Foglie di olivo (Olea Europaea L) Estratto di nanoparticelle lipidiche caricate: ottimizzazione dei parametri di elaborazione mediante progettazione statistica Box-Behnken, caratterizzazione in vitro e valutazione dell'attività antiossidante e antimicrobica Parte 2
Jun 10, 2022
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2.5.6 Valutazione della stabilità
La stabilità della formulazione ottimizzata (F9) è stata esaminata secondo le linee guida del Consiglio internazionale per l'armonizzazione (ICH). La dispersione di SLN è stata presa in tre flaconcini di vetro separati (10 ml ciascuno). Tra i tre flaconcini, uno è stato conservato in frigorifero (4 °C±2 °C), il secondo a temperatura ambiente (25±2 °C / 60±5 RH% RH) e l'ultimo è stato conservato in una camera di stabilità (Thermo Scientific, Svezia) a 40±2 ° C / 75 ±5 ° C% RH. In un punto temporale specifico, vale a dire 1,3,6 mesi, i campioni sono stati prelevati ed esaminati per alcuni parametri come la dimensione delle particelle, l'efficienza di intrappolamento, il potenziale zeta e PDI, ecc., Che sono stati determinati e confrontati statisticamente con i dati a tempo zero (iniziale). 2.5.7 Attività antiossidante
Uno dei metodi più utili per la rilevazione del potenziale antiossidante è il metodo dei radicali liberi 2,2-Diphenyl-1-Picryl-Hydrazyl-Hydrate (DPPH)2. L'attività di scavenging dei radicali (cioè l'analisi della loro capacità di scavenging dei radicali liberi DPPH) di OLP-SLN è stata valutata spettrofotometricamente a 517 nm. L'attività antiossidante di OLP, così come OPL-SLN, è stata determinata con l'aiuto del metodo DPPH. La soluzione di DPPH è stata preparata (0,1 mM) in etanolo. Gli OLP-SLN (equivalenti a 0,2 mg / mL di OLP) sono stati dispersi in tampone fosfato e lasciati per 24 ore per rilasciare il farmaco. Nello stesso mezzo è stata preparata anche una concentrazione equivalente di OLP (0,2 mg/mL) e SLN vuote. In questo studio, l'acido ascorbico di concentrazione 0,2 mg / mL è stato assunto come standard e mentre la soluzione DPPH è stata utilizzata come controllo.cistanche Italia3300 μL DPPH è stato miscelato in ogni soluzione di OLP-SLN (500 μL), SLN vuote e soluzione OLP (500 μL). Ogni miscela di reazione è stata conservata in un bagno d'acqua shaker a 37±0,5 ° C per 30 minuti in condizioni protette dalla luce. Infine, l'assorbanza di ciascun campione è stata determinata da uno spettrofotometro UV-visibile (Shimadzu 1800, Giappone) a 517 nm utilizzando l'etanolo utilizzato come bianco. Ogni esperimento è stato valutato tre volte e i valori sono presentati come media±SD. Il valore dell'attività antiossidante sotto forma di % di attività scavenging DPPH è stato determinato dalla seguente formula (equazione 2):
2.5.8 Studio antimicrobico
Lo studio antimicrobico delle SLN caricate con OLP (lotto ottimizzato F9) è stato condotto utilizzando il metodo di diffusione del pozzo di agar. Per la valutazione sono stati utilizzati ceppi batterici come Staphylococcus aureus (Gram positivo) e Pseudomonas aeruginoza (negativo di Gram) ". Le piastre di agar nutriente sono state preparate in condizioni sterili e la sospensione batterica (100 μL, concentrazione intorno a 10 ° CFU / mL) di ciascun batterio è stata posizionata individualmente su ciascuna piastra di agar nutriente sterile con l'aiuto di tamponi sterili incubati a 37±0,5 ° C per 1 ora.benefici cistancheQuattro pozzi di circa 8 mm di diametro ciascuno sono stati prodotti su ogni piastra con l'aiuto di una piralide sterile per sughero. Qui, SLN vuote, controllo positivo (estratto puro), miscela fisica (estratto OLP + bianco) e SLN e preparazione ottimizzata OLP-SLN (100 μL) sono stati utilizzati per lo studio antimicrobico e collocati in ciascun pozzetto. Le piastre sono state incubate ad una temperatura di 37±0,5°C. A tempi predeterminati (6,12,24 h), le piastre sono state ritirate e le zone di inibizione intorno alle pareti sono state misurate in mm con l'aiuto di una pinza.
