L'estratto di foglie di olivo (OLE) ha alterato il traffico dell'acquaporina-2 indotto dalla vasopressina attraverso l'attivazione del recettore sensibile al calcio

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La vasopressina (AVP) aumenta la permeabilità all'acqua nelrenalecondotto di raccolta attraverso la regolamentazione del traffico di acquaporina-2 (AQP2). Diversi disturbi, tra cui l'ipertensione e la secrezione inappropriata dell'ormone antidiuretico (SIADH), sono associati ad anomalie nell'omeostasi dell'acqua. È stato dimostrato che alcuni fitocomposti sono benefici per la salute umana. Qui, gli effetti dell'estratto di foglie di olivo (OLE) sono stati valutati utilizzando modelli in vitro e in vivo. Studi confocali hanno dimostrato che l'OLE previene la traslocazione di AQP2 indotta dalla vasopressina alla membrana plasmatica nelle cellule MCD4 e nel rattoreni. L'incubazione con OLE diminuisce l'aumento AVP-dipendente del coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (Pf). Per chiarire i possibili effettori di OLE, è stato valutato il calcio intracellulare. L'OLE aumenta il calcio intracellulare attraverso l'attivazione del Calcium Sensing Receptor (CaSR).NPS2143 , un inibitore selettivo del CaSR, ha abolito l'effetto inibitorio di OLE sulla permeabilità all'acqua AVP-dipendente. Esperimenti in vivo hanno rivelato che il trattamento con OLE aumenta l'espressione dell'mRNA di CaSR e diminuisce l'mRNA di AQP2 parallelamente a un aumento del miRNA di targeting dell'AQP2-{5}}. Insieme, questi risultati suggeriscono che l'OLE antagonizza l'azione della vasopressina attraverso la stimolazione del CaSR, indicando che questo estratto può essere utile per attenuare i disturbi caratterizzati da un segnale anormale del CaSR e che influisce sul riassorbimento renale dell'acqua.

