L'osteoporosi è un grave problema di salute pubblica per la popolazione mondiale sempre più invecchiata

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Astratto:L'osteoporosi è un problema di salute pubblica significativo in tutto il mondo, con l'osteoporosi post-menopausale dovuta alla carenza di estrogeni che si traduce in circa 3/4 dei casi. In questo studio, 18 pecore Merino invecchiate sono state ovariectomizzate e 10 erano controlli. Tre delle pecore ovariectomizzate sono state trattate settimanalmente con 400 mg di metilprednisolone per 5 mesi e tre sono state trattate settimanalmente per 2 mesi, seguiti da un periodo di recupero di 3-mesi. A 2 mesi, cinque animali di controllo e sei animali ovariectomizzati sono stati sottoposti a eutanasia. A 5 mesi, tutte le pecore rimanenti sono state soppresse. I campioni renali sono stati raccolti post mortem per l'analisi qPCR di NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA e NCX1. Le pecore ovariectomizzate avevano un'espressione VDR significativamente maggiore rispetto ad altri gruppi. Le pecore ovariectomizzate trattate con glucocorticoidi per 2 mesi seguiti da eutanasia a 5 mesi hanno mostrato differenze significative nell'espressione genica di TRPV5, CYP24A1 e klotho rispetto ad altri gruppi. Le differenze nell'espressione di klotho erano più marcate dopo l'aggiustamento per misure ripetute (p=0.1). Il Klotho è conosciuto come l'ormone "anti-invecchiamento" ed è coinvolto nel metabolismo del calcio e del fosforo. Klotho può essere coinvolto nel recupero della densità minerale ossea in pecore ovariectomizzate trattate con glucocorticoidi per 2 mesi seguiti da eutanasia a 5 mesi. Si raccomandano ulteriori ricerche sul ruolo del klotho.

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Parole chiave:osteoporosi; pecora; vitamina D; fosfatazione; qPCR; metabolismo del calcio; metabolismo del fosforo; Cloto

1. Introduzione

L'osteoporosi è un grave problema di salute pubblica per la popolazione mondiale sempre più anziana, costando agli Stati Uniti d'America quasi 17 miliardi di dollari nel 205 e si prevede che crescerà fino a 25 miliardi di dollari nel 2025 [1,2]. Circa il 70-75 percento del carico di osteoporosi è dovuto all'osteoporosi post-menopausale nelle donne [1], osteoporosi primaria per cui la carenza di estrogeni provoca una ridotta formazione ossea e un aumento del riassorbimento osseo, con conseguente diminuzione della massa ossea e fragilità ossea [3] . L'osteoporosi può verificarsi anche secondariamente a cause specifiche, come il trattamento con glucocorticoidi. La pecora è un modello animale di grandi dimensioni ben consolidato per diverse malattie scheletriche umane, inclusa l'osteoporosi[4]. Uno dei vantaggi di un modello animale di grandi dimensioni, come la pecora, è la capacità di testare impianti ortopedici, tecniche chirurgiche e biomateriali [4]Inoltre, la pecora è relativamente a basso costo, facile da maneggiare e fornisce abbondante materiale per i test [4,5].

I modelli ovini più comuni di osteoporosi sono la pecora ovariectomizzata a 12 mesi dall'intervento e la pecora ovariectomizzata a 6-mese con dieta carente di calcio e vitamina D con glucocorticoidi[4]. Utilizzando una combinazione di noti fattori che inducono l'osteoporosi tra cui ovariectomia, trattamento con glucocorticoidi e una dieta a basso contenuto di calcio, siamo stati in grado di stabilire un modello di osteoporosi ovino in soli 5 mesi [6,7], diminuendo così l'alloggio, il lavoro, e costi di alimentazione coinvolti nello sviluppo del modello. In questo modello, è stato riscontrato che l'ovariectomia aumenta le concentrazioni sieriche dei telopeptidi C-terminali del collagene di tipo I (CTX-I, un marker di riassorbimento osseo) e dell'osteocalcina (marker del turnover osseo) rispetto alle pecore di controllo. Le pecore che hanno ricevuto un trattamento con glucocorticoidi per 2 mesi avevano concentrazioni sieriche di CTX-I più elevate e concentrazioni sieriche di osteocalcina più basse. Inoltre, la densità ossea della colonna vertebrale femorale e lombare e la densità minerale ossea volumetrica totale e trabecolare della tibia prossimale erano inferiori nei gruppi trattati sperimentalmente rispetto ai gruppi di controllo, in particolare per le pecore ovariectomizzate trattate con glucocorticoidi [6]. È stato anche riscontrato che il metabolismo degli aminoacidi e dei lipidi è alterato nelle pecore ovariectomizzate e trattate con glucocorticoidi [7].cistanche wirkungCambiamenti simili sono stati riscontrati anche in altri modelli di osteoporosi ovina [8].