3 Risultati e discussione
3.1 Screening preliminare e pre-ottimizzazione delle variabili form-latenti
La più alta solubilità di OLP è risultata essere in compri-to 888 ATO come raffigurato in Fig.1. L'ordine decrescente della solubilità OLP/100 gm in diversi lipidi era compritolo 188 ATO(36,93±4,92 mg)>Precirol ATO 5(29,37±3,01 mg)>GMS(23,84±2,73 mg)>acido epilitico(21,41±2,81 mg)>acido stearico(16,25±1,65 mg). Compritol 888 ATO era stato usato come lipide per la preparazione di SLN a base orale per le SLN di preparazione.
Sulla base dei risultati dello studio preliminare di screening, tween 80 e compritol 888 ATO sono stati selezionati rispettivamente come tensioattivo e lipide. Altri parametri come il rapporto farmaco-lipidi (1:3-1:6), la concentrazione di tensioattivi (%,1,5-4,5%) e la velocità di omogeneizzazione (rpm, 3000-6000 rpm), il tempo di omogeneizzazione (2 h), il tempo di sonicazione (10 min) sono stati decisi conducendo gli esperimenti preliminari. Fattori come il rapporto farmaco-lipidico (A), la concentrazione di tensioattivi (B) e l'omogeneizzazione (C) sono stati nuovamente ottimizzati utilizzando la metodologia della superficie di risposta (RSM) in combinazione con 3 fattori e 3 livelli BBD, e la loro influenza è stata rilevata su fattori dipendenti come dimensione delle particelle (Y1), efficienza di intrappolamento (Y2) e PDI (Y3).
3.2 Preparazione di SLN e ottimizzazione di SLNS caricati OLP
I valori dei parametri pre-ottimizzati come descritto
sopra sono stati montati su BBD di progettazione esperta. La composizione del totale di diciassette formulazioni è stata esplorata da BBD con 5 punti centrali. Tutte le formulazioni sono state sviluppate e i valori di parametri dipendenti come la dimensione delle particelle, l'efficienza di intrappolamento e la PDI sono stati esaminati e ulteriormente adattati a BBD per ottenere il risultato finale. Sono state generate equazioni polinomiali e grafici 3D che mostrano l'influenza di fattori indipendenti su fattori dipendenti. Il segno positivo dell'equazione polinomiale esplorava un effetto positivo e il segno negativo indicava un effetto negativo sulle variabili dipendenti. Valore delle variabili dipendenti effettive e previste L'analisi di regressione e l'analisi dei dati di varianza dei modelli sono presentate rispettivamente nelle tabelle 1,2 e 3. Il modello quadratico è stato considerato il modello più adatto per tutte le risposte poiché in questo caso è stato osservato il valore più alto del coefficiente di regressione.
3.3 Effetto di alcuni parametri sulla dimensione delle particelle(Y1)
La seguente equazione polinomiale è stata ottenuta dal BBD che indica l'effetto di diversi fattori indipendenti sulla dimensione delle particelle (Y1):
L'equazione sopra data ha mostrato che il compritolo 888 ATO ha mostrato un effetto positivo sulla dimensione delle particelle mentre l'interpolazione 80 e l'omogeneizzazione hanno mostrato un'influenza negativa sulla dimensione delle particelle.
Qui, le variabili A, B, C, AB, BC e B" hanno avuto un effetto significativo sulla dimensione delle particelle.colesterolo cistancheAd un intervallo di confidenza del 95%, la mancanza di adattamento era insignificante (p>0,05) mentre i parametri rimanenti sono risultati significativi (p<0.0001)with adequate="" precision（="">4)(Tabella 3). Basato su R²
(0,9996)valore, il modello quadratico è stato considerato il modello meglio equipaggiato con un segnale adeguato (Tabella 4).
