Foglie di olivo (Olea Europaea L) Estratto di nanoparticelle lipidiche caricate: ottimizzazione dei parametri di elaborazione mediante progettazione statistica Box-Behnken, caratterizzazione in vitro e valutazione dell'attività antiossidante e antimicrobica
Jun 10, 2022
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Astratto:Il presente studio mirava a preparare e valutare nanoparticelle lipidiche solide (SLN) di polvere di estratto di grondaia di oliva (OLP) che contenevano molti agenti antiossidanti e antimicrobici come l'oleuropeina, un polifenolo naturale. Il problema principale riguardante l'OLP era l'instabilità dovuta alle condizioni ambientali e quindi alla bioattività compromessa. Per superare questo problema, le SLN sono state progettate con l'omogeneità a caldo seguita dalla tecnica di sonicazione per proteggere il farmaco e migliorare la sua attività antiossidante e antimicrobica. Lipidi come il compritolo 888ATO e tensioattivi come tween 80 sono stati utilizzati per lo sviluppo e la stabilizzazione di SLNS e l'ottimizzazione è stata effettuata dal design statistico Box-Behnken (3x3). Il lotto ottimizzato (F9) ha mostrato dimensioni delle particelle, efficienza di intrappolamento, PDI e potenziale zeta 277,46 nm, 80,48%, 0,275. e -23,18 mV rispettivamente. La formulazione ottimizzata (F9) ha mostrato un modello di rilascio sostenuto fino a 24 ore con cinetica di rilascio del primo ordine (R² = 0,9984) e il meccanismo di rilascio del farmaco è risultato essere di tipo di diffusione fickiana (n = 0,441). Dopo lo studio di stabilità, si è potuto scoprire che la formulazione delle SLN era stabile. Studi anti-ossidazione e anti-microbici sono stati condotti su una formulazione ottimizzata e i risultati hanno suggerito che gli SLN hanno mostrato una migliore attività di scavenging radicale e attività antimicrobica contro i batteri Gram-positivi (Staphylococcus aureus) e Gram-negativi (Pseudomonas aeruginosa). Infine, si è concluso che le SLN sviluppate erano in grado di proteggere ed essere adatte alla fornitura di OLP.
Parole chiavi:Olea europaea, oleuropeina,nanoparticelle lipidiche solide, estratto di foglie di olivo,attività antiossidante, attività antimicrobica
1 Introduzione
La famiglia Dicotyledons Oleaceae è composta da circa 30 generi di piante decidue tra cui ulivi e ha imparentato circa 600 specie. I membri delle Oleaceae sono ben coltivati in ragioni topiche e sub-temperate dell'Asia?. L'olio di olivo (Olea europaea) ottenuto da diverse parti come frutta, foglie, ecc. Ha molti benefici per la salute al consumo regolare. Tradizionalmente era usato come medicina popolare per rimediare a vari tipi di febbre e altri problemi associati al corpo2).
L'estratto di foglie di olivo ha mostrato diverse attività terapeutiche come anti-ipertensivo, ipoglicemico, antimicrobico, ipouricemico, ecc. L'attività antivirale contro l'infezione da HIV-I è stata dimostrata e riportata. Inoltre, l'oleuropeina (un tipico secoiridoide) ottenuta dalla pianta di olivo ha mostrato attività ipocolesterolemizzante e ipoglicemica con potente attività antiossidante e antinfiammatoria. Prodotto di degradazione dell'oleuropeina, cioè l'idrossitirosolo ha anche mostrato tutte le attività sopra menzionate insieme alla potenziale azione di scavenging dei radicali liberi5.bioflavonoidiL'associazione di tutte queste attività terapeutiche riguardanti la pianta di olivo ne fa un importante contributo nel campo della salute. 4).
In questo progetto, gli autori si occupano delle proprietà antimicrobiche e antiossidanti dell'estratto di foglie di olivo. L'attività antimicrobica dell'estratto di oliva è dovuta all'acido p-idrossibenzoico, ciclotrisilossano esametile, ciclopentasilossano ottametile e ciclopentasilossano desmetile, vanillico, caffeico, protocatechuico, siringico, acido gallico, ecc. Altri ingredienti come oleuropeina, quercetina, tirosolo e acido oleanolico sono anche responsabili dell'attività antimicrobica. Il potenziale antimicrobico di tutte queste sostanze è stato precedentemente segnalato da diversi ricercatori contro batteri, lieviti, funghi, virus, retrovirus e altri parassiti,2).