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I geni responsivi alla vitamina D e il sistema di fosfatazione non sono stati precedentemente esplorati in modelli di pecore ovariectomizzate. La vitamina D, di cui 1,25-diidrossivitamina D è la forma attiva, porta in definitiva ad un aumento delle concentrazioni plasmatiche di calcio e fosforo ionizzato legandosi all'eterodimero del recettore del retinoide X del recettore della vitamina D (VDR) e alterando le espressioni di numerose vitamine Geni D-reattivi, come proteine ​​​​leganti il ​​calcio (calbindina D9 e 28k (CalD9k, CalD28k)) e canali del calcio (sottofamiglia del canale cationico del potenziale recettore transitorio V membro 5 e 6 (TRPV5, TRPV6), calcio ATPasi di membrana plasmatica (PMCA) , scambiatore sodio-calcio 1(NCX1)[9].La produzione di 1,{18}}diidrossivitamina D è una fase strettamente regolata, per cui la loidrossilasi renale (CYP27B1) catalizza la conversione di 25-idrossivitamina D a 1,{23}}diidrossivitamina D e l'enzima 24-idrossilasi (CYP24A1) scompone sia 25-idrossivitamina D che 1,25-diidrossivitamina D in sottoprodotti inattivi.cistanche Regno UnitoIl sistema di fosfatazione controlla anche le concentrazioni plasmatiche di fosforo e calcio[10]. Il fulcro di questo sistema è il fattore di crescita dei fibroblasti 23, che è prodotto dagli osteociti nell'osso e controlla principalmente le concentrazioni plasmatiche di fosforo legandosi al cofattore klotho per diminuire l'espressione dei co-trasportatori sodio-fosfato (NPT1, NPT2a, NPT2c) [11]. A causa degli effetti correlati dell'ormone paratiroideo e della 1,25-diidrossivitamina D, determinare gli effetti dell'FGF23 sul metabolismo del calcio è stato difficile, ma ci sono prove che suggeriscono che possa regolare l'assorbimento intestinale di calcio e renale riassorbimento del calcio[12,13].

I glucocorticoidi hanno numerosi effetti sul metabolismo del calcio e del fosforo, tra cui l'inibizione dell'assorbimento intestinale del calcio, il ridotto riassorbimento del calcio tubulare renale e il ridotto riassorbimento renale del fosforo [14-16]. Inoltre, poche ricerche hanno esaminato l'effetto della carenza di estrogeni sui geni che rispondono alla vitamina D e sul sistema di fosfatazione [17,18].

Questa dieta ovariectomizzata a basso contenuto di calcio, modello di osteoporosi ovina trattata con glucocorticoidi, ha fornito l'opportunità di produrre informazioni preliminari sugli effetti di questi trattamenti sull'espressione dei geni reattivi alla fosfatazione e alla vitamina D nel rene ovino. Gli obiettivi di questo studio erano duplici: (1) determinare se l'ovariectomia o l'ovariectomia e il trattamento con glucocorticoidi alterassero l'espressione della vitamina D e dei geni correlati alla fosfatazione nel rene; (2) determinare le relazioni tra la vitamina D renale e i geni correlati alla fosfatazione, marcatori sierici di vitamina D e turnover osseo (CTX-I e osteocalcina).

