Astratto:È noto che l'esposizione della pelle umana al 4-(4-idrossifenil)-2-butanone (chetone di lampone, RK) causa leucoderma chimico/professionale. RK è un derivato carbonilico del 4-(4-idrossifenil)-2-butanolo (rododendro), un agente sbiancante per la pelle che è stato scoperto causare leucoderma nella pelle di molti consumatori. Questi due composti fenolici sono ossidati dalla tirosinasi e i prodotti risultanti sembrano causare citotossicità ai melanociti producendo specie reattive dell'ossigeno e impoverendo i tioli cellulari attraverso i prodotti di ossidazione dell'o-chinone. Pertanto, è importante comprendere il meccanismo biochimico della trasformazione ossidativa di questi composti. Studi precedenti indicano che RK viene inizialmente ossidato a RK chinone dalla tirosinasi e successivamente convertito in un catecolo desaturato a catena laterale chiamato 3,4- diidrossibenzalacetone (DBL catecolo). Nel presente studio, riportiamo la chimica di ossidazione del catecolo DBL. Utilizzando studi spettroscopici UV-visibili e spettrometria di massa cromatografia liquida, abbiamo esaminato la reazione del catecolo DBL con tirosinasi e periodato di sodio. I nostri risultati indicano che il chinone DBL formato nella reazione è estremamente reattivo e subisce reazioni di dimerizzazione e trimerizzazione facili per produrre più prodotti isomerici mediante nuove reazioni di condensazione di tipo Diels-Alder ionico. La produzione di un'ampia varietà di prodotti chinonoidi complessi da tali reazioni sarebbe potenzialmente più tossica per le cellule causando non solo stress ossidativo ma anche mielotossicità attraverso l'esibizione di reazioni con macromolecole cellulari e tioli.

Secondo studi pertinenti, la cistanche è un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale è il cistanoside, che ha vari effetti come la promozione della funzione antiossidante, antinfiammatoria e immunitaria. Il meccanismo tra cistanche e sbiancamento della pelle risiede nell'effetto antiossidante dei glicosidi cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata dalla tirosinasi e la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, inibendo così la produzione di melanina.

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Parole chiave:tossicità del rododendro; chetone lampone; 3,4-diidrossibenzalacetone; catecolo DBL; addizione ionica di Diels-Alder; mielotossicità; leucodermia; composti schiarenti per la pelle

1. Introduzione

Il chetone del lampone (4-(4-idrossifenil)-2-butanone, RK), è un composto fenolico ampiamente utilizzato come cosmetico, profumo e agente aromatizzante alimentare [1]. Alcuni dei lavoratori impegnati nel processo di produzione di questo composto in Giappone hanno sviluppato il leucoderma professionale [2]. In questo contesto è importante porre particolare attenzione al rododendro, 4-(4-idrossifenil)-2-butanolo, il derivato di RK con il suo gruppo carbonilico ridotto ad alcool secondario. Il rododendro è stato anche ampiamente utilizzato nell'industria cosmetica come prodotto sbiancante per la pelle. L'applicazione ripetuta di rododendro come agente schiarente del colore della pelle ha provocato lo sviluppo di leucoderma su viso, collo e mani [3]. Questi due composti possono essere interconvertibili nella cellula mediante reazioni di ossidoriduzione. Pertanto, la loro tossicità può essere causata dallo stesso tipo di reazioni.

L'ossidazione catalizzata dalla tirosinasi di RK ha prodotto il suo corrispondente chinone che ha mostrato una rapida isomerizzazione tramite il suo chinone metide a (E)-4-(3,4-diidrossifenil)-3-buten-2-uno, comunemente noto come 3,4-diidrossibenzalacetone (catecolo DBL) [11]. Tale introduzione non enzimatica del doppio legame nella catena laterale mediante la formazione intermedia di chinone e chinone metide è una reazione ben documentata per alcuni derivati ​​delle catecolamine[12-15]. Studi preliminari hanno indicato che il risultante catecolo DBL è molto reattivo e che i prodotti chinonoidi formati da questo composto potrebbero reagire rapidamente con i composti tiolici cellulari [11]. Inoltre, è stata dedotta la possibile oligomerizzazione del prodotto chinonoide, ma non è stata esaminata a causa dell'estrema reattività degli intermedi. Negli ultimi anni, uno dei nostri laboratori ha utilizzato con successo studi spettrali di massa per studiare gli intricati dettagli delle trasformazioni ossidative di diversi derivati ​​della deidrodopa e deidrodopamina [12-20]. Le nostre esplorazioni hanno prodotto preziose informazioni sul corso della trasformazione ossidativa di diversi derivati ​​delle catecolamine. Pertanto, abbiamo deciso di indagare il corso di reazione utilizzato dal catecolo DBL anche utilizzando questa tecnica e riportare in questo articolo le nuove trasformazioni ossidative esibite dal chinone DBL.

