Lo stress ossidativo, il metabolismo energetico disfunzionale e i neurotrasmettitori destabilizzanti hanno alterato il profilo metabolico cerebrale in un modello di ratto di immersione simulata della saturazione dell'eliox a 4.0 MPa Ⅱ

Procedura di estrazione del tessuto

La procedura di estrazione dei metaboliti polari dai campioni di tessuto è stata una modifica minore come riportato [18]. Campioni di tessuto congelato prepesati sono stati scongelati su ghiaccio e quindi sottoposti a omogeneizzazione meccanica in un sistema di solventi metanolo-cloroformio-acqua di grado HPLC ghiacciato (400 μL, 400 μL e 285 μL, rispettivamente, per 100 mg di tessuto cerebrale) utilizzando un omogeneizzatore tissutale (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Francia). Gli omogenati risultanti sono stati mantenuti in ghiaccio per un periodo di 30 min e poi centrifugati a 12,000 xg per un periodo di 10 min a 4˚C. Il supernatante di ciascun campione è stato quindi rimosso e liofilizzato per ottenere una polvere contenente metaboliti polari in un liofilizzatore (FD-1A-80, BIOCOOL, Cina). Ogni campione di polvere è stato successivamente ricostituito con 550 μL di tampone PBS avente lo 0,1% di TSP, e tutti i campioni sono stati poi miscelati accuratamente e centrifugati a 12,000 xg per un periodo di 20 minuti a 4˚C. Un'aliquota di 500 μL di supernatante è stata quindi trasferita in un tubo NMR di 5,0 mm di diametro (Norrel, Regno Unito). Il principio di estrazione delle proteine ​​nel campione di corteccia era come precedentemente descritto senza modifiche. La quantità esatta di campioni di corteccia è stata versata in un tampone di omogeneizzazione (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1% di Triton X-100, aprotinina, pepstatina A e leupeptina 10 ug/ml ciascuna) e omogeneizzate manualmente in un bagno di ghiaccio. La miscela è stata centrifugata a 1,000 xg per un periodo di 10 minuti a 4˚C e il supernatante è stato utilizzato per quantificare le concentrazioni proteiche utilizzando il test di Bradford.

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Saggio biochimico

Un saggio di immunoassorbimento enzimatico sensibile e competitivo (ELISA) è stato applicato con kit di analisi per la quantificazione degli enzimi metabolici Na-KATPasi e AChE e dei neurotrasmettitori DA, E, NE, 5HT e GABA. ELISA ha anche determinato i livelli di SOD, MDA e GPx nel tessuto corticale con kit di analisi secondo le istruzioni del produttore.

Misura NMR

La quantificazione efficiente dei metaboliti tissutali è stata ottenuta utilizzando una piattaforma analitica basata su uno spettrometro NMR Bruker Avance-III liquido ad alta risoluzione dotato di una sonda criogenica ad alta sensibilità operante a una frequenza di 600. 17 MHz per osservazione 1 H a 298 K. Una sequenza di impulsi unidimensionale 1 H ZGPR (TOPSPIN versione 3.0, Bruker Biospin) soppressa dall'acqua (RD-90˚-ACQ) è stata applicata a acquisire i dati NMR per ciascun campione. Quattro scansioni fittizie e 128 transitori sono stati registrati in un dominio temporale di 32 K punti dati utilizzando un'ampiezza spettrale di 20 ppm con un ritardo di rilassamento di 10,0 se un tempo di acquisizione di 2,73 s. Una funzione di ampliamento della linea esponenziale di 0,3 Hz e riempimento zero a 64 K punti dati sono stati applicati a tutti i decadimenti di induzione libera (FID) prima della trasformazione di Fourier. Ulteriori tecniche NMR bidimensionali con spettroscopia di correlazione del gradiente di campo pulsato (gCOSY) e spettroscopia di correlazione totale omonucleare 2D (TOCSY) sono state impiegate utilizzando programmi di impulsi standard su campioni selezionati per confermare le assegnazioni di spostamento chimico. In tutte le acquisizioni di spettri è stato utilizzato uno scambiatore automatico di campioni per la consegna continua del campione.

Identificazione e conferma dei metaboliti

I segnali NMR basati sulla posizione delle singole risonanze sugli spettri sono stati identificati nel pacchetto software Chenomx NMR Suite v. 8.4 (versione di valutazione). Le conferme di alcune assegnazioni di metaboliti sono state effettuate considerando spostamenti chimici, costanti di accoppiamento e modelli di molteplicità di metaboliti come informazioni sugli accoppiamenti scalari estratti da 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, database NMR pubblici come COLMAR e Human Metabolome Database (HMDB) e la letteratura [18, 19].