2. Materiali e metodi

In precedenza sono stati pubblicati metodi dettagliati per lo sviluppo del modello di osteoporosi ovariectomizzato e trattato con glucocorticoidi [6]. In breve, pecore Merino invecchiate (7-9 anni, n=28) sono state assegnate casualmente in gruppi: control(n=10)ovariectomizzate (OVX) (n=12), ovariectomizzate e trattamento con glucocorticoidi (40 mg di metilprednisolone per iniezione sottocutanea) mensilmente per 2 mesi seguiti da nessun trattamento per 3 mesi (n=3) e trattamento con glucocorticoidi (400 mg di metilprednisolone) mensilmente per 5 mesi (n=3) .bioflavonoidi degli agrumiLe pecore sono state ospitate in una stalla e alimentate con una dieta concentrata di pellet di pecora di controllo (115 g/kg di calcio; 2,2 g/pecore al giorno) o a basso contenuto di calcio (5 g/kg di calcio; 1 g/pecora al giorno) [19]. I requisiti di mantenimento per una pecora non gravida sono di 1,2 g/pecora al giorno[19].

I campioni di sangue sono stati raccolti tramite venipuntura giugulare 2 mesi e 5 mesi dopo l'intervento chirurgico. L'osteocalcina è stata misurata utilizzando il kit immunoenzimatico Micro Vue Osteocalcin e il CTX-I utilizzando il kit IDS Serum CrossLaps ELISA, come riportato in precedenza [6] Le concentrazioni sieriche di calcio e fosforo totali sono state misurate mediante spettrofotometria su un analizzatore di chimica clinica AU680 (Beckman Coulter, Brea , CA, USA). La concentrazione sierica di 25-idrossivitamina D è stata misurata mediante cromatogramma liquido a diluizione isotopica; spettrometria di massa Raphy presso l'Endolab, Canterbury Health Laboratories, Christchurch, Nuova Zelanda.

A mesi, 5 pecore del gruppo di controllo e 6 del gruppo OVX sono state soppresse e sottoposte a necroscopia. A 5 mesi, anche le pecore rimanenti sono state soppresse (gruppo di controllo n =5, gruppo OVX n=6, OVX più glucocorticoidi 2 m n=3 e OVX più glucocorticoidi 5 m n=5 ) e necrostata. I campioni renali sono stati raccolti entro 30 minuti dalla morte e divisi in due, con un campione posto in formalina tamponata neutra al 10% ed elaborato per l'istologia, e l'altro congelato in azoto liquido e conservato a-80 gradi fino al trattamento di ematossilina e sezioni di rene colorate con eosina sono state esaminate dall'autore principale e hanno confermato l'assenza di lesioni significative.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di etica animale della Massey University (approvazione numero 14/103) ed eseguite secondo il Codice di condotta etica per l'uso di animali vivi per la ricerca presso la Massey University, Palmerston North, Nuova Zelanda.