La dimensione delle particelle di diversi lotti è risultata essere nell'intervallo di 112,35-277,46 nm. Se altre variabili sono state mantenute costanti, la dimensione delle particelle è stata aumentata migliorando il rapporto farmaco/lipidi (Tabella 1, lotto F1 237,05 nm e F2 259,57 nm). Ciò potrebbe essere dovuto all'aggregazione delle particelle a causa del tensioattivo insufficiente per disperdere le particelle. D'altra parte, il tensioattivo (1,5-4,5%) ha mostrato un effetto negativo sulla dimensione delle particelle (Tabella 1, lotto F1 237,05 nm e F3 112,35 nm). Ciò potrebbe essere dovuto a una diminuzione della tensione interfacciale tra la fase acquosa e lipidica che impedisce l'aggregazione delle particelle). La velocità di omogeneizzazione ha mostrato un impatto negativo (Tabella 1, lotto F5 187,46 nm e F7 134,27 nm) sulla dimensione delle particelle a causa della generazione di una forza elevata che rompe le particelle e quindi riduce la dimensione delle particelle. L'equazione 3 ha indicato che l'effetto del tensioattivo (valore del coefficiente-40,87) ha mostrato un effetto più prominente sulla dimensione delle particelle rispetto alla velocità di omogeneizzazione (valore del coefficiente -24,97).cistanche deserticola effetti collateraliLa Figura 2 ha esplorato l'influenza di vari parametri indipendenti sulla dimensione delle particelle.
Cistanche può anti-invecchiamento
3.4 Effetto di alcuni parametri sull'efficienza di intrappolamento(Y2)
La seguente equazione polimerica è stata ottenuta da BBD mostrando l'influenza di diversi parametri indipendenti sull'efficienza di intrappolamento:
Qui, le variabili A, B, C, AB, AC, BC, A e B² hanno un'influenza significativa sull'efficienza di intrappolamento. Ad un intervallo di confidenza del 95%, la mancanza di adattamento era insignificante (p<0.05)while the="" remaining="" parameters="" were="" found="" to="" be=""><0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabella 3). Il modello quadratico (R² = 0,9991) è stato considerato il modello meglio equipaggiato con un segnale adeguato (Tabella 4).
Dall'equazione 4 di cui sopra, si osserva che il lipide (compritolo 888ATO) ha mostrato un effetto positivo mentre i restanti due parametri hanno mostrato un'influenza negativa sull'efficienza dell'intrappolamento. Il tensioattivo (valore del coefficiente -7,23) ha avuto un effetto più prominente rispetto alla velocità di omogeneizzazione (valore del coefficiente -5,76). L'effetto positivo dei lipidi sull'efficienza dell'intrappolamento (Tabella 1, lotto F1 e F2) era dovuto alla disponibilità di più lipidi per l'accomodamento dei farmaci disponibili. È stato osservato un effetto variabile sull'efficienza dell'intrappolamento. Nella fase iniziale, aumentando il tensioattivo, il valore dell'efficienza di intrappolamento è stato aumentato, ma aumentando ulteriormente il tensioattivo, è diminuito a causa della perdita del farmaco nell'ambiente esterno (Tabella 1, lotto F1 e F3). La velocità di omogeneizzazione ha mostrato un effetto negativo sull'efficienza di intrappolamento a causa di una maggiore forza di taglio che potrebbe essere responsabile dell'espulsione del farmaco (Tabella 1, lotto F5 e F7). La Figura 3 ha esplorato l'effetto di vari parametri indipendenti su
3.5 Influenza di parametri indipendenti su PDI(Y3)
Seguente equazione polinomiale che mostra l'influenza di vari parametri sulla PDI:
Qui, variabili come A, B, C, AB, AC, BC, A2 e C ° hanno avuto un effetto significativo sulla PDI. Ad un intervallo di confidenza del 95%, la mancanza di adattamento era insignificante (p>0,05) mentre i parametri rimanenti sono risultati significativi (p<0.0001)with adequate="" precision(="">4)(Tabella 3). Il modello quadratico (R = 0,9991) è stato considerato il modello meglio equipaggiato con un segnale adeguato (Tabella 4).