Le foglie di olivo sono state ampiamente utilizzate come rimedi tradizionali per curare diverse malattie, soprattutto nei paesi mediterranei. Le foglie sono comunemente consumate nella dieta umana come estratto o polvere per preparare infusi o tisane. L'analisi della caratterizzazione chimica ha rivelato che le foglie dell'olivo contengono numerosi composti bioattivi che possono esercitare effetti benefici in alcune morbilità come la sindrome metabolica, la dislipidemia e l'ipertensione. Numerosi polifenoli come oleuropeina, idrossitirosolo e tirosolo sono stati trovati arricchiti in un estratto di foglie di olivo verde (OLE)5 e sono noti per essere coinvolti nella prevenzione di alcune malattie caratterizzate da stress ossidativo. Pertanto, negli ultimi anni, l'interesse nello studio dei potenziali effetti benefici dell'estratto di foglie di olivo è in aumento tra gli scienziati in diversi campi di ricerca. L'OIE ha mostrato un significativo effetto antiproliferativo nelle cellule del mesotelioma maligno alterando la dinamica del calcio intracellulare, possibilmente mirando a T- tipo Ca2 più canali. È interessante notare che OLE è stato trovato per esercitare effetti antipertensivi sull'ipertensione genetica nei ratti spontaneamente ipertesi (SHR), correlati al miglioramento della funzione vascolare*. L'eccessivo riassorbimento dell'acqua gioca un ruolo importante nella patogenesi dell'aumento della pressione sanguigna. Nei pazienti ipertesi, trattati con estratto di foglie di olivo, è stata riscontrata una significativa riduzione di diversi fattori infiammatori associati ad una diminuzione della pressione sanguigna. Inoltre, l'eccessiva ritenzione idrica caratterizza diversi disturbi come la cirrosi epatica, l'insufficienza cardiaca e la secrezione inappropriata dell'ormone antidiuretico (SIADH). L'omeostasi dell'acqua corporea è strettamente controllata dall'ormone antidiuretico vasopressina (AVP) che viene rilasciato in condizioni di disidratazione. AVP lega il suo recettore V2R affine localizzato alla membrana basolaterale direnalecellule principali attivando così la via del segnale cAMP che provoca la traslocazione delle vescicole portatrici di acquaporina{0}}(AQP2) da un pool intracellulare alla membrana plasmatica apicale dove si verifica il riassorbimento dell'acqua. A livello molecolare, diversi fattori possono modulare l'equilibrio idrico renale. Un livello elevato di calcio luminale ha sottoregolato il traffico di AOP2 dipendente dalla vasopressina a breve termine attraverso l'attivazione del recettore sensibile al calcio (CaSR)1,12. D'altra parte, l'attivazione di CaSR in cellule epiteliali tubulari prossimali renali condizionalmente immortalate, isolate dall'urina umana, ha indotto un aumento significativo del calcio citosolico e ha ridotto significativamente l'aumento di cAMP indotto dalla forskolina (FK), un attivatore diretto dell'adenilato cvclase3 Inoltre , nelle cellule MCD4 del dotto collettore renale, che esprimono stabilmente il canale dell'acqua AOP2, la stimolazione del CaSR ha attenuato l'aumento cAMP-dipendente della fosforilazione di AQP2 alla serina 256 che è un evento fondamentale nella cascata di trasduzione del segnale attivata dalla vasopressina e che alla fine ha aumentato la permeabilità all'acqua4 ,15 Inoltre, nelrenefette dal midollo interno del rene di topo, l'attivazione del CaSR con il calcimimetico NPS-R568 ha causato un aumento significativo del miRNA AQP2-targeting-137, confermando una stretta interazione tra la via del segnale CaSR e AQP{ {4}}permeabilità all'acqua dipendentel.17. Nel presente studio, gli effetti dell'estratto di foglie di olivo, ottenuto dalla cultivar locale Coratina, sono stati valutati sulla funzione AQP2 indotta da vasopressina nelle cellule MCD4 del dotto collettore renale che esprimono stabilmente AOP2 e in dDAVP ratti trattati a cui è stato iniettato l'estratto. Forniamo prove che il trattamento con OLE contrasta la risposta alla vasopressina nelle cellule renali, il che potrebbe in parte spiegare il suo effetto diuretico. È interessante notare che questo effetto sembra essere correlato all'attivazione indotta da OLE del CaSR, un recettore noto per avere un'interazione negativa con il recettore della vasopressina12.

Ulteriori informazioni sugli effetti del cistanche sui reni

Risultati

Effetti di OLE sulla funzione AQP2 indotta da vasopressina nelle cellule MCD4. Per studiare il possibile coinvolgimento di OLE sulla funzione AQP2 vasopressina-dipendente,renaleLe cellule MCD4 del dotto di raccolta, che esprimono stabilmente il recettore 2(V2R) della vasopressina e l'AQP2 umana, sono state utilizzate come modello sperimentale18. Studi confocali (Fig. 1A) hanno rivelato che, rispetto alle cellule trattate con dDAVP, in cui la colorazione AQP2 localizzata sulla membrana plasmatica apicale, il trattamento con OLE ha impedito la localizzazione della membrana di AOP2 indotta dalla stimolazione con dDAVP. Coerentemente con queste osservazioni, il trattamento OLE ha alterato l'aumento indotto da dDAVP della risposta osmotica temporale (indicata come 1/t in Fig.1B)(OLE/dDAVP=88.70±1.{15}} percento, n=292 celle rispetto a dDAVP=206.8±5,49 percento ,n=186 celle;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Effetti di OLE nei reni di ratti iniettati con OLE.