Analisi statistica multivariata

Il protocollo di preelaborazione utilizzato per la preelaborazione di ogni spettro 1D 1 H NMR era lo stesso descritto nel nostro lavoro precedente [20]. Gli spettri 1 H NMR sono stati suddivisi in fasi e corretti al basale utilizzando MestReNova (Mestrelab Research, SL, Spagna) e la regione spettrale di ciascun metabolita è stata integrata in un secchio. Le risonanze del segnale del solvente organico e la regione del segnale residuo H2O/HOD sono state rimosse in tutti gli spettri 1D 1 H NMR. A tutti gli spettri sono state applicate una procedura bucket 0.{{30}}03 Hz e la normalizzazione alla somma dell'intensità spettrale moltiplicata per 10000. Per l'analisi della fase successiva sono stati selezionati solo i valori del bucket più grandi in un picco per evitare interpretazioni errate dei metaboliti discriminanti a causa di segnali sovrapposti. Successivamente, secchi integrali di 47 metaboliti sono stati estratti e sottoposti ad analisi dei dati univariata e multivariata. L'analisi dell'indiscriminazione mediante analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi della discriminazione mediante analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) e proiezioni ortogonali all'analisi discriminante delle strutture latenti (OPLS-DA) è stata eseguita utilizzando il pacchetto software SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics , Umeå, Svezia) scalato ai dati di varianza unitaria. I grafici dei punteggi PCA e PLS-DA sono stati illustrati con la prima e la seconda componente principale (t[1], t[2]), mentre il grafico dei punteggi OPLS-DA ha utilizzato t[1] e la componente ortogonale (a[1 ]). I parametri Q2 (cum), R2Y(cum) e R2X (cum) sono stati calcolati per testare la robustezza dei modelli di discriminazione contro l'overfitting [21]. Come descritto in precedenza, un valore di valutazione della qualità di Q2 � 0,4 è considerato un modello affidabile. La strategia di convalida incrociata sette volte e il test di permutazione 200 volte con il primo componente sono stati applicati per evitare l'overfitting del modello e convalidare ulteriormente l'affidabilità e l'attendibilità dei modelli. Se la linea di regressione Q2 aveva un'intercetta negativa e i valori Q2 inseriti nel punto più a sinistra erano maggiori di tutti i valori Q2 dei punti a destra nel test permutato, il modello OPLS-DA stabilito era robusto [22]. La strategia 10-fold predefinita di convalida incrociata è stata applicata per evitare l'overfitting del modello. In generale, una statistica di valutazione della qualità (Q2) � 0,4 è considerata un modello affidabile, come descritto in precedenza. I coefficienti di correlazione (r) e i valori VIP estratti dai modelli OPLS-DA sono stati utilizzati per identificare i metaboliti che hanno contribuito in modo significativo alla separazione tra i due gruppi. Inoltre, i cambiamenti di piega dei metaboliti tra i gruppi sono stati calcolati utilizzando una funzione. IA/IB, dove IA e IB rappresentano rispettivamente i valori medi per l'integrale del metabolita nei gruppi A e B. La mappa termica e i grafici a scatola sono stati tracciati per facilitare la comprensione delle variazioni del metabolita tra i gruppi.

Statistica univariata degli integrali di metaboliti

La media dei metaboliti in ciascun gruppo è espressa come media ± deviazione standard (DS). Anche l'analisi univariata è stata effettuata utilizzando ANOVA (analisi della varianza). Differenze statisticamente significative tra i gruppi sono state valutate da un t-test non accoppiato di due code dopo la conversione logaritmica nel software GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). Differenze statisticamente significative sono state definite dai valori di p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Analisi di correlazione metabolica statistica del sistema e analisi dei cluster gerarchici