2. Risultati e discussione

La figura 2A mostra i cambiamenti spettrali UV-visibili che accompagnano l'ossidazione del catecolo DBL da parte della tirosinasi dei funghi. Non appena viene aggiunta la tirosinasi, si verificano rapidi cambiamenti negli spettri di assorbanza. Il picco UV dovuto al catecolo DBL a circa 320 nm si è progressivamente ridotto e l'assorbanza nella regione visibile a circa 420 nm è aumentata costantemente. I cambiamenti spettrali che accompagnano questa trasformazione hanno mostrato due punti isosbestici a circa 285 nm e 385 nm, indicando la trasformazione diretta del catecolo DBL nel composto che mostra assorbanza a circa 420 nm. Questo composto, che ha un colore giallo, deve essere il corrispondente chinone poiché è noto che la tirosinasi mostra un'ampia specificità di substrato e ossida molti composti o-difenolici nei loro corrispondenti o-chinoni [15]. Quando la reazione è stata eseguita in condizioni leggermente alcaline (a pH 8), il colore della miscela di reazione è diventato più chiaro con il progredire della reazione (Figura 2B). Alla fine, si è formato un composto che presentava un'ampia assorbanza a circa 330 nm. Si potrebbe anche assistere a un leggero spostamento nelle scansioni spettrali tra il substrato e il prodotto finale, suggerendo che parte della coniugazione nel substrato si perde nel prodotto. Questi risultati hanno indicato che il chinone DBL generato dalla tirosinasi sta subendo un'ulteriore trasformazione.

Per visualizzare il destino del chinone DBL, abbiamo generato questo chinone ossidando quantitativamente il catecolo DBL con periodato di sodio e monitorando i cambiamenti spettrali di assorbanza UV e visibile. Gli studi iniziali condotti a pH 6 o 7 hanno rivelato che l'ossidazione è estremamente rapida e ha portato alla formazione di un prodotto finale che ha mostrato un massimo di assorbanza a circa 265 nm con un'ampia assorbanza nella regione visibile tra 380 e 440 nm (Figura 3A)

Poiché la reazione è avvenuta troppo velocemente, il monitoraggio dei cambiamenti spettrali è diventato molto difficile. Quindi, abbiamo deciso di rallentare la reazione conducendola a valori di pH acidi. Per rallentare la reazione e monitorare la formazione di chinone, abbiamo condotto gli studi in 0.2 M di acido acetico. La Figura 3B mostra la rapida generazione di chinone DBL dal catecolo DBL mediante l'ossidazione del periodato di sodio in acido acetico. L'ossidazione è stata completata in meno di un minuto e il chinone formato potrebbe essere visualizzato dalla sua assorbanza nella regione visibile. Tuttavia, il chinone si è rivelato molto instabile e ha mostrato una rapida conversione in prodotti che presentano assorbanza ultravioletta nell'intervallo 280-480 nm, come mostrato nella Figura 4.

Due prodotti, uno con eluizione a 18 min e un altro con eluizione a 21 min, hanno mostrato una massa di m/z 355,1171 (Figura 5B), che è entro 3 ppm della massa teorica per il prodotto di addizione del chinone DBL al catecolo DBL (C20H18O6) . Lo spettro CID del dimero che eluisce a 18 min (Figura 6) differisce significativamente da quello che eluisce a 21 min (Figura 7). Il dimero eluendo a 18 min mostrava i principali ioni prodotto a valori m/z di 337 (perdita di acqua), 313 (perdita di gruppo acetile) e 295 (perdita di acqua e gruppo acetile). La perdita di entrambi i gruppi acqua e acetile è possibile solo per il dimero di tipo benzodiossano mostrato nel riquadro. Si noti che questo picco ionico m/z 295 non è il picco prominente nello spettro CID del picco di 21 min. Questa osservazione unita alla produzione osservata a 189 (perdita di un gruppo cattolico e gruppo CH2=CO-CH3) suggerisce che il picco di 21 min è dovuto a un dimero diverso la cui struttura proposta è mostrata nel riquadro della Figura 7 .

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