L'estrazione dell'RNA e la qPCR sono state eseguite come descritto in precedenza [20,21]. In breve, Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, Germania) è stato utilizzato per estrarre l'RNA secondo le istruzioni del produttore. Il DNA genomico è stato rimosso con Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) secondo le istruzioni del produttore. La concentrazione di RNA è stata determinata utilizzando un fluorimetro Qubit 2.{36}} e un kit di test Qubit RNA ad ampio raggio (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) e la qualità dell'RNA è stata valutata determinando il rapporto 260/280 e correndo su gel di agarosio. Il kit di sintesi del cDNA del primo filamento di Trascrittore (Roche) è stato utilizzato per sintetizzare il cDNA. Ogni miscela di reazione da 20 μL conteneva 600 ng di RNA, 2,5 μM di oligo (dT), tampone di reazione RT 8 mM, dNTP 1 mM, trascrittasi inversa 10 U, inibitore della RNasi 20 U e acqua priva di RNasi. La reazione è stata eseguita a 55 gradi per 30 minuti, 85 gradi per 5 minuti e quindi raffreddata a 4 gradi utilizzando un Ciclatore termico Veriti di Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). La qPCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando la macchina per PCR in tempo reale StepOne Plus (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). Ciascuna miscela PCR conteneva 5 µl di master mix Power SYBR Green PCR (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), primer diretti e inversi alle concentrazioni elencate nella Tabella S1,10 ng di cDNA e quindi portata a 10 µl con RNasi, acqua priva di DNasi. Il protocollo PCR consisteva in 95 gradi per 20 s, 40 cicli a 95 gradi per e 60 gradi per e, infine, una curva di fusione che andava da 60 gradi a 95 gradi con una velocità di riscaldamento di 0,3 gradi/15 s. L'acqua e la miscela di reazione senza trascrittasi inversa sono state incluse come controlli negativi in ​​ogni corsa di PCR e tutti i campioni sono stati analizzati in duplicato. Sono stati valutati i seguenti geni: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA e NCX1. È stato precedentemente riscontrato che PKG1 e SDHA sono espressi stabilmente nel rene ovino [20] e i campioni sono stati normalizzati rispetto all'espressione di questi geni e all'efficienza del gene utilizzando il metodo 2-AACt [22].

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando R Studio 1.3.1093[23] con la versione R

4.0.3 e il tidyverse, nlme 3.1-150 e Gary

2.1.2 pacchetti. I modelli lineari sono stati applicati ai dati di espressione della piega genica trasformati log10. Nel primo modello, l'espressione genica era la variabile di esito, mentre il gruppo (controllo o OVX ma escluse le pecore trattate con glucocorticoidi) e il tempo (eutanasia a 2 mo 5 m) erano variabili dipendenti, con un termine di interazione (gruppo: tempo) incluso. Nel secondo modello, l'espressione genica era la variabile di esito, mentre il gruppo (controllo, OVX, OVX con trattamento con glucocorticoidi per 2 m e OVX con trattamento con glucocorticoidi per 5 m) era la variabile dipendente.benefici del cynomoriumPoiché più variabili di esito (geni) venivano testate per le differenze tra i gruppi, i valori p sono stati aggiustati per test multipli utilizzando la procedura sequenziale di Holm [24]. Le concentrazioni sieriche di calcio, fosforo e 25-idrossivitamina D sono state testate nei modelli di espressione genica, ma non erano significative e, data la mancanza di differenze significative tra i gruppi, sono state rimosse. Inoltre, l'analisi delle componenti principali è stata utilizzata per valutare se i dati sull'espressione della piega genica trasformata in log10 differissero per gruppo, tempo di eutanasia o concentrazione sierica di 25-idrossivitamina D. La correlazione a coppie e i grafici a dispersione di Spearman sono stati utilizzati per studiare la correlazione tra i dati di espressione della piega genica trasformata log10 e gli analiti sierici.

3. Risultati

3.1. Effetto dell'ovariectomia, tempo trascorso dall'ovariectomia e trattamento con glucocorticoidi sulle concentrazioni sieriche di calcio, fosforo e 25-idrossivitamina D

I risultati completi per le concentrazioni sieriche di calcio, fosforo e 25-idrossivitamina D in ciascun gruppo sono presentati nella Figura 1. "Non sono state rilevate differenze significative nelle concentrazioni sieriche di calcio, fosforo e 25-idrossivitamina D tra i gruppo ovariectomizzato con dieta a basso contenuto di calcio e gruppo non ovariectomizzato con dieta adeguata di calcio e tempo trascorso dall'ovariectomia di 2 mesi e 5 mesi.Questi risultati suggeriscono che l'ovariectomia combinata con una dieta a basso contenuto di calcio non ha avuto alcun impatto sulle concentrazioni sieriche di calcio. e trattati con glucocorticoidi per mesi, seguiti da eutanasia a 5 mesi, avevano concentrazioni sieriche di calcio significativamente più basse (p =0.0462, adj R20.13) rispetto a 5 m ovariectomizzati con una dieta a basso contenuto di calcio e 5 m ovariectomizzati su una dieta a basso contenuto di calcio e pecore trattate con glucocorticoidi. Tuttavia, l'esame dei dati suggerisce che ciò potrebbe essere dovuto a un animale che era ipocalcemico (1,52 mmol/l, intervallo di riferimento 2.0-2.7 mmol/l); rimozione di questo animale ha rimosso qualsiasi significato.giacinto del desertoTutte le altre pecore avevano concentrazioni sieriche di calcio all'interno dell'intervallo di riferimento. Non sono state osservate differenze nelle concentrazioni sieriche di fosforo o 25-idrossivitamina D in pecore ovariectomizzate di 5 m e trattate con glucocorticoidi.