Per studiare ulteriormente le azioni di OLE, sono stati condotti studi in vivo. In particolare, ai ratti è stato iniettato OLE (250 mg/kg/giorno) una volta al giorno per tre giorni. In alternativa, i ratti sono stati co-trattati con OLE, per 3 giorni, e dDAVP, per 30 min. La valutazione dell'mRNA di CaSR che è stato isolato dal dotto collettore renale dei ratti ed elaborato per la PCR in tempo reale (Fig.6) ha rivelato un aumento significativo dell'mRNA di CaSR in OLE(OLE=1.87±0,29, n{{ 10}} ratti vs CTR=1.02±0,17, n=5 ratti; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">rene, sono state eseguite analisi western blotting e studi confocali (Fig.9). Nei ratti iniettati con OLE/dDAVP, la fosforilazione di AQP2 alla serina 256 è stata significativamente ridotta rispetto ai tessuti renali degli animali trattati con dDAVP (OLE/dDAVP=0. 77±0.16, n{7}} ratti vs dDAVP=2.16±0.25,n=5 ratti; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Discussione

Il calcio è un importante messaggero intracellulare che modula una pletora di funzioni cellulari2. Una segnalazione anormale del calcio può portare a diverse malattie tra cui insufficienza cardiaca, cancro e ipertensione23. Il controllo specifico dell'espressione e dell'attività delle proteine ​​che controllano molteplici segnali intracellulari di calcio si è dimostrato efficace nell'affrontare numerosi disturbi ed è quindi interessante per lo sviluppo di farmaci. Questo studio fornisce nuove informazioni sul meccanismo d'azione dell'OLE mostrando la sua capacità di modulare la segnalazione del calcio intracellulare attraverso la stimolazione del CaSR che è coinvolto nella messa a punto del traffico e dell'espressione di AQP2 indotta dalla vasopressina. In condizioni fisiologiche, l'AQP2 svolge un ruolo importante nel controllo dell'omeostasi dell'acqua corporea25. La stimolazione del macchinario intracellulare, che porta alla localizzazione di AQP2 alla membrana plasmatica apicale, provoca ritenzione idrica anormale e conseguente iponatriemia come nella sindrome da secrezione inappropriata dell'ormone antidiuretico (SIADH), cirrosi epatica e insufficienza cardiaca congestizia. In un topo modello di SIADH, associato ad aploinsufficienza della malattia del rene policistico 1, il livello di calcio intracellulare basale era significativamente ridotto rispetto al livello misurato nei dotti collettori dei topi wild-type. Un basso livello di calcio intracellulare ha sottoregolato l'attività di alcuni enzimi tra cui la proteina fosfatasi PP2A con conseguente sovraregolazione della fosforilazione di AOP2 alla serina 2561. Al contrario. l'attivazione del CaSR con il calcimimetico NPS-R568 ha aumentato la concentrazione di calcio intracellulare e ridotto il livello di cAMP nelle cellule carenti di PKD1. È importante sottolineare che il calcio citosolico può sottoregolare l'adenilato ciclasi3 inibibile dal calcio, regolando così il livello intracellulare di cAMP. Nelle cellule MCD4, infatti, la stimolazione del CaSR con NPS-R568 ha ridotto l'AQP2-pS256 attraverso l'inibizione dell'adenilato ciclasi4. In questo studio, il trattamento con OLE ha impedito l'aumento vasopressina-dipendente di cAMP e AOP2-pS256, possibilmente secondario a un aumento della concentrazione di calcio intracellulare. Da notare, l'esposizione a una fonte esterna di cAMP utilizzando il permeabile 8-Br-cAMP, ha contrastato in modo significativo l'effetto inibitorio di OLE sulla via V2R.