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L'assunzione dietetica di fonti antiossidanti naturali come frutta e foglie ha guadagnato molta attenzione e mostra un effetto positivo sulla salute degli esseri umani. I risultati di molti studi epidemiologici hanno esplorato che l'assunzione di alimenti ricchi di polifenoli riduce l'incidenza della malattia coronarica (CHD). I CHD come MI (infarto miocardico), IS (ictus ischemico), ecc. sono associati all'aterosclerosi". Recenti studi hanno esplorato che il danno ossidativo è un importante fattore eziologico per il progresso dell'aterosclerosi, In particolare, secondo la teoria dello stress ossidativo, si ritiene che la modificazione ossidativa della lipoproteina a bassa densità (LDL) svolga un ruolo chiave nello sviluppo dell'aterosclerosi. Pertanto, l'inibizione di tale processo è considerata un importante approccio terapeutico. Vari costituenti importanti come Oleuropeina (idrossitirosolo, tirosolo), verbascoside (noto anche come ac-toeside o Kalinin), ligstroside, apigenina-7-glucoside, di-cosmetic-7-glucoside, luteolina, catechina, ecc sono stati ottenuti per le foglie di oliva e che esibiscono attività antiossidante come riportato in precedenza. L'idrossitirosolo è la principale oleuropeina a foglia di olivo che ha proprietà antiossidanti pervie).
Oltre a questa attività, l'estratto di foglie di olivo ha mostrato altre attività farmacologiche come antinfiammatorio",12),anti-cancro8.14), antivirale5),ipoglicemicl4), ipolipidemico17, anti-aggregazione piastrinica. Agenzie come l'EFSA (Agenzia europea per la sicurezza alimentare) e l'EMA (Agenzia europea per i medicinali) hanno fornito la loro valutazione dell'applicabilità terapeutica degli estrattori di foglie di olivo. Insieme alla maggiore applicabilità, i prodotti di estrazione delle foglie di olivo sono affetti da problemi di instabilità in condizioni atmosferiche (temperatura, luce e ossigeno) e condizioni biologiche e quindi hanno mostrato scarsa bioattività20,21).comprare cistanchePer migliorare la stabilità, sono state sviluppate varie formulazioni a base nano per esplorare le varie attività dell'estratto di foglie di olivo. Queste formulazioni includono nano-emulsione (W/O e più tipi)2), complessi di inclusione, prodotti spray secchi?4), estrusione elettrostatica25, complessi bipolari), nano-liposomi20, nano-emulsione, micro-incapsulamento, nanoparticelle PLA2 e NLCs0.Vari problemi sono associati a queste formulazioni come basso valore di resa, procedura dispendiosa in termini di tempo, efficienza di intrappolamento compromessa, contaminazione residua da solvente e alta dimensione delle particelle. Quindi, per regolare questi svantaggi, sono nate nanoparticelle lipidiche. Le nanoparticelle lipidiche es-specialmente le nanoparticelle lipidiche solide (SLN) offrono molti vantaggi come una migliore efficienza di intrappolamento, dimensione controllata delle particelle, biocompatibilità, biodegradabilità e facilità di preparazione. Inoltre, i lipidi utilizzati per la preparazione delle SLN hanno una certa azione sinergica sull'attività antinfiammatoria insieme al farmaco intrappolato. Ad oggi, non è stata sviluppata alcuna formulazione basata su nanoparticelle lipidiche solide (SLN) per esplorare le sue proprietà antimicrobiche e antiossidanti e per migliorare la stabilità del prodotto estratto di foglie di olivo.
Pertanto, il lavoro di ricerca è stato finalizzato allo sviluppo di nanoparticelle lipidiche solide (SLN) per foglie di olivo (Olea europaea L.) estratto in polvere (OLP). I principi attivi sono stati separati dall'estrazione delle foglie di olivo utilizzando etanolo. Il solvente è stato rimosso mediante essiccazione per ottenere il prodotto in polvere secca. Il potere di estrazione delle foglie di olivo (OLP) è stato incorporato in SLN (OLP-SLN) e l'ottimizzazione è stata effettuata da un software di progettazione esperto (Modello 8.0.7.1) utilizzando il design Box-Behnken. Tre fattori come un farmaco (OLP) al rapporto lipidico, la concentrazione di tensioattivi (%, Tween 80) e la velocità di omogeneizzazione (rpm) sono stati presi come parametri indipendenti e fattori come la dimensione delle particelle, l'efficienza di intrappolamento e l'indice di polidispersità (PDI) sono stati selezionati come parametri de-pendenti. La formulazione ottimizzata è stata valutata per lo studio morfologico, lo studio DSC, lo studio di rilascio in vitro e lo studio di stabilità. Infine, sono state valutate le attività antimicrobiche e antiossidanti per verificare il potenziale antimicrobico e antiossidante della formulazione SLN sviluppata.