Dall'equazione 5, si afferma che tutti e tre i parametri indipendenti come un rapporto lipidico del farmaco, tensioattivo e velocità di omogeneizzazione hanno avuto un effetto positivo sulla PDI. L'effetto dominante era dovuto alla velocità di omogeneizzazione (valore di coefficienza 0,048) seguito dal lipide (valore del coefficiente 0,046) e il minimo era il tensioattivo (valore del coefficiente 0,014). A causa dell'omogeneizzazione, l'energia cinetica del sistema è diventata piuttosto elevata che causa la collisione e l'aggregazione di nanoparticelle lipidiche (Tabella 1, Lotto F9 e F11). Un'alta concentrazione di tensioattivo ha prodotto più piccole particelle che formano un ponte con particelle grandi e quindi producono non uniformità che migliora la PDI. L'aumento della concentrazione lipidica a un livello costante di tensioattivi ha causato la coagulazione delle particelle con conseguente distribuzione non uniforme delle dimensioni delle particelle. La Figura 4 ha esplorato l'influenza di varie variabili indipendenti sulla PDI). Sulla base di tre caratteristiche, vale a dire dimensione delle particelle, efficacia di intrappolamento e PDI, il lotto F9 è stato considerato una formulazione ottimizzata con il valore di dimensione delle particelle, efficienza di intrappolamento e PDI 277,46 nm, 80,48% e 0,275 rispettivamente.
3.6 Caratterizzazione degli OLP-SLN
3.6.1 Valutazione della dimensione delle particelle, della PDI e del potenziale zeta
Il valore della dimensione delle particelle, PDI e potenziale zeta del lotto ottimizzato (F9) è risultato essere rispettivamente di 277,46 nm, 0,282 (Fig.5A) e -23,18 mV. Il piccolo valore di PDI(<0.5)indicates the="" uniform="" or="" mono="" distribution="" of="" particles="" without="" any="" aggregation="" in="" the="" developed="" slns="" dispersion.="" a="" similar="" finding="" was="" observed="" by="" yasir="" et="" al.="">cistanche dosaggio redditdurante la produzione di SLN caricate con Buspirone per la consegna naso a cervello. Sia la dimensione delle particelle che la carica superficiale sono importanti nel caso della somministrazione di farmaci con nanoparticelle. Si ritiene che la dimensione delle particelle inferiore a 500 nm sfugga al meccanismo di fagocitosi indotto dai macrofagi. Il potenziale Zeta sotto forma di carica superficiale negativa (circa -20 mV) è auspicabile per la corretta stabilità della nano-formulazione. Il valore osservato del potenziale zeta è stato di -23,18 mV che indica una buona stabilità fisica
di dispersione SLN. Un ruolo importante delle nanoparticelle superficiali negative è la loro attrazione per le proteine caricate positivamente dai tessuti danneggiati e aiutano a regolare il processo di ossidazione". La formulazione ottimizzata sviluppata
(F9)soddisfaceva sia i criteri di dimensione delle particelle che di cariche superficiali.
3.6.2 Studio morfologico
Il lotto ottimizzato di OLP-SLN (F9) sviluppati indica la forma approssimativamente sferica osservata dallo studio TEM (Fig.5B).
3.6.3 Efficienza di intrappolamento (%)
L'efficienza di intrappolamento dei lotti sviluppati di SLN OPL è risultata essere nell'intervallo 50,17-86,46% con l'80,48% della formulazione ottimizzata (F9) che indica una buona capacità di intrappolamento del farmaco delle SLN sviluppate. 3.6.4 Studio a scansione differenziale (DSC) Proprietà come la cristallinità e il comportamento termico delle OLP-SLN sviluppate sono proprietà importanti che ne garantiscono l'applicazione nella somministrazione di farmaci. Il termogramma DSC di OLP (farmaco), lipide (compritolo 888 ATO) e formulazione ottimizzata (F9) è rappresentato in Fig. 6. Lo spettro termico di OPL ha mostrato un picco endotermico breve e ampio a 65,23 ° C, ma è salito a 100,96 ° C. Il compritolo 88ATO ha mostrato un picco endotermico a 70,5 ° C che si ricompone con il suo punto di fusione. Il picco delle caratteristiche di OLP era assente nel termogramma della formulazione ottimizzata (F9). Qui, è stato osservato solo un picco relativamente ampio intorno a 67,81 ° C che significa l'intrappolamento di OLP nella matrice lipidica che porta alla formazione di OLP-SLNs4.