3.2. Effetto dell'ovariectomia e tempo trascorso dall'ovariectomia sulla vitamina D e sull'espressione genica correlata alla fosfatonina nel rene

L'espressione genica della vitamina D e dei geni correlati alla fosfatazione non era associata all'ovariectomia o al tempo trascorso dall'ovariectomia (Figura 2). L'eccezione era il recettore della vitamina D (VDR), per cui il gruppo OVX aveva un'espressione VDR significativamente maggiore (p=0.05, adj R2 0.16); tuttavia, questo significato è scomparso dopo l'adeguamento per misure ripetute.

3.3. Effetto dell'ovariectomia e del trattamento con glucocorticoidi sulla vitamina D e sull'espressione genica correlata alla fosfatonina nel RENE 5 mesi dopo l'intervento

I risultati completi sono presentati nella Figura 3. L'espressione di PTH1R era significativamente maggiore nelle pecore OVX trattate con glucocorticoidi per 5 mesi rispetto agli altri gruppi (p=0.04, adj R40.18), mentre TRPV5 (p{ L'espressione {8}}.01, adj R20.31) e CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) era significativamente maggiore nelle pecore OVX trattate con glucocorticoidi per 2 mesi rispetto agli altri gruppi.

L'espressione di klotho era significativamente diversa tra tutti i gruppi (p =0.01, adj R20.48), con l'espressione più bassa nelle pecore di controllo. Le pecore OVX trattate con glucocorticoidi per 2 mesi avevano l'espressione più alta (p =0.002), seguite dalle pecore OVX (p=0.008) e poi dalle pecore OVX trattate con glucocorticoidi per 5 mesi (p{ {10}}.03). Tuttavia, quando aggiustata per misure ripetute, l'espressione genica non era significativamente diversa tra questi gruppi, con klotho che mostrava la maggiore differenza nelle pecore OVX trattate con glucocorticoidi per 5 mesi (p=0.1).

Allo stesso modo, l'espressione del VDR era significativamente diversa tra tutti i gruppi (p=0.03, adj R20.38). La massima espressione del VDR è stata nelle pecore OVX trattate con glucocorticoidi per mesi (p=0.009), seguite dalle pecore OVX (p=0.01), quindi nelle pecore OVX trattate con glucocorticoidi per 5 mesi (p=0.05) e l'espressione più bassa era presente nelle pecore di controllo.

3.4.PCA dell'espressione genica complessiva tra i gruppi

L'analisi PCA di OVX, controllo ed eutanasia a 2 e 5 mesi non è riuscita a separare i diversi gruppi (Figura S1). PCL e PC2 hanno spiegato il 69,6% della variazione. Allo stesso modo, anche l'analisi PCA dei gruppi sottoposti a eutanasia a 5 mesi non è riuscita a separare i diversi gruppi. PCL e PC2 hanno spiegato il 53,2% della variazione (Figura S2). L'analisi PCA ha mostrato che l'espressione genica complessiva non poteva essere spiegata dalle concentrazioni sieriche di calcio e fosforo di 25-idrossivitamina D (Figura S3).