2 Materiali e metodi
Le foglie di ulivo sono state ottenute dall'orto locale. Le foglie fresche venivano essiccate e polverizzate per l'estrazione. Vari lipidi come il prezioso ATO5, il compritolo 888 ATO sono stati acquistati da Gattefosse (Germania). Glyceryl monostearate (GMS), acido palmitico, acido stearico tween 80, ecc sono stati acquistati da central drug house ltd (New Delhi, India).2, 2-Diphenyl-1-Picryl hydroxyl-hydrate free radicals (DPPH) sono stati acquistati da Merck (Darmstadt, Germania). Acido ascorbico, potassio diidrogeno fosfato, acetato di ammonio, metanolo, idrossido di sodio, poloxamer 188, etanolo, agar nutriente e sacchetto per dialisi (M.Wt tagliato 12.000 kD) sono stati acquistati da Sigma Aldrich (St Louis, USA). Tutte le altre sostanze chimiche utilizzate per lo studio sono di grado analitico.
2.1 Estrazione di componenti fenolici
Le foglie fresche di oliva venivano essiccate e polverizzate per l'ex-trazione. I principi attivi sono stati estratti dalla potenza con l'aiuto di solvente (etanolo: acqua, 4:1 v/v). Una quantità sufficiente di polvere (250 mg) è stata prelevata nel pallone di estrazione e il solvente è stato aggiunto (1000 ml) etanolo: acqua, 4: 1 v/) e la miscela è stata continuamente agitata per la durata di 24 ore. Dopo questa fase, la miscela fisica è stata filtrata e il solvente è stato evaporato a secco a 40 ° C per ottenere la polvere).
2.2 Preparazione e ottimizzazione delle SLN: Preliminary
studio di screening e pre-ottimizzazione delle variabili di formulazione Per la selezione di lipidi, tensioattivi, velocità e tempo di omogeneizzazione adatti, tempo di sonicazione, ecc., Sono stati condotti studi preliminari. La selezione del lipide adatto dipende dalla solubilità del farmaco nei lipidi e la selezione del tensioattivo dipende dalla solubilità del lipide nel tensioattivo.
Il lipide in questione (100 mg) è stato fuso al di sopra dei suoi punti di fusione (circa 10°C sopra) nel flaconcino seguito dall'incorporazione del farmaco (OLP) con agitazione continua. L'aspetto del colore chiaro pallido indica il punto finale. Esperimenti simili sono stati eseguiti per la selezione di tensioattivi adatti.
2.3 Progettazione sperimentale
Nel presente studio, BBD di software di progettazione esperto con tre fattori e tre livelli è stato applicato a fini di ottimizzazione. Nello studio, tre fattori come un rapporto farmaco-lipidi (A, 1: 3-1: 6), la concentrazione di tensioattivi (B, %, 1,5-4,5%) e la velocità di omogeneizzazione (C, rpm, 3000-6000 rpm, per due h) sono stati presi come parametri indipendenti e la dimensione del par-title (nm, Y1), l'efficienza di intrappolamento (%, Y2) e PDI (Y3) sono stati presi come parametri dipendenti. Lo scopo dell'applicazione di questo progetto era quello di ottimizzare i suddetti tre parametri indipendenti e di ottenere la dimensione ottimale delle particelle, la massima efficienza di intrappolamento e il minor PDI possibile. I dati sono stati inseriti nel software di progettazione esperto per BBD15). Sono stati generati un totale di 17 lotti con 5 lotti aventi una composizione simile (cinque punti centrali) (Tabella 1). L'equazione polinomiale del secondo ordine è stata utilizzata per dimostrare l'influenza di vari parametri indipendenti sulla dimensione delle particelle, sull'efficienza di intrappolamento e sulla PDI.
2.4 Sviluppo di SLN
Gli SLN caricati con OLP sono stati preparati mediante omogeneizzazione a caldo seguita dal metodo di sonicazione. La composizione dei diversi lotti SLN caricati con OLP è riportata nella Tabella 1. Prima di tutto, il lipide (compritolo 888 ATO) è stato fuso intorno ai 10 ° C del suo punto di fusione ed è stata aggiunta la quantità desiderata di OLP (rapporto farmaco-lipidi 1: 3-1: 6). Nel frattempo, la quantità richiesta (1,5-4,5%) di tensioattivo è stata disciolta in acqua deionizzata e la temperatura di questa fase è stata mantenuta uguale a quella della fase lipidica. La fase acquosa è stata poi incorporata gradualmente nella fase lipidica e sottoposta ad omogeneizzazione a caldo ad un anello a velocità variabile (rpm, 3000-6000 rpm, due h) per ottenere la dispersione degli SLN del corso. L'emulsione ottenuta è stata autorizzata a
raffreddare e poi sonicato per 10 minuti a 100% di ampiezza con l'aiuto di un sonicatore (tipo di sonda, Vibra-Cell'VCX 130; Sonics, CT, USA)per ottenere la dispersione finale delle SLN. La dispersione è stata raccolta in una fiala di vetro e conservata in frigorifero per ulteriori studi. Allo stesso modo, gli SLN vuoti sono stati sviluppati senza API (farmaco).