Un livello elevato di calcio citosolico può portare alla morte cellulare e all'apoptosi. Tuttavia, un aumento sostenuto del calcio intracellulare da 250 nM a più di 600 nM ha promosso la sopravvivenza neuronale4. Nelle cellule MCD4, il trattamento con OLE a 0,1 mg/ml non viene visualizzato un effetto citotossico. A questa concentrazione, OLE (0,1 mg/ml) ha leggermente aumentato il livello di calcio intracellulare. L'imaging del calcio ha rivelato che la stimolazione acuta con OLE ha causato un aumento transitorio del calcio intracellulare attraverso l'attivazione del CaSR che viene abolito quando le cellule sono state preincubate con l'antagonista selettivo del CaSR NPS2143, Nelle cellule del tubulo prossimale renale, attivazione allosterica del CaSR con I-ornitina ridotto la produzione di ROS sottoregolando così lo stress ossidativo mitocondriale che ha causato l'apoptosi cellulare356. Inoltre, il nostro studio precedente ha mostrato che l'espressione delle varianti di guadagno di funzione del CaSR riduceva il rilascio di ROS e la S-glutationilazione di AQP237. L'incubazione con OLE ha ridotto la generazione di ROS nelle cellule MCD435 mostrando la sua capacità antiossidante. Tuttavia, al momento non è chiaro se l'OLE influenzi l'AOP2-S-glutationilazione. Numerosi studi hanno rivelato che l'OLE o l'oleuropeina, che è il principale costituente dell'OLE, possono avere ruoli protettivi inibendo la morte cellulare,39 Tuttavia, sono stati descritti effetti dose-dipendenti nei ratti trattati con OLE. Risposte benefiche sono state ottenute a dosi di 250 e 500 mg/kg. Al contrario, a concentrazioni più elevate, il trattamento con OLE può avere effetti dannosi probabilmente dovuti all'azione pro-ossidante di diversi fitocomposti. In questo studio, ai ratti è stato iniettato OLE alla dose di 250 mg/kg per tre giorni, mostrando una sovraregolazione del CaSR. Il livello di espressione del CaSR è aumentato da alcuni composti che agiscono come attivatori allosterici del recettore. La calcimimetica, infatti, ha diminuito le calcificazioni vascolari aumentando la biosintesi del CaSR nelle cellule muscolari lisce vascolari umane0. In questo contesto, non si può escludere la possibilità che alcuni composti in OLE possano funzionare come modulatori allosterici del CaSR. D'altra parte, la stimolazione con vasopressina può portare al rilascio di IL-6 che può contribuire ad aumentare il livello di espressione del CaSR42.

Nel rene, la stimolazione della segnalazione di CaSR è associata a una downregulation dell'espressione di AQP2 possibilmente attraverso la generazione di miR-137. I miRNA sono modulatori post-trascrizionali fondamentali. Sono stati descritti anche diversi miRNA dipendenti dalla vasopressina che prendono di mira l'espressione di AQP243. La trasfezione con miR-32 e miR-137 ha ridotto significativamente il livello di espressione di AOP2 nelle cellule mpkCCDc14. È interessante notare che OLE può attenuare i segnali infiammatori ed esercitare effetti protettivi modulando il livello di espressione di diversi miRNA". In particolare, nelle cellule multiforme di glioblastoma, OLE ha promosso l'espressione di diversi miRNA tra cui miR-13745 che è coinvolto nella downregulation di la via di segnalazione Akt/mTOR 46. Da notare, il trattamento con oleuropeina previene la segnalazione di Akt/mTOR attraverso l'attivazione di CAMK e AMPK indotti dal calcio. L'attivazione di CaSR con NPS-R568 attiva AMPK e riduce l'attività di mTOR nelle cellule tubulari prossimali umane3. Coerentemente con questi risultati, l'incubazione con OLE aumenta il calcio citosolico, riduce l'attività della PKA e riduce le dimensioni della cisti in un modello di coltura cellulare 3D48. Insieme, questi risultati suggeriscono che l'OLE può essere utile nel trattamento di disturbi caratterizzati da disregolazione della dinamica del calcio intracellulare correlata alla sottoregolazione della segnalazione di CaSR.