3.5. Correlazione a coppie tra tutti gli analiti e l'espressione genica

Indipendentemente dallo stato dell'ovariectomia, dal contenuto di calcio della dieta, dal tempo trascorso dall'ovariectomia (2 o 5 m) o dallo stato del trattamento con glucocorticoidi, l'espressione del gene NPT1 era significativamente e positivamente correlata (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Discussione

I risultati di questo studio suggeriscono che il trattamento delle pecore ovariectomizzate con glucocorticoidi ha avuto il maggiore impatto sull'espressione genica, mentre la stessa ovariectomia e il tempo trascorso dall'ovariectomia (2 e 5 mesi) hanno avuto un impatto minimo sull'espressione genica. In un'analisi univariata, differenze significative nell'espressione del gene TRPV5, CYP24A1 e klotho sono state osservate nelle pecore ovariectomizzate trattate con glucocorticoidi per 2 mesi seguite da eutanasia a 5 mesi e nel PTH1R nelle pecore ovariectomizzate trattate con glucocorticoidi per 5 mesi. Le differenze erano più marcate nell'espressione di klotho dopo l'aggiustamento per misure ripetute.

La tomografia computerizzata periferica quantitativa della tibia prossimale di queste pecore ha mostrato che l'ovariectomia ha ridotto la densità minerale ossea volumetrica totale (vBMD) dell'8%, l'ovariectomia con trattamento con glucocorticoidi per 5 mesi del 27% e l'ovariectomia con glucocorticoidi per 2 mesi ed eutanasia a 5 mesi del 13 per cento [6]. È interessante notare che la BMD trabecolare, l'area trabecolare e il contenuto minerale osseo trabecolare erano simili o maggiori rispetto ai controlli nelle pecore ovariectomizzate trattate con glucocorticoidi per 2 mesi ed eutanasia a 5 mesi, suggerendo il recupero della massa ossea [6]. I glucocorticoidi hanno diversi effetti ben documentati sull'osso che portano allo sviluppo dell'osteoporosi indotta da glucocorticoidi. Questi effetti includono l'inibizione della formazione delle cellule progenitrici degli osteoblasti e degli osteoblasti, l'aumento dell'apoptosi degli osteoblasti e la diminuzione della produzione di osteoidi, tutti fattori che riducono la formazione ossea [25,26]. Allo stesso tempo, i glucocorticoidi aumentano il riassorbimento osseo diminuendo l'espressione di OPG, aumentando l'espressione di RANKL, aumentando la formazione di osteoclasti, diminuendo l'apoptosi degli osteoclasti e aumentando la secrezione di catepsine e metalloproteinasi della matrice da parte degli osteoclasti [25,26].

Klotho è un componente integrale del sistema di fosfatazione, per cui si lega al fattore di crescita dei fibroblasti 23 (FGF23) nel rene. Il complesso klotho-FGF23 si lega quindi al recettore FGFR1IIC, che avvia diverse vie cellulari e, in definitiva, provoca la sovraregolazione dell'espressione della {5}}idrossilasi (CYP24A1) renale e la sottoregolazione della la-idrossilasi renale (CYP27B1) e del tubolare renale Cotrasportatori Na/P II (NPT2a e 2c) [10]. L'aumentata espressione (differenze in cui erano più marcate dopo aggiustamento per misure ripetute) di klotho negli ovini trattati con glucocorticoidi per 2 mesi e poi sottoposti a eutanasia a 5 mesi può spiegare l'aumentata espressione del CYP241 osservata anche in questo gruppo di ovini, nonostante nessuna differenza significativa concentrazioni sieriche di 25OHD.

Il klotho è noto come la proteina anti-invecchiamento e i topi carenti di klotho hanno una bassa formazione ossea e riassorbimento osseo, portando a un'osteopenia a basso turnover osseo [27,28]. Inoltre, specifici polimorfismi del gene klotho sono associati a una ridotta densità minerale ossea nell'uomo [29,30]. Il klotho solubile sovraregola la proteina 1 della risposta alla crescita precoce (EGR-1) e induce l'espressione di marcatori di differenziazione ossea nella coltura cellulare degli osteoblasti [31]Inoltre i glucocorticoidi possono sopprimere il fattore di crescita dei fibroblasti 232]. Forse, le maggiori espressioni di klotho nelle pecore in trattamento con glucocorticoidi per 2 mesi e poi sottoposte a eutanasia a 5 mesi riflettono il processo di recupero per questo trattamento post-glucocorticoide di questa pecora e, dato il suo ruolo nella formazione e nel riassorbimento delle ossa, presumibilmente un fattore chiave del recupero osseo e, quindi, potenzialmente un bersaglio per il trattamento dell'osteoporosi nell'uomo.