2.5 Caratterizzazione degli OLP-SLN
2.5.1 Valutazione della dimensione delle particelle, della PDI e del potenziale zeta
La spettroscopia di correlazione fotonica (PCS) utilizzando una macchina zeta sizer (Malvern, nano ZS 90, Malvern Instruments, UK) è stata utilizzata per la misurazione della dimensione media delle particelle e dell'indice di polidispersità (PDI) di vari lotti. La temperatura è stata mantenuta a 25°C e l'angolo di dispersione è stato fissato a 90°.cistanchL'acqua deionizzata è stata utilizzata per la diluizione della dispersione originale OLP-SLN. Il potenziale Zeta che indica la carica superficiale è stato determinato con l'aiuto dello stesso strumento con un'intensità di campo elettrico di circa 20 V/cm27
2.5.2 Studio morfologico
Un microscopio elettronico a trasmissione (TEM, ottica elettronica Fei, Giappone) che utilizza carbonio rivestito con griglia di rame è stato utilizzato per esaminare la morfologia e la forma delle SLN caricate OLP preparate (lotto F9 ottimizzato). La colorazione negativa con colorazione di acido fosfotungstico (2% p/p, durata 20-30 secondi) è stata eseguita per colorare il campione OLP-SLN seguita da essiccazione a temperatura ambiente. Infine, il campione è stato rilevato da TEM.
2.5.3 Valutazione dell'efficienza di intrappolamento
L'efficienza di intrappolamento (EE) è stata determinata esaminando la quantità non intrappolata di farmaco presente nella dispersione OLP-SLN. A questo scopo è stata utilizzata la tecnica di centrifugazione. Una quantità misurata (10 ml) di OLP-SLN è stata prelevata in un tubo di centrifuga e lasciata sedimentare con l'aiuto di una centrifuga di raffreddamento (Remi, India) a 12000 giri / min per 15 minuti. La presenza di un farmaco non intrappolato è stata analizzata da uno spettrofotometro UV-visibile (Modello 1800, Shimadzu . Giappone)a 230 nm. La percentuale di intrappolamento del farmaco è stata determinata dalla seguente formula (equazione 1):
2.5.4 Studio della calorimetria differenziale a scansione (DSC)
Lo scopo di questo studio era quello di valutare il comportamento termico di varie formulazioni: OLP puro, compritolo 888 ATO e formulazione OLP-SLN ottimizzata (F9) utilizzando la calorimetria differenziale a scansione (Mettler, Toledo, USA). Ogni campione è stato confezionato in una padella di alluminio e scansionato nell'intervallo di temperatura di 20-350 ° C (velocità 10 ° C / min) utilizzando una padella sigillata vuota come riferimento in un'atmosfera inerte (azoto). Le curve DSC sono state ottenute e interpretate. 2.5.5 Studio sul rilascio di farmaci (%)
Lo studio sul rilascio del farmaco del lotto ottimizzato (F9) è stato fatto dalla cellula di diffusione di Franz utilizzando la membrana di dialisi. Prima dell'applicazione della membrana di dialisi, è stato sviluppato trattando la soluzione di solfito di sodio allo 0,35% p/v a 80°C per 1-2 min seguita da acidificazione con HSO (0,2%, v/v) e quindi conservata per 12 ore in acqua distillata. Il tampone fosfato salino (pH 7,4) è stato riempito nel compartimento del recettore e la dispersione SLN (F9,1 mL) è stata prelevata nel compartimento del donatore. L'esperimento è stato eseguito a 37±0,5 °C con agitazione continua (50 giri/min). Le aliquote (1 mL) sono state prelevate dal compartimento del recettore a intervalli di tempo predeterminati e la quantità di farmaco presente in ciascun campione è stata rilevata dallo spettrofotometro UV-visibile a 230 nm. La cinetica di rilascio adatta da SLN ottimizzate è stata rilevata adattando i dati di rilascio a zero, in primo luogo, il modello di Higuchi e il modello di Korsmeyer-Peppas come indicato nella Tabella 2, e il valore di R (Coefficiente di correlazione) è stato determinato. Il modello con il più alto valore R è stato considerato un modello ottimizzato8).
Questo articolo è estratto da J. Oleo Sci. 70, (10) 1403-1416 (2021)