3.6.5 Rilascio di farmaci in vitro
Il rilascio di farmaco dalla formulazione ottimizzata di OLP-SLN (F9) è risultato essere del 95,29±8,13% come mostrato in Fig.7. Il rilascio dalla formulazione ottimizzata ha mostrato un bi-
modello fasico cioè. rilascio veloce iniziale (23.83±4.51 in prima 1 h) a causa del rilascio di farmaco assorbito in superficie e successivamente sostenuto (95.29±8.13% in 24 h) a causa del rilascio di farmaci dalla matrice SLN. La cinetica di rilascio della formulazione ottimizzata per la forma OLP è stata rilevata inserendo i dati di rilascio del farmaco ottenuti nei diversi modelli cinetici rappresentati graficamente in Fig.8. Il valore massimo di R² (0,9984) è risultato essere per il modello cinetico del primo ordine. Pertanto, la cinetica del primo ordine era considerata il modello più adatto. Il meccanismo di rilascio è risultato essere il tipo di diffusione Fickian con il valore di esponente di rilascio(n)0.441.
3.6.6 Valutazione della stabilità
Nelle condizioni di conservazione adeguate, qualsiasi forma di dosaggio sviluppata dovrebbe essere stabile fino alla sua durata di utilizzo (data di scadenza). Qui, la formulazione OLP-SLN ottimizzata sviluppata (F9) è stata memorizzata in determinate condizioni di conservazione secondo le specifiche fornite dalle linee guida ICH. La formulazione conservata a 4±2 °C (frigorifero) e le condizioni ambientali (25±2 °C / 60±5% RH) non erano significative (p<0.05) differ="" from="" the="" initial="" data(zero="" time)in="" respect="" of="" particle="" size,="" pdi,="" surface="" charge(zeta="" potential)="" and="" entrapment="" efficiency.="" a="" significant=""><0.05)in zeta="" potential(-19.27="" mv)and="" entrapment="" efficiency="" (73.29%)and="" a="" significant=""><0.05)in particle="" size(388.37="" nm)was="" observed="" in="" the="" formulation="" stored="" at="" 40±2℃/75±5%="" rh.it="" might="" be="" due="" to="" the="" partial="" loss="" of="" surfactant="" covering(hence="" zeta="" potential="" reduced)which="" leads="" to="" aggregation="" of="" particles(hence="" particle="" size="" increased)and="" leakage="" of="" a="" drug="" in="" the="" external="" environment="" (hence="" entrapment="" efficiency="">
3.6.7 Attività antiossidante
L'azione principale di OLP è quella di prevenire la perossidazione pulendo i radicali liberi e contribuendo alla mitigazione delle lesioni causate dallo stress ossidativo. Come mostrato in Fig. 9, l'OLP libero ha mostrato 48,38±5,28 5% antiossidante che è significativamente (p<0.01)less than="" the="" anti-oxidant="" activity="" (67.93±7.37%)of="" optimized="" formulation(f9).="" this="" could="" be="" due="" to="" the="" nano-size="" of="" the="" lipid="" particles="" which="" offered="" a="" higher="" surface="" area="" for="" the="" chemical="" quenching="" and="" also="" protect="" the="" olp="" in="" the="" external="" environment.="" no="" absorbance="" was="" found="" for="" the="" blank="" slns="" and="" hence="" blank="" slns="" did="" not="" exhibit="" any="" radical="" scavenging="" activity.="" similar="" findings="" were="" reported="" previously".="" the="" value="" of="" anti-oxidation="" activity="" for="" ascorbic="" acid="" was="" supposed="" to="" be="" 69.42±5.38%="" which="" was="" not="" significantly=""><0.05)from the="" optimized="" formulation(f9).="" 3,6.8="" anti-microbial="">
Lo studio ha mostrato il potenziale antimicrobico della formulazione SLN sviluppata di OLP (F9) contro batteri come Staphylococcus aureus (Gram positivo) e Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo) come mostrato in Fig.10 Il risultato ha mostrato che non vi era alcuna zona di inibizione per la formulazione in bianco in quanto era esente dall'estratto OLP.