L'estratto di foglie di olivo è costituito da diversi componenti bioattivi, inclusi polifenoli, fibre e minerali49. Al momento, non è chiaro se un composto o una combinazione sinergica di fitocomposti in OLE possa essere utile nella modulazione delle risposte intracellulari. L'estratto utilizzato in questo studio è stato applicato come possibile additivo alimentare ed è quindi importante definire l'impatto fisiologico dell'estratto stesso considerando che diversi fenoli, tra cui l'idrossitirosolo, possono essere filtrati dal rene e recuperati nelle urine50. Ulteriori studi forniranno l'efficacia di componenti specifici che possono regolare attivamente la segnalazione del calcio intracellulare attraverso il CaSR. Per concludere, questo studio fornisce prove che l'OLE può essere considerato un nuovo potenziale adiuvante utile per mitigare i disturbi caratterizzati da una riduzione dell'espressione di CaSR, nonché segnalare e influenzare la permeabilità all'acqua renale.

Materiali e metodi

Sostanze chimiche e anticorpi.Tutti i prodotti chimici e gli antibiotici sono stati acquistati da Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Calceina-AM, Fura-2-AM, terreni di coltura cellulare, siero fetale bovino (FBS) e substrati chemiluminescenti Super Signal West Pico sono stati acquistati da Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Acquaporina{ {2}}(AQP2) è stato rilevato utilizzando anticorpi specifici (C-tail Ab) sollevati contro un peptide sintetico corrispondente agli ultimi 15 amminoacidi C-terminali dell'AQP2 umana!. Gli anticorpi AQP2-pS256 sono stati gentilmente donati dal Prof Peter Deen. Anticorpi secondari di capra anti-coniglio accoppiati alla perossidasi di rafano sono stati ottenuti da Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Germania). Un anticorpo secondario capra-anti-coniglio accoppiato ad Alexa-488 è stato acquistato da Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Produzione di estratti ricchi di fenolici e caratterizzazione chimica.La produzione di un estratto fenolico dalle foglie di olivo è stata effettuata come riportato in Ranieri et al.35. Dopo la macinazione con un frullatore (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA), è stata aggiunta acqua ddH2O (rapporto 1/20, w/y) e quindi sottoposta a ultrasuoni (CEIA, Viciomaggio, Italia) tre volte , per 30 minuti a 35±5 gradi ogni volta. Infine, gli estratti sono stati filtrati su carta da filtro, liofilizzati e conservati a -20 grado C. Gli estratti ottenuti sono stati filtrati con filtri di nylon da 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) e utilizzati per la caratterizzazione chimica. Il contenuto fenolico totale, l'attività antiossidante e l'identificazione dei singoli composti fenolici sono stati eseguiti secondo Difonzo et al.. L'OLE ha mostrato un contenuto di polifenoli, determinato da Folin-Ciocalteu, pari a 195 mg. equivalenti di acido gallico (GAE) e un'attività antiossidante, determinata da ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazoline-6-sale diammonio dell'acido solfonico), che rappresenta 750 μmol TE (equivalenti Trolox) .

Colture cellulari e trattamenti.Come modello sperimentale sono state utilizzate cellule MCD4 del dotto collettore corticale di topo, che esprimono stabilmente AQP2 umano e il chimerico V2R-Rluc18. Le cellule sono state coltivate in una miscela 1:1 di terreno di Eagle modificato con Dalbec-cos e F-12 integrato con il 5% (a/a) di siero bovino fetale. 1 percento (a/a) di L-glutammina e 1 percento di penicillina/streptomicina, 5 μM di desametasone, 40 0 ug/ml di G418 (per la resistenza all'AQP2) e 1 ug/ml di puromicina (per la resistenza a V2R-Rluc) , in un'atmosfera umidificata al 5% di CO, a 37 gradi . Le cellule MCD4 sono state lasciate in condizioni basali (CTR) o trattate a lungo termine con OLE a 0,1 mg/ml O/N, dDAVP a 100 nM per 30 min, o co-trattate con OLE e dDAVP o NPS2143 a l μM O/N In alternativa, le cellule sono state esposte a 8-Br-cAMP a 500 μM per 45 minuti, esperimenti a breve termine sono stati condotti con OLE a 1 mg/ml per 5 minuti e NPS2143 a 10 μM per 15 minuti. Gli esperimenti sono stati eseguiti 3-5 volte indipendenti utilizzando cellule di passaggi diversi.

Modello animale e trattamenti.Tutte le procedure sono state eseguite in accordo con le linee guida nazionali danesi per la cura e la manipolazione degli animali da esperimento e le linee guida pubblicate del National Institutes of Health. I protocolli sono stati approvati dall'Istituto di medicina clinica. Università di Aarhus, secondo le licenze per l'uso di animali da esperimento rilasciate dal Ministero della giustizia danese (Numero di approvazione 2015-15-0201-00658). Gli studi sono stati condotti su ratti Wistar maschi adulti con un peso iniziale di 200-225 g. Gli animali sono stati mantenuti su una dieta standard per roditori (Altromin, Lage, Germania) e hanno avuto libero accesso all'acqua del rubinetto. Durante gli esperimenti, i ratti sono stati alloggiati in gruppi di due per gabbia, con un ciclo luce-buio di 12:12 h, una temperatura di 21±2 gradi C e un'umidità del 55±2%. Cinque ratti sono stati trattati con iniezione sottocutanea di 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danimarca) in 200 ul di soluzione salina/animale e cinque ratti trattati con veicolo sono serviti come controlli. Dopo 30 minuti, i ratti sono stati uccisi e i reni sono stati elaborati come descritto di seguito.

Cellule e lisati IMCD.Le cellule sono state coltivate su piastre di {{0}}}mm e risospese in un tampone contenente 220 mM di mannitolo, 70 mM di saccarosio, {{10}}. 5 M EGTA pH 8.0,0.5 M EDTA pH 8.0,1 M Tris-HCl pH 7.4 in presenza di proteasi (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptina e 2 mg/ml pepstatina A) e fosfatasi (10 mM NaF e 1 mM di ortovanadato di sodio) inibitori. In alternativa, sezioni renali di circa 0,5 mm sono state preparate ed equilibrate per 10 minuti in un tampone contenente 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glucosio, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 e 1,8 mM KH2PO4 (pH7,4). La papilla renale è stata tritata con le forbici nello stesso tampone in presenza di proteasi (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptina e 2 mg/mlpepstatina A) e fosfatasi (10 mM NaF e 1 mM di sodio inibitori dell'ortovanadato). Dopo la sonica-tion (60 kHz per 5 s), i lisati sono stati centrifugati a 12,{52}} × g per 10 minuti. I surnatanti sono stati raccolti e utilizzati per studi di immunoblotting'8.