Il calcolo del coefficiente di correlazione di Pearson e l'analisi dei cluster gerarchici sono stati eseguiti sulla base degli integrali relativi dei metaboliti in R Studio (versione 1.4.1717) con piccoli script. Per ogni coppia di gruppi, la matrice di correlazione è stata illustrata in una mappa di pixel come descritto in letteratura [21]. In breve, per ciascuna variabile in un gruppo, le correlazioni con valori p inferiori a 0.05 sono state considerate correlazioni statistiche significative e sono state mantenute per costruire la rete di correlazione finale per illustrare le relazioni latenti dei metaboliti all'interno del gruppo e le relazioni metaboliche disturbate tra i gruppi. I quadrati più rossi indicano una correlazione positiva più significativa. I quadrati più blu indicano una correlazione positiva più significativa. I quadrati bianchi indicano la correlazione senza significato. L'analisi delle vie e delle reti metaboliche cerebrali più rilevanti invocate come intervistati all'HSD è stata eseguita utilizzando lo strumento MetaboAnalyst 3.0. Per l'analisi della topologia del percorso eseguita, è stata selezionata la libreria del percorso dei mammiferi Rattus norvegicus (ratto). Questo approccio è stato utilizzato anche per fornire stime dell'impatto del percorso, del tasso di false scoperte (FDR) e dei valori p.

Risultati Indici biochimici corticali dei gruppi HSD e CON

Per convalidare gli effetti di alterazione metabolica dell'HSD sui tessuti cerebrali, i parametri biochimici, comprese le attività enzimatiche metaboliche correlate al metabolismo energetico di Na-KATP, AChE e LDH, i neurotrasmettitori di DA, E, NE, 5HT e GABA e ILproteine ​​legate allo stress ossidativoDiZOLLA ERBOSA, MDAe Gpx nei tessuti della corteccia ipsilaterale dei ratti HSD e CON sono stati determinati anche (Tabella 1). Rispetto al gruppo di controllo, i livelli di DA, E, NE e MDA sono aumentati significativamente, mentre i contenuti di Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD e Gpx sono diminuiti nel modello HSD. Il limite di rilevamento dei kit di analisi utilizzati nel presente lavoro è stato elencato nella tabella S3 nel file dei materiali supplementari.

Tabella 1. La quantificazione dei parametri biochimici è stata misurata negli animali CON e HSD del tessuto corticale mediante ELISA con i kit di analisi. (media ± SD). indica significatività statistica.

Metaboliti identificati negli spettri 1 H NMR di campioni di tessuto cerebrale

La figura 3 mostra tre spettri 1 H NMR rappresentativi dalla corteccia (figura 3A), dall'ippocampo (figura 3B) e dallo striato (figura 3C) di un ratto HSD. Un'ampia gamma di metaboliti importanti è stata identificata in base ai dati 1 H NMR dei campioni di tessuto cerebrale e sono anioni di acidi organici (lattato (Lac), malonato (Maln), succinato (Suc), malato (Mal), fumarato (FMA ), 2-idrossibutirrato (2-HB), acetato (Ace), formiato (For), taurina (Tau), ascorbato(Asc), 2-idrossibutirrato (2HIB)), amminoacidi (leucina (Leu), isoleucina (Ile), valina (Val), alanina (Ala), glicina (Gly), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe), aspartato (Asp), glutammina (Gln), glutammato (Glu) , treonina (Thr), serina (Ser), lisina (Lys), asparagina (Asn)), neurotrasmettitori ( -aminobutirrato (GABA)), metaboliti legati all'energia (creatina (Cre), adenosina trifosfato (ATP), adenosina monofosfato ( AMP)), metaboliti correlati ai fosfolipidi (Ofosfoetanolammina (PEA), O-fosfocolina (Pcho), sn-glicero-3-fosfocolina (GPC)) e altri (mio-inositolo (MI), nicotinamide adenina dinucleotide (NAD più ), acido nicotinurico (Nic), N-acetilaspartato (NAA), nicotinammide-adenina-dinucleotide fosfato (NADP plus), UDP-N-galattosio (UDPGa), uridina (Uri), uracile (Ura), cistidina (Cyt) , uridina 5'-monofosfato (UMP), inosina 5'-monofosfato (IMP), inosina (Ino), colina (Cho), carnitina (Car), glutatione (GSH). La tabella S1 mostra informazioni dettagliate sulle assegnazioni dei metaboliti.

Alterazioni del profilo metabolico rivelate dall'analisi metabolomica

La PCA, un approccio di analisi esplorativo e imparziale degli spettri 1 H NMR da tutti gli estratti cerebrali in diverse regioni cerebrali, è stata inizialmente creata per rivelare le principali tendenze metaboliche guidate dall'esposizione iperbarica a un 400 msw ambiente di saturazione dell'eliox. Un grafico di scatting PC1 vs PC2 ottenuto da PCA (S1A – S1C Fig) di dati integrali del secchio ha rivelato una certa discriminazione con una certa sovrapposizione tra le due classificazioni. Le indagini supervisionate sui modelli PLS-DA (S1A' – S1C' Fig) e OPLS-DA (Fig 4A – 4C) hanno mostrato chiare discriminazioni di classe dei profili metabolici tra i gruppi. La figura 4 mostra i grafici dei punteggi del modello OPLS-DA per la regione della corteccia (A), la regione dell'ippocampo (B) e la regione dello striato (C), mostrando una chiara discriminazione tra i gruppi HSD e i controlli. L'elevata variazione spiegata e la bontà della previsione riflessa dai valori di R2X e Q2 (S1A'–S1C' Fig, Fig 4A–4C) e dai grafici del test di permutazione (Fig 4'{-4C'A) indicavano il robustezza dei modelli supervisionati generati. Il coefficiente di correlazione (r) estratto dai grafici della linea S, l'importanza variabile nella proiezione (VIP) e il valore p dai test univariati non parametrici sono stati raccolti per valutare i metaboliti significativi responsabili dei modelli discriminanti di classe. Pertanto, soddisfacendo uno qualsiasi dei tre criteri (il valore assoluto di r maggiore di 0.50, il valore di VIP maggiore di 1.0, insieme a un valore p inferiore a 0.05), abbiamo selezionato un pannello di metaboliti statisticamente significativi (Tabella 1) responsabile della separazione tra i gruppi CON e HSD. Nella Tabella 1, i valori di cambiamento di piega maggiori di 1 indicano un livello aumentato nel gruppo HSD, mentre i valori di cambiamento di piega inferiori a 1 indicano un livello diminuito nel gruppo HSD. I valori medi di SD dei metaboliti discriminatori sono elencati nella tabella S2. Utilizzando l'analisi gerarchica dei cluster dei metaboliti e il metodo di collegamento medio, la mappa termica generata (Fig. 5A-5C) con i dendrogrammi consente una migliore visualizzazione delle alterazioni metaboliche di tre regioni cerebrali causate dall'esposizione iperbarica in un ambiente saturo di ossigeno all'elio.

Disturbi metabolici osservati in diverse regioni cerebrali di ratti HSD

La suddetta analisi multivariata e l'analisi univariata utilizzando l'altezza del secchio dei metaboliti nei diversi gruppi hanno fornito un ottimo tubo di lavoro per identificare i metaboliti discriminatori che rivelano le potenziali alterazioni metaboliche neurologiche associate agli eventi HSD. Nel tessuto corticale dell'HSD sono stati trovati elevati AMP, FMA, Nic e Phe e una diminuzione di Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura e Uri gruppo rispetto al gruppo CON (Fig 5A, Tabella 1). Nel frattempo, nell'ippocampo, anche Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr e Ura sono diminuiti e l'AMP è aumentato nel gruppo HSD, così come nella corteccia. Inoltre, il Thr sovraregolato e Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc e DMA sottoregolati sono stati espressi negli estratti di ippocampo del gruppo HSD rispetto ai controlli (Fig. 5B, 5D, Tabella 1). Rispetto al gruppo CONS, anche il contenuto di Cyt, GABA, Ura, Cho e Thr è diminuito come nella corteccia e nell'ippocampo. Inoltre, livelli aumentati di aminoacidi a catena ramificata (BCAA, inclusi Leu, Ile, Val) e Lys e livelli ridotti di Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, una serie di metaboliti di ATP, Tau, IMP, e Suc, che sono diminuiti anche nell'ippocampo, e altri due metaboliti, Ino e Pcho, anch'essi diminuiti nella corteccia, sono stati osservati nei tessuti striati dei ratti del gruppo HSD (Fig. 5C, 5D, Tabella 1). Tali numerosi metaboliti indicano sempre percorsi molecolari implicati con complessità e diversità. I valori integrali del secchio dei metaboliti discriminanti sono stati quantificati e i cambiamenti di piega statisticamente significativi delle loro concentrazioni tra i gruppi di heliox-saturazione-iperbarico-esposti e di controllo sono riassunti nella tabella S2 e nella tabella 2 per le tre regioni del cervello.

Fig 4. Grafici del punteggio dell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) e grafici del test di permutazione che discriminano l'effetto dell'esposizione alla saturazione di eliox 400 msw su spettri 1H NMR da gruppi di controllo nella corteccia (CONC, n=8, HSDC, n=8, A e A') (R2X=0.38; Q2=0.46), ippocampo (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B e B') (R2X=0.37; Q2=0.43) e striato (CONS, n=8, HSDS, n=8, C e C') (R2X=0.39; Q2=0.40). I valori del parametro Q2 nei grafici del punteggio OPLS-DA, che erano uguali o maggiori di 0,40, accoppiati con i valori Q2 del punto più a sinistra nei modelli permutati erano maggiori di tutti i valori Q2 adattati dei punti a destra (permutazione test 80 volte), indicando che i modelli OPLS-DA stabiliti erano validi.