La zona massima di inibizione per il controllo positivo e la miscela fisica (estratto OLP + SLN vuoti) è stata osservata entro le prime 6 ore. Dopo questa durata(prime 6 ore), non vi è stato alcun cambiamento nella zona di inibizione del controllo positivo e della miscela fisica. Il valore della zona di inibizione per il controllo positivo contro Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus è stato rispettivamente di 7,5±1,25 mm e 8±1,30 mm. Allo stesso modo, il valore della zona di inibizione per la miscela fisica (estratto OLP + SLN vuote) contro Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus è risultato essere rispettivamente di 8,25±1,9 mm e 8,60±2,1 mm. D'altra parte, gli SLN caricati con OLP hanno mostrato l'effetto antimicrobico per un tempo più lungo (fino a 24 ore) rispetto all'OLP libero e alla miscela fisica. Ciò è dovuto al rilascio prolungato di OLP dalla formulazione SLN. L'effetto antimicrobico delle SLN caricate con OLP contro entrambi i gram-positivi
e batteri gram-negativi sono stati osservati fino a 24 ore. L'effetto antimicrobico delle OLP-SLN è stato significativo (p<0.001)more than="" that="" of="" olp="" extract="" and="" physical="" mixture="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus.="" the="" value="" of="" the="" zone="" of="" inhibition="" of="" opl-slns="" against="" pseudomonas="" aeruginosa="" and="" staphylococcus="" aureus="" was="" observed="" at="" 14.75±2.25="" mm="" and="" 16.30±2.1="" mm="" in="" 24="" h="" respectively.="" moreover,="" study="" findings="" indicated="" that="" all="" formulations="" containing="" olp="" extract="" exhibited="" better="" anti-microbial="" efficiency="" towards="" gram-positive="" staphylococcus="" aureus="" as="" compared="" to="" gram-negative="" pseudomonas="" aeruginosa,4".="" to="" the="" best="" of="" our="" knowledge,="" the="" previous="" report="" showed="" that="" the="" major="" constituents="" for="" antimicrobial="" activity="" present="" in="" the="" olive="" extract="" are="" cyclotrisiloxane="" hexamethyl(36.98%),="" cyclo-tetrasiloxane="" octamethyl(15.18%),="" and="" cyclopentasilox-ane="">
4 Conclusione
In questo studio, l'estratto di foglie di olivo in polvere che era meno stabile in condizioni ambientali normali è stato convertito con successo in una formulazione SLN stabile. La formulazione ottimizzata ha mostrato una dimensione promettente delle particelle, un'efficienza di intrappolamento e cariche superficiali. La formulazione ottimizzata ha mostrato un modello di rilascio del farmaco sostenuto fino a 24 ore dopo il primo ordine di rilascio del farmaco cinetico e il tipo di diffusione fickiana del meccanismo di rilascio del farmaco. Lo studio di stabilità è stato condotto e la formulazione ottimizzata (F9) è rimasta stabile nelle condizioni di conservazione dichiarate. La formulazione di OLP ha mostrato una promettente proprietà antiossidante come giustificato dal metodo di analisi DPPH. L'attività antimicrobica contro i batteri positivi di Gram (Staphylococcus aureus) e negativi di Gram (Pseudomonas aeruginosa). Infine, si è concluso che le SLN potrebbero essere i vettori promettenti per la consegna di polvere di estratto di foglie di olivo.
Questo articolo è estratto da J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)