Tuttavia, le pecore OVX avevano anche un aumento delle espressioni di klotho rispetto alle pecore di controllo. Allo stesso modo, uno studio su topi carenti di aromatasi ha mostrato che la carenza di estrogeni aumentava i livelli di proteina di klotho e il trattamento con estradiolo riduceva le espressioni di klotho in questi topi[17]. Nei topi, gli estrogeni sottoregolano l'NPT2a in un processo indipendente da klotho/FGF23 e PTH[18]. Tuttavia, questo effetto non è stato osservato nelle pecore ovariectomizzate in questo studio. Altrimenti, c'è poca letteratura sull'effetto della carenza di estrogeni sul klotho. Ulteriori ricerche dovrebbero esaminare gli effetti sia dell'ovariectomia che dei glucocorticoidi sull'espressione del klotho, dato il suo ruolo nell'invecchiamento e nella malattia renale cronica.

TRPV5 è un canale del calcio epiteliale espresso principalmente nei tubuli contorti distali e nei tubuli di collegamento del rene [20,33]. Il canale TRPV5 è costitutivamente aperto ma subisce un'inattivazione calcio-dipendente in associazione con la calmodulina, una proteina sensibile al calcio [34]. L'espressione di TRPV5 può essere aumentata di PTH e 1,25(OH)D3 [35]. Una pecora che era in terapia con glucocorticoidi per 2 mesi e poi soppressa a 5 mesi era ipocalcemica e le concentrazioni sieriche di calcio erano significativamente inferiori nelle pecore di questo gruppo rispetto agli altri gruppi. È probabile, quindi, che l'aumentata espressione di TRPV5 sia il risultato della diminuzione della concentrazione sierica di calcio in questi animali. È stato dimostrato che i glucocorticoidi riducono l'assorbimento intestinale di calcio diminuendo l'espressione di TRPV6 e CalD9k [36,37] e aumentando l'escrezione urinaria di calcio [14], ma l'ipocalcemia clinicamente significativa negli individui sani è rara. Allo stesso modo, le pecore con una bassa concentrazione di calcio sierico non mostravano segni clinici di tetania ipocalcemica. In alternativa, l'aumentata espressione di TRPV5 nelle pecore in trattamento con glucocorticoidi per 2 mesi e quindi eutanasia a 5 mesi potrebbe riflettere il processo di recupero, per cui per sostituire la BMD trabecolare recuperata, l'area e il contenuto minerale osseo, è necessario un maggiore riassorbimento del calcio dal rene.

Nelle pecore trattate con glucocorticoidi per 5 mesi, l'espressione di PTH1R era aumentata rispetto agli altri gruppi. Inoltre, rispetto ad altri gruppi, c'era poca variazione nell'espressione tra le pecore nel gruppo. Sebbene non siano state osservate differenze nelle concentrazioni sieriche di calcio negli ovini trattati con glucocorticoidi per 5 mesi, forse ciò potrebbe essere associato all'aumento dell'azione del PTH e del suo recettore. Gli effetti dei glucocorticoidi sulla secrezione e l'azione del PTH non sono chiari. Alcuni studi sull'uomo hanno scoperto che i pazienti trattati con glucocorticoidi hanno un aumento delle concentrazioni sieriche di PTH, insieme a un ridotto assorbimento di calcio, un aumento dell'escrezione urinaria di calcio e una diminuzione della massa ossea [38,39]. Tuttavia, la maggior parte degli studi non ha riscontrato cambiamenti nelle concentrazioni sieriche di PTH nell'uomo durante il trattamento con glucocorticoidi [38,40,41]. Uno studio ha dimostrato che forse l'impatto dei glucocorticoidi è sull'alterazione della secrezione di PTH, con l'aumento della secrezione pulsatile di PTH negli individui trattati con glucocorticoidi[4]. Altri hanno anche mostrato una maggiore espressione di PTH1R nelle cellule staminali mesenchimali e nelle cellule simili agli osteoblasti in risposta al trattamento con desametasone[43,44]. Pertanto, l'aumento dell'espressione renale di PTH1R nelle pecore trattate con glucocorticoidi per 5 mesi è probabilmente dovuto ai 5 mesi di trattamento con glucocorticoidi.