Microscopia confocale.Gli studi confocali sono stati eseguiti come descritto in precedenza1. In breve, le cellule sono state coltivate su inserti in PET per colture cellulari e trattate come descritto sopra. In alternativa, le sezioni renali ottenute dal controllo, OLE, dDAVP e OLE con ratti trattati con dDAVP sono state sottoposte a esperimenti di immunofluorescenza come descritto in precedenza. Le immagini sono state ottenute con un microscopio a fluorescenza a scansione laser confocale Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Svizzera). Elettroforesi su gel e immunoblotting. Le proteine ​​sono state separate su gel di poliacrilammide al 12% senza macchie (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) in condizioni riducenti come descritto in precedenza=5,52. In breve, le bande proteiche sono state trasferite su membrane Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) e immunoblotting utilizzando anticorpi anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) e anti-AQP2- pS256. I segnali immunoreattivi sono stati ottenuti utilizzando substrati chemiluminescenti Super Signal West Pico con sistema Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Le bande sono state normalizzate in proteine ​​totali utilizzando la tecnologia senza macchie (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). L'analisi della densitometria è stata eseguita utilizzando ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) e analizzata utilizzando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Test di permeabilità all'acqua.La permeabilità all'acqua osmotica è stata misurata come descritto in precedenza43. In breve, le cellule MCD4 sono state coltivate su vetrini coprioggetto di vetro di 40- mm. Dopo i trattamenti, le cellule sono state caricate con 10 μM di Calcein-AM permeabile alla membrana per 45 minuti a 37 gradi, 5% di CO, in DMEM/F-12. I coprioggetto sono stati montati in una camera di perfusione (sistema a camera chiusa FCS2, BIOPTECHS, Butler, USA). Le misurazioni sono state eseguite utilizzando un microscopio TE{11}}S invertito (microscopio Nikon Eclipse, Tokyo, Giappone) attrezzato per misurazioni di fluorescenza a cella singola e analisi di immagini. I campioni caricati con Calcein-AM sono stati eccitati a 490 nm. Misure di fluorescenza, a seguito di soluzioni isosmotiche (140 mM NaCl.5 mM KCl,1 mM MgCl..1 mM CaCl.,10 mM Hepes solfonico, 5 mM Glucosio, pH7.4) o iperosmotiche (soluzione isosmotica addizionata con 135 mM Mannitolo) . sono stati effettuati utilizzando il software Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada). Sono stati registrati i dati di fluorescenza dell'andamento temporale dopo la perfusione delle cellule con soluzioni iso e iperosmotiche. L'andamento temporale del restringimento cellulare è stato misurato come costante di tempo (Ki, espressa come 1/r, sec), parametro correlato alla permeabilità all'acqua, ottenuto adattando i dati con una funzione esponenziale analizzata utilizzando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , CA, USA).

Misure di trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza.Per valutare i cambiamenti intracellulari di cAMP, è stata applicata la tecnologia di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET). Per gli esperimenti FRET, le cellule sono state trasfettate con un plasmide che codifica per il sensore H96 contenente il motivo di consenso vincolante cAMP di EPAC1 incorporato tra la proteina fluorescente ciano (CFP) e cp173Venus-Venus come mostrato in precedenza32.33.54. Il plasmide che codifica per la sonda H96 è stato un regalo di Dr.K. Jalink. La visualizzazione delle cellule che esprimono ECFP e/o EYFP e il rilevamento di FRET sono stati eseguiti utilizzando un microscopio TE2000-S invertito (microscopio Nikon Eclipse, Tokyo, Giappone). Ogni immagine è stata corretta e analizzata come mostrato in precedenza55.

Misurazioni del calcio intracellulare. Le misurazioni del calcio intracellulare sono state eseguite come mostrato in precedenza56. In breve, le cellule MCD4 sono state caricate con 4 μM di Fura-2 AM per 15 minuti a 37 gradi in DMEM/F-12. La soluzione di Ringer è stata utilizzata per perfondere le cellule durante l'esperimento contenente 140 mM NaCl, 5 mM KCl 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM Glucosio, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Nelle misurazioni della fluorescenza, i vetrini coprioggetto con cellule sovraccaricate sono stati montati in una camera di perfusione (sistema a camera chiusa FCS2. BIOPTECHS. Butler, USA). Le misurazioni sono state eseguite utilizzando un microscopio TE{17}}S invertito (microscopio Nikon Eclipse, Tokyo. Giappone). Il rapporto tra le intensità di fluorescenza a 340 e 380 nm è stato tracciato e calcolato come variazione della fluorescenza. In particolare, la stimolazione con OLE（1 mg/ml） o NPS2143 （10 μM） è stata confrontata nello stesso tipo di cellula con quelle ottenute dopo stimolazione con una dose massima dell'agonista calcio-mediato ATP（100 μM） che è stato utilizzato come controllo interno (100 percento).

Il livello di calcio intracellulare è stato misurato allo stato stazionario e calibrato come descritto da Grynkiewicz57. OLE e NPS2143 sono stati utilizzati a lungo termine a 0,1 mg/ml e l uM, rispettivamente, e ciascun campione è stato calibrato mediante l'aggiunta di 5 μM di ionomicina in presenza di 1 mM EGTA（Rm.） seguito da 5 Ionomicina μM in 5 mM CaCl, (RMA).

Analisi PCR in tempo reale dell'mRNA di AQP2 e CaSR in ratti di controllo e trattati.Sono stati eseguiti esperimenti di PCR in tempo reale per misurare l'espressione relativa dell'mRNA nel dotto di raccolta del midollo interno (IMCD) isolato dal controllo e dalle papille renali di ratto trattate. Fette renali di circa 0,5 mm sono state preparate ed equilibrate per 10 minuti in un tampone contenente 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM di glucosio, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2,1,8 mM MgSO4 e 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). La papilla renale è stata isolata allo stereomicroscopio. I campioni di ratti di controllo e trattati sono stati quindi tritati con una forbice direttamente in Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La trascrizione inversa è stata eseguita su 2,5 ug di RNA totale utilizzando SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), secondo le indicazioni del produttore (25°C per 10 min;42°C per 60 min;85°C per 5 min). L'amplificazione PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando TagMan Fast Advanced Master Mix con saggi CaSR, AOP2 e GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) nel sistema StepOne Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ), impostando le condizioni del ciclo termico come specificato dal produttore (95 gradi C per 20 s; 40 cicli in alternativa a 95·C per 1 s e 60 gradi C per 20 s). I risultati sono stati espressi come 2- valori (quantificazione relativa) con △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) trattati-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

valutazione del miRNA-137 nei ratti di controllo e trattati.Il contenuto di miRNA{{0}} nel dotto di raccolta del midollo interno del ratto di controllo e trattato è stato valutato utilizzando TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), che ha consentito la notifica altamente sensibile e specifica di miRNA maturo mediante PCR quantitativa. Fette di rene di circa 0,5 mm sono state preparate ed equilibrate per 10 minuti in un tampone contenente 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM di glucosio, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 e 1,8 mM KH2PO4(pH7.4).La papilla renale è stata isolata allo stereomicroscopio. I campioni di ratti di controllo e trattati sono stati quindi tritati con una forbice direttamente in Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) per estrarre l'RNA totale. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Catalogo n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) è stato utilizzato per ottenere la sintesi di cDNA, secondo il protocollo fornito dal produttore (reazione di coda Poly(A); reazione di ligazione; reazione di trascrizione inversa; reazione miR-Amp). L'RNA sintetico(UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) con 59-fosforo è stato sintetizzato da Thermo Fisher Scientific e utilizzato per eseguire una curva di calibrazione per interpolare i valori dei campioni di miRNA e per ottenere una valutazione precisa (in nanogrammi) del contenuto di miR-137 in campioni16, utilizzando GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Analisi statistica.Tutti i valori sono riportati come medie±SEM L'analisi statistica è stata eseguita mediante ANOVA unidirezionale seguita dal test di confronto multiplo di Newman-Keuls con *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Dichiarazioni, approvazione etica e consenso a partecipare.Gli studi sugli animali sono stati condotti in accordo con le linee guida nazionali danesi per la cura e la manipolazione degli animali da esperimento e le linee guida pubblicate del National Institutes of Health. Il comitato etico per la cura degli animali dell'Istituto di Medicina Clinica dell'Università di Aarhus ha approvato i protocolli di studio, in base alle licenze per l'uso di animali da esperimento rilasciate dal Ministero della Giustizia danese (Numero di approvazione 2015-15-0201-00658). Gli autori confermano che tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Inoltre, gli autori confermano che lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida ARRIVE.

Riferimenti

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10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin e la regolamentazione dell'acquaporina-2. Clin. esp. nefrolo. 17, 751–764.