Pcho, che è diminuito anche nella corteccia, è stato osservato nei tessuti striato dei ratti del gruppo HSD (Fig. 5C, 5D, Tabella 1). Tali numerosi metaboliti indicano sempre percorsi molecolari implicati con complessità e diversità. I valori integrali del secchio dei metaboliti discriminanti sono stati quantificati e i cambiamenti di piega statisticamente significativi delle loro concentrazioni tra i gruppi di heliox-saturazione-iperbarico-esposti e di controllo sono riassunti nella tabella S2 e nella tabella 2 per le tre regioni del cervello.

Fig 5. Heatmap e grafici di correlazione statistica derivati ​​dai valori del secchio dei metaboliti discriminatori dalla corteccia (i campioni A, A', HSDC si trovano nel pannello superiore e CONC si trova nel pannello inferiore), ippocampo (B, B', HSDH gruppo si trova nel pannello superiore e CONH si trova nel pannello inferiore) e striato (i campioni C, C', HSDS si trovano nel pannello superiore e CONS si trova nel pannello inferiore) tessuti di ratti HSD e CON. I metaboliti sulla mappa termica sono organizzati in cluster gerarchici basati sulla somiglianza complessiva nei modelli di livello. Diagramma di Venn (D) che illustra la sovrapposizione dei metaboliti tra i confronti HSDC-CONC, HSDH-CONH e HSDS-CONS.

Analisi di correlazione del metabolita

La relazione tra o tra i metaboliti era così complessa in Fig 5A'-5C'. Per i metaboliti energetici, le correlazioni positive per Lac vs Ala in HSDC, AMP vs IMP in HSDH, ATP vs Pcho in HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA in HSDS e le correlazioni negative per Lac vs Thr e GSH vs Suc in HSDH, Suc vs Val in HSDS erano presenti nei grafici di correlazione del metabolita. Per i neurotrasmettitori, le correlazioni positive per GABA vs Car in HSDC, GABA vs Cho in CONH e GABA vs Suc/Ino/Gln in HSDS erano presenti nei grafici di correlazione del metabolita. Le correlazioni negative per GABA vs FMA nel CONC e GABA vs NAA/Ura/NADP plus nel CONS erano presenti nei grafici di correlazione del metabolita. Per i metaboliti correlati alo stress ossidativo, ILcorrelazioni positiveper GSH vs Asn nell'HSDC e nel CONC, Tau vs Lac nell'HSDH, Tau vs Suc/Ala nel CONH, le correlazioni negative per GSH vs Suc nell'HSDH, Tau vs Thr nell'HSDH erano presenti nella correlazione del metabolita trame.

Analisi della via metabolomica

L'analisi quantitativa del percorso consistente nell'analisi dell'arricchimento del percorso e nell'impatto del percorso dalla topologia del percorso ha rivelato modulazioni indotte da HSD altamente statisticamente significative a una serie di percorsi metabolici. I punteggi di impatto del percorso, insieme al tasso di scoperta falsa (FDR) e ai valori p, sono descritti nella Figura 6. I percorsi sono stati considerati significativamente arricchiti se i valori p erano inferiori a 0.05; i metaboliti profilati (hit) relativi ai metaboliti totali della via (match status) erano superiori a 1; e i punteggi di impatto (che indicano l'impatto dei metaboliti significativamente interessati nel percorso basato sulla misura della topologia di rete della relativa centralità tra) erano superiori a 0. I percorsi nella corteccia (Fig. 6A) con il valore di impatto metabolico maggiore eranofenilalanina, tirosina, Ebiosintesi del triptofano>metabolismo della fenilalanina> metabolismo delle pirimidine > metabolismo dell'alanina, dell'aspartato e del glutammato. I percorsi nell'ippocampo (Fig. 6B) con il maggiore impatto metabolico erano biosintesi di fenilalanina, tirosina e triptofano > metabolismo del glutatione > metabolismo della glicina, della serina e della treonina > metabolismo delle purine > metabolismo della pirimidina > metabolismo dell'alanina, dell'aspartato e del glutammato > metabolismo del butanoato . I percorsi nello striato (Fig. 6C) con il maggiore impatto metabolico erano il metabolismo dell'alanina, dell'aspartato e del glutammato> il metabolismo del nicotinato e della nicotinamide> il metabolismo delle purine.

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