Sebbene l'ovariectomia combinata con una dieta leggermente povera di calcio abbia comportato modifiche minime all'espressione genica, sembrava alterare l'espressione del VDR, con pecore ovariectomizzate con una dieta leggermente povera di calcio con una maggiore espressione di VDR rispetto alle pecore di controllo. Ciò è in contrasto con uno studio su ratti ovariectomizzati in cui quelli alimentati con una dieta con livelli di calcio normali hanno mostrato una maggiore espressione renale di VDR, mentre quelli alimentati con una dieta a basso contenuto di calcio avevano una ridotta espressione di VDR [45]. In questo studio sulle pecore è difficile separare l'effetto dell'ovariectomia sull'espressione renale del VDR dall'effetto della dieta a basso contenuto di calcio. Tuttavia, non ci sono state differenze significative nelle concentrazioni sieriche di calcio tra i gruppi (con l'eccezione del gruppo glucocorticoidi) suggerendo che la dieta leggermente povera di calcio ha avuto un effetto minimo e forse gli effetti sul VDR sono dovuti all'ovariectomia. Tuttavia, saranno necessarie ulteriori ricerche per indagare su queste relazioni.

Due studi precedenti hanno esaminato le relazioni separate tra geni responsivi alla vitamina D e geni correlati alla fosfatazione nei reni di pecora [20,21]. Tuttavia, non sono state esaminate le relazioni tra la vitamina D e le vie di fosfatazione. È interessante notare che le correlazioni più significative tra i geni riportati in questi due articoli valgono anche per le relazioni geniche in questo presente studio sulle pecore, suggerendo la coerenza nei risultati tra gli studi e le relazioni tra questi geni.estratto di salsa di cistancheTra le relazioni interessanti non riportate in precedenza, come ci si potrebbe aspettare dato il suo ruolo fondamentale nel metabolismo del calcio, l'espressione di PTH1R era altamente correlata con CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho e NPT2c. L'espressione di klotho era fortemente correlata con l'espressione genica di TRPV5, il che è coerente con altra letteratura che mostra che il klotho sovraregola il TRPV5 e promuove il riassorbimento renale del calcio [46,47].

Sfortunatamente, non è stato possibile separare i diversi gruppi in base all'espressione genica reattiva alla vitamina D e alla fosfatazione utilizzando l'analisi PCA. Ciò è probabilmente dovuto al limite principale di questo studio: la piccola dimensione del campione. Con solo 3-6 animali in ciascuno dei gruppi, ciò ha probabilmente limitato la capacità di rilevare le differenze nell'espressione genica tra i gruppi.

5. Conclusioni

I risultati di questo studio mostrano che le differenze più marcate nell'espressione genica erano nell'espressione del klotho renale nelle pecore ovariectomizzate trattate con glucocorticoidi per 2 mesi seguiti da un periodo di recupero di 5 mesi. Dato che il klotho è l'ormone "anti-invecchiamento" e ha un ruolo critico nel metabolismo del calcio e del fosfato, è possibile che questo ormone sia coinvolto in modo critico nel recupero della densità minerale ossea trabecolare e dell'area nelle pecore trattate e possa, quindi, potenzialmente essere un obiettivo di trattamento per l'osteoporosi nell'uomo. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche sugli effetti dei glucocorticoidi e dell'ovariectomia sul klotho.

Questo articolo è tratto da Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals