei cosmetici che inibiscono l'iperpigmentazione con la melanina e quindi favoriscono lo sbiancamento della pelle.Cstanche antietàGli inibitori dell'enzima elastasi e tirosinasi potrebbero essere sviluppati come agenti sbiancanti per la pelle, antietà o antirughe per il trattamento di disturbi dermatologici44.

Questo studio ha isolato i triterpenoidi di ursano dalle foglie di R.fraxinifolius e ne ha chiarito le strutture in analisi spettroscopiche utilizzando la spettroscopia di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) e 'H NMR, |3CNMR e 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC e HMBC). Successivamente, abbiamo eseguito analisi delle attività inibitorie dell'elastasi e della tirosinasi di estratti grezzi, frazioni e composti isolati.

L'attività di due composti selezionati è stata osservata anche attraverso il metodo in silico in questa ricerca. Un approccio di docking molecolare è stato eseguito con DockThorl516. Le macromolecole utilizzate in questa ricerca sono state ottenute dalla banca dati di proteine ​​(RCSB PDB, 2000) con identità 2y9x e 3hgp per tirosinasi ed elastasi, rispettivamente 718. Le macromolecole sono state ottimizzate inUCSF Chimera e i risultati di docking molecolare sono stati osservati con PyMOL1920.

risultati e discussione

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 percento in 100 ug/mL, mentre l'estratto di n-esano non aveva attività (Fig. 1). Alcuni Rubus hanno anche mostrato attività inibitoria dell'elastasi come R. Sanctus（inibizione percentuale 14.68-49.20 in 100 ug/mL）, R.compactus,R. robustus, ecc.221. Quindi, abbiamo frazionato gli estratti attivi utilizzando la cromatografia liquida sotto vuoto/VLC e raccolto ll frazioni da ciascuno. Le frazioni dell'estratto di acetato di etile hanno mostrato deboli attività inibitorie dell'elastasi (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Gli isolati sono stati identificati e caratterizzati mediante cromatografia liquida-spettroscopia di massa (LCMS), 'H e 13CNMR, DEPT, coerenza quantistica singola eteronucleare (HSQC), correlazione quantistica multipla eteronucleare (HMQC) e correlazione a legame multiplo eteronucleare (HMBC). La tabella 1 mostrava i dati spettrali NMR dei composti.

Composto 1: è stato isolato come polvere bianca amorfa. Gli spettri LCMS-ESI per questo composto hanno mostrato un picco di ioni molecolari a m/z 543,32[MH]t, suggerendo la formula molecolare C32H48O- con nove equivalenti di insaturazione. Gli spettri IR hanno rivelato massimi di assorbimento corrispondenti a idrossile (3,343,4 cm-l) e gruppi funzionali olefinici (1,684 cm-1).Inoltre, "gli spettri H NMR del composto I hanno rivelato un segnale di singoletto a 2,6, un segnale caratteristico per l'H-18 di tipo ursano triterpeni con 19-sostituzioni O. Il triterpene tipo 19a-idrossi-ursano ha anche un tipico segnale protonico nell'area intorno a ou 2,6 ppm. Questo segnale deschermato può differire notevolmente da altri segnali di protoni metilenici ordinali, con uno spostamento caratteristico dovuto a un protone olefinico(H12)a ou 5.28(t,J{29}}Hz).cistanche benefíciosLe assegnazioni complete e inequivocabili dello spostamento chimico 'H e l3C sono state assistite dagli spettri HMQC(13Cx'H) e HMBC(15Cx'H). Dal picco incrociato HMBC, il protone a ou 2,60 è stato confermato essere H{ {5}}(Fig.2a). Altri caratteri specifici sono stati trovati per i cinque singoletti metilici a 1,89,1.02,0.82,1.32,1.20(each,H24-27;29),un doppietto metilico a og 0,92(d, J=6 Hz) e il segnale del protone olefinico a 5,30(t, J=7 Hz, H{25}}). Gli spettri presenti13CNMR mostrano 32 risonanze di carbonio e, con gli spettri DEPT e HMQC, hanno mostrato due carboni carbonilici (δC183.70, C-28 e 8-178.96, C-23), un carbonio olefinico at oc 127.23,C-12,un carbonio quaternario olefinico(oc139.49,C-13),un carbonio quaternario portatore di ossigeno （o-72.7, C-19 ）, dieci metileni alifatici e sei carboni metilici. I due atomi di carbonio olefinici a δ-127.23（C{46}}）e 139.49(C{49}}) erano caratteristici del tipo ursano-triterpenoide. Un altro segnale indicava la presenza di glicole etilenico （-OCH-CH-O-） è stato mostrato ai segnali a δ4.62（d, J=11.5 Hz）,4.05（d, J=11. 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）e 4.06（d, J=11.5Hz）e supportato con δ61.27（t）e 63.20（t）. C-2eC-3 in base alla presenza di una correlazione a lungo raggio negli spettri HMBC. Pertanto, il composto 1 è stato identificato come acido 2,3-O-etilenglicole,19-idrossiuri-12-en-23,{85}}dioico (Fig. 3a).

Composto 2: è stato ottenuto come polvere amorfa bianca.MS-ESI m/z 527.33 [MH]t(calcd.For 528.3815). Negli spettri LCMS-ESI, un picco di ioni molecolari è presente a m/z 527,33 [MH]t, indicando la formula molecolare CH Os, che richiedeva 8 gradi di insaturazione. "Lo spettro IR conteneva massimi di assorbimento corrispondenti a idrossile (2.927,8 cm{ {15}}) e gruppi funzionali olefinici (1.686 cm-1). }}Sostituzione O.Estratto di Cistanche Anti RadiazioniAltri spettri caratteristici specifici includevano la presenza di sei singoletti di metile a og1.22 0.76,0.97,0.69,1.30e 1.17(ciascuno,H -24-28,H-30), un doppietto metilico a 0,91 (d,J=7Hz) e il segnale del protone olefinico a ou 5,37 (d, J=7 Hz, H-12). Gli spettri l3(CNMR e DEPT corrispondenti mostrano 33 risonanze di carbonio e gli spettri HSQC e HMQC indicano la presenza di un carbonio carbonilico (oc 182.23, C-28), un carbonio olefinico （δ-129.36, C -12）, un carbonio quaternario olefinico （δ-140.24, C-13）, un carbonio quaternario contenente ossigeno (oc73.68, C-19), undici alifatici metilene e settemetilcarboni. Questi dati indicavano che il composto 2 trasporta uno scheletro ursano-triterpenoide. Gli altri segnali sono indicati dalla presenza del gruppo funzionale 1,3-propandiolo, a og 3.22(d,J=11 .5 Hz),3.42(d,J{45}}.5Hz),1.38(m),1.51(m) e 4.02(d,J=11.5Hz)e 3.36(t, J{ {57}}.5Hz). Il suo gruppo funzionale ha una correlazione a lungo raggio con C2-C3. Sulla base di questi risultati, il composto 2 è stato quindi identificato come 2,3-O-propandiolo,{{ 66}}idrossiuri-12-en{68}}acido oico(Figg.2b e 3b).Un composto simile è 2,{72}}O-isopropilidene tormenta l'acido, isolato da Rubus xanthocarpus.7

Nella Tabella 1, tutti gli spettri 'H e''C NMR sono stati confrontati con l'acido tormentoso (TA/2a,3a,19-triidrossi-12-ursen{5}}acido oico）², che è un triterpenoide ursano che è stato trovato in diverse specie di Rubus-p L'acido tomentico aveva forti somiglianze con i composti 1 e 2, tranne per il fatto che i cambiamenti chimici correlati a C-23 e C31-33 differivano. Questa parte è stata confermata anche in Esperimenti DEPT, HMQC e HMBC (Fig.2).

Il triterpenoide tormenta l'acido è ampiamente distribuito negli alimenti vegetali naturali. Ha varie bioattività: effetti ipoglicemizzanti, proprietà antinfiammatorie e anti-aterogeniche riducono la proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari e attività antiproliferativa nelle linee cellulari di cancro del rene, della prostata e del melanoma2426. Pertanto, poiché questi composti hanno lo stesso scheletro, non hanno possibili attività potenziali appropriate.

La figura 4 rappresenta l'attività inibitoria dell'elastasi e della tirosinasi degli isolati. I dati ottenuti dai saggi di inibizione enzimatica in vitro sono stati espressi come deviazione standard (DS). I composti 1 e 2 hanno inibito l'elastasi con ICso 122,199 e 98,22 ug/mL, e hanno anche inibito la tirosinasi con ICso 207,79 e 221,51 ug/mL, rispettivamente. Alcuni triterpenoidi pentaciclici (acido ursolico e acido oleanolico) hanno riferito di avere attività di inibizione dell'elastasi2728. Anche il valore di inibizione dell'elastasi del composto 2 è inferiore a quello del composto 1. Entrambi i composti avevano un'attività di inibizione inferiore rispetto all'acido oleanolico di controllo positivo, che aveva un valore di ICso di 90,39 ug/mL. In accordo, studi precedenti hanno mostrato un ICso per l'acido oleanolico di 76,5 ug/mL e un valore ICso di 31,0 ug/ml per l'acido ursolico28. Analisi cinetiche precedentemente riportate di triterpeni pentaciclici hanno mostrato che questi composti inibiscono in modo competitivo e reversibile l'elastasi neutrofila. Nello stesso studio, esperimenti di docking molecolare hanno mostrato che la porzione di scaffolding molecolare 28-COOH e i doppi legami nei triterpeni pentaciclici sono essenziali per le loro attività inibitorie

Uno dei problemi che sorgono con l'aumentare dell'età è l'iperpigmentazione.cistanche erbaQuindi, c'è una continua ricerca di agenti schiarenti per la pelle o nuovi depigmentanti. La soppressione della tirosinasi può agire contro la melanogenesi". Come mostrato in Fig.4, l'estratto di metanolo e i composti I e 2 hanno dimostrato attività moderate come inibitori della tirosinasi.

In questa ricerca, l'aggancio molecolare è stato utilizzato anche per analizzare le attività di legame di composti selezionati con tirosinasi ed elastasi come loro bersagli. Le strutture cristalline utilizzate erano 2Y9X, una struttura cristallina della tirosinasi di Agaricus bisporus con tropolone inibitore; e BHGP, una struttura cristallina di elastasi pancreatica suina complessata con un potente inibitore del peptidil FR130180. Entrambi sono stati selezionati perché ottenuti dallo stesso organismo utilizzato per il test in vitro di questa ricerca. Le macromolecole sono anche legate ai rispettivi inibitori in modo da poter ottenere lo stato attivo delle conformazioni enzimatiche. I cocristalli sono stati usati come centro del bersaglio di aggancio molecolare per restringere le probabilità di legame dei composti in modo che il processo di punteggio diventi più efficiente.

Dall'aggancio molecolare, sono state ottenute affinità di legame medie per entrambi i composti, come mostrato nelle Figg.5 e 6. La previsione dell'affinità viene utilizzata per classificare ligandi diversi considerando la posa energetica superiore di ciascun composto, una previsione di una posa energetica migliore è mostrata da punteggi di affinità di legame inferiori16. Il redocking del tropolone inibitore designato è stato effettuato con affinità di legame medie di -7,41 kcal/mol. Le affinità di legame medie dei composti 1 e 2 con la tirosinasi erano rispettivamente di -7,84 kcal/mol e-8,37 kcal/mol (Tabella 2). Si prevedeva che entrambi i composti avessero una migliore affinità rispetto all'inibitore.

Nel frattempo, l'affinità di legame media di elastasieredocking era di -7,84 kcal/mol. Le affinità di legame medie dei composti 1 e 2 con l'elastasi erano rispettivamente di -7,58 kcal/mol e -8,06 kcal/mol. Anche se il risultato ha mostrato che il composto 1 ha affinità inferiori rispetto al cocristallo, è leggermente diverso (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Metodi

Procedure sperimentali generali. Gli spettri 'H e' NMR sono stati registrati a 500 MHz utilizzando uno strumento JEOL JNM-ECZ500R/S1. Gli spettri a infrarossi (IR) sono stati misurati con un FTIR, IRPstige-21, Shimadzu. Altre analisi sono state eseguite utilizzando uno strumento Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, un lettore di micropiastre VersaMax e un lettore di micropiastre BioTek ELX800, fogli di alluminio rivestiti con lore TLC-gel di silice 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Germania) , la cromatografia su colonna (CC) è stata eseguita utilizzando gel di silice 60 (Merck, Darmstadt, Germania) con 70-230 mesh per cromatografia aperta e 230-400 mesh per cromatografia sotto vuoto. Materiali vegetali. Le foglie di R. fraxinifolius sono state raccolte da una piantagione nel monte Pangrango, West Java, all'altezza di 4.343 piedi, nel dicembre 2018. L'esemplare è stato identificato da un botanico (Dott. Joni Setijo) presso il Research Center for Biology, Indonesian Institute of Sciences, Indonesia, con numero di esemplare 033/IPH.1.01/If.07. La raccolta del materiale vegetale aveva ricevuto l'autorizzazione dall'agricoltore ed era conforme ai regolamenti e alle linee guida istituzionali.

Estrazione e isolamento. Le foglie in polvere essiccate all'aria (230{7}} g) sono state estratte utilizzando un apparato Soxhlet con solvente a gradiente (n-esano, EtOAc e MeOH) per fornire i rispettivi estratti, quindi evaporate con un evaporatore rotante e forno sottovuoto. L'estratto di metanolo (291 g) e l'estratto di acetato di etile (65 g) sono stati adsorbiti sul gel di silice ed eseguiti cromatografia liquida sotto vuoto/VLC, eluendo con un gradiente graduale di EtOAc: MeOH (da 1:0 a 0:1) a produrre frazioni per ogni estratto (Eal-Hall e M{10}}Mill and). Frazioni simili che hanno avuto reazioni positive con i reagenti solforici vanillina in TLC sono state combinate. Resa in frazione: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); e M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02 g);M8(166,42 g);M9(10,53 g);M{{38 }}(2,9 g). Tutte le frazioni sono state presentate per l'attività dell'inibitore dell'elastasi, p. M8 ha dato il massimo rendimento e ha avuto una potente attività. Fr. M8 successivamente ulteriormente partizionamento mediante CC su gel di silice (eluente CH2Cl2/MeOH con un gradiente graduale) e purificato utilizzando la colonna Sephadex LH-20 (eluendo con CHCl3-MeOH 100:10, v/v. Due frazioni hanno mostrato natura solida e sono stati cristallizzati con cloroformio e metanolo per ottenere due isolati: composto 1 (18 mg) e:2 (31 mg).La purezza di tutti gli isolati è stata valutata mediante TLC bidimensionale e visualizzando la macchia utilizzando il 5% di solforico acido in metanolo, seguito dal riscaldamento delle piastre a 110 gradi per 5 min.

I cristalli sono stati identificati e caratterizzati mediante cromatografia liquida-spettroscopia di massa (LCMS), LH e 'amplificazione delle distorsioni 3C mediante trasferimento di polarizzazione (DEPT) NMR, coerenza quantistica singola eteronucleare (HSQC), correlazione quantistica multipla eteronucleare (HMQC) e multiplo eteronucleare correlazione di legame (HMBC).

Saggio di inibizione dell'elastasi. Il test di inibizione dell'elastasi è stato eseguito come descritto in precedenza con alcune modifiche32. In breve, in piastre per microtitolazione a pozzetti Nunc-96,20-μL aliquote di 0.8-unità/mL PPE in tampone base di grado Trizma （pH 8.0 ） sono stati miscelati con 20- μL di campioni e le miscele sono state quindi diluite a 180 μL in tampone base di grado Trizma. Gli estratti del test sono stati preincubati con l'enzima per 15 minuti e 20- aliquote di μL del substrato N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (A3PVN; 2,9 mM) sono state aggiunte e incubate per altri 15 minuti. I pozzetti del controllo positivo e del bianco contenevano rispettivamente acido oleanolico e acqua. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato e i tassi di inibizione sono stati determinati in base all'assorbimento; a 401 nm utilizzando un lettore di micropiastre VersaMax. L'inibizione percentuale è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:

dove E è l'assorbanza della reazione enzimatica, Eb è l'assorbanza del bianco enzimatico, T è l'assorbanza del campione di prova e Tb è l'assorbanza del bianco di prova. anche i valori sono stati determinati da un grafico lineare della percentuale di inibizione dell'elastasi rispetto alla concentrazione (50,75,100,125,150 ug/mL). Saggio di inibizione della tirosinasi. L'inibizione della tirosinasi è stata determinata utilizzando il metodo di formazione del cromo DOPA come descritto in precedenza con lievi modifichel3. In breve, in 96-piastre a pozzetti, aliquote di 20 μL di DMSO (controllo) o composti di prova a concentrazioni variabili sono state miscelate con aliquote di 40 μL di tirosinasi di funghi 30 U/mL (Sigma Aldrich) e 100-μL di 0.1-tampone fosfato M (pH 6,8). Sono stati preincubati per 10 minuti a temperatura ambiente. Le reazioni sono state avviate aggiungendo aliquote di 10 mML-DOPA addirg4μL in ciascun pozzetto e incubando a 37 gradi per 20 minuti. L'attività della tirosinasi è stata quindi determinata misurando l'assorbanza a 475 nm. L'acido kojico è stato utilizzato come controllo positivo. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. La percentuale di inibizione della tirosinasi è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:

dove E è l'assorbanza della reazione enzimatica, Eb è l'assorbanza del bianco enzimatico, T è l'assorbanza del campione di prova e Tb è l'assorbanza del bianco di prova. anche i valori sono stati determinati da un grafico lineare della percentuale di inibizione dell'elastasi rispetto alla concentrazione (250,125,62,5,31,25,15,6 ug/mL).

Aggancio molecolare. In questa ricerca, l'attività farmacologica in silico è stata prevista con docking molecolare utilizzando un medico. L'aggancio molecolare mirato è stato effettuato utilizzando un ligando cocristallizzato come centro del sito attivo. La struttura 2Y9X è stata utilizzata per l'aggancio molecolare della tirosinasi con il tropolone, un inibitore della tirosinasi dei funghi, come suo cocristallo. Il centro del sito di ancoraggio molecolare è definito in-10.032;-28.769 e-43.467 rispettivamente come dimensioni X, Y e Z. La catena A è stata separata per l'uso e l'atomo di olmio è stato rimosso dalla struttura utilizzando UCSF Chimera.

In questa ricerca è stata utilizzata anche la struttura di 3HGP, un'elastasi suina. FR130180, poiché il cocristallo è stato utilizzato come centro del sito di aggancio molecolare. Le coordinate erano 12.453, 9.237 e 1.199 rispettivamente per le dimensioni X, Y, Z. L'affinità di legame è stata analizzata dai dieci migliori conformeri di ciascun calcolo di docking molecolare.

Questo articolo è estratto da Scientific Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x