Parte 1: Polarizzazione M1 della microglia repressa con acteoside attraverso la via di segnalazione NF-κB inibita e recupero della funzione dei mitocondri mediato da AMPK

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Astratto:

Sfondo:Morbo di Alzheimer (AD)è il tipo più frequente di demenza. Mentreacteoside da erba cistanche(ACT), un composto isolato da Cistanchetubulosa, possiede proprietà neuroprotettive. Tuttavia, il meccanismo alla base della regolazione della polarizzazione della microglia rimane mal definito.Metodi:Qui, il modello di AD indotto da AlCl3-in larve di zebra¦sh è stato applicato per scoprire l'efficacia terapeutica di ACT. Le cellule BV-2 sono state utilizzate per dimostrare il ruolo di ACT sulla polarizzazione della microglia. Sequenza RNA, HPLC-Q-TOF-MS, western blot e docking molecolare sono stati combinati per confermare il suo meccanismo.Risultati:ACT ha migliorato significativamente la discinesia sperimentale e i disturbi del sistema nervoso nello zebra¦sh. Successivamente, ha soppresso la polarizzazione M1 e promosso al fenotipo M2 nelle cellule BV-2 indotte da LPS. Abbiamo innanzitutto dimostrato che l'ACT ha esercitato un profondo impatto trascrittomico, che ha coinvolto la regolazione delle vie di segnalazione chiave nell'infiammazione, la biosintesi dell'arginina, nonché la biosintesi del pantotenato e del CoA, correlando con la funzione dei mitocondri. ATTO(acteoside da erba cistanche) il trattamento ha ridotto la polarizzazione della microglia M1 inibendo la via di segnalazione NF-κB. E le vie metaboliche sono state ulteriormente confermate da HPLC-Q-TOF-MS. Inoltre, ACT ha corretto i ROS in eccesso per ripristinare la funzione dei mitocondri attraverso la sovraregolazione PGC-1 e UCP{7}} mediata da AMPK, coerentemente con i cambiamenti metabolici. Curiosamente, ACT può legarsi direttamente sia a NF-κB che a AMPK, come evidenziato dall'aggancio molecolare.Conclusioni:La ricerca ha fornito un meccanismo infusivo dell'ACT e ha illustrato una nuova prospettiva basata sulla disfunzione mitocondriale per rivelare la connessione tra metabolismo e polarizzazione della microglia.

Sfondo:

Alzheimerla malattia(AD) è una comune malattia neurodegenerativa accompagnata da deterioramento cognitivo e discinesia[1]. È caratterizzata da grave perdita neuronale, placche senili e grovigli neurobrillari[2]. La patogenesi dell'AD è multidimensionale e legata alla neuroinfiammazione. La neuroinfiammazione è guidata dall'attivazione delle cellule gliali, strettamente correlata allo sviluppo dell'AD[3, 4]. Durante la progressione e l'esacerbazione della neuroinfiammazione, la microglia è considerata il fattore chiave. Le microglia sono le cellule immunitarie primarie del sistema nervoso centrale. È strettamente associato a una cascata di processi, che contengono lo sviluppo del cervello, il mantenimento di un ambiente neutrale, nonché la risposta a lesioni e riparazioni[1]. Inoltre, la microglia può essere stimolata a un fenotipo M1 e l'espressione di citochine pro-infiammatorie è aumentata quando si sono verificate malattie correlate alla neuroinfiammazione come l'AD[5]. Gli studi dimostrano anche che la polarizzazione al fenotipo M1 è spesso accompagnata da disordini metabolici[6], causando squilibri del metabolismo energetico e disfunzione mitocondriale[7]. Questi cambiamenti avversi derivano dalla neurodegenerazione, persino dall'AD.

acteoside da erba cistanche(ACT), un glicoside feniletanoide, deriva principalmente da Cistanchetubulosa. Prove crescenti hanno suggerito che l'ACT possedesse numerose attività farmacologiche, inclusi effetti neuroprotettivi[8], antinfiammatori[9] e antiossidanti[10]. In particolare, è stato riportato che l'ACT migliora l'apprendimento e il deterioramento della memoria, oltre a sovraregolare il metabolismo energetico nei ratti indotti da streptozotocina[11]. È stato anche suggerito di inibire la morte cellulare apoptotica neuronale e il danno mitocondriale nei topi sperimentali con encefalomielite autoimmune[12]. Tuttavia, meno studi si sono concentrati sull'effetto di ACT sulla polarizzazione della microglia M1/M2. In particolare, non sono stati eseguiti vari meccanismi, come la riparazione della funzione dei mitocondri e la regolazione del metabolismo cellulare. Inoltre, il meccanismo dell'ACT che ha contribuito alla polarizzazione della microglia M1/M2 è rimasto inesplorato.

Il presente rapporto aveva lo scopo di studiare l'efficacia terapeutica dell'ACT nonché il meccanismo molecolare sottostante dell'ACT nell'AD. In questo caso, ACT ha mostrato un significativo effetto di neuroprotezione nelle larve di zebra¦sh indotte da AlCl3-AD. Inoltre, ACT ha efficacemente inibito la polarizzazione M1 e promosso il fenotipo M2 nelle cellule BV-2 indotte da LPS. RNA-Sequencing (RNA-Seq) integrato con il metodo metabolomico per comprendere meglio il meccanismo alla base dell'ACT nella regolazione della polarizzazione della microglia. È stato studiato il crosstalk tra metabolismo e polarizzazione della microglia in termini di funzione mitocondriale. Questo studio fornirà un nuovo rispetto per l'ulteriore indagine dell'ACT come potenziale agente terapeutico per il trattamento dell'AD.

Metodi:

Animali e raggruppamento di modelli:

Zebra¦sh di tipo selvatico (ceppo AB, 4 mesi) sono stati scelti in questo studio (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Sono stati mantenuti sotto un ciclo luce/buio di 14/10 h a 28 gradi, seguendo il metodo precedente[13]. Il fertilizzante naturale e gli embrioni normalmente sviluppati sono stati generati e coltivati ​​a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) in un'incubatrice di illuminazione. Tutti gli esperimenti di zebra¦sh sono stati condotti sotto la supervisione dell'Animal Ethics Committee della China Pharmaceutical University.

Le larve di Zebra¦sh sono state divise in sei gruppi e trattate da 3 dpf a 7 dpf: gruppo di controllo, gruppo modello, gruppo modello più donepezil cloridrato (DPZ), gruppo modello più ACT. Il gruppo di controllo è stato mantenuto nel mezzo con 0,2 percento di DMSO e il gruppo modello è stato trattato con AlCl3 150 μM (pH 5,8). Il gruppo modello più DPZ è stato co-trattato con AlCl3 e 8 μM DPZ. Il modello più i gruppi ACT sono stati co-trattati con AlCl3 e diverse concentrazioni di ACT (200, 100, 50 μM). ATTO(acteoside da erba cistanche)(Purezza HPLC maggiore o uguale al 98 percento) è stato ottenuto da Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Cina). AlCl3·6H2O e DPZ sono stati acquistati da Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shanghai, Cina).

Analisi comportamentale

I movimenti delle larve di Zebra¦sh sono stati registrati con un analizzatore comportamentale ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) a 28 gradi. In breve, i parametri comportamentali e l'elaborazione dei risultati erano coerenti con il metodo che abbiamo stabilito in precedenza[13]. Qui, sono stati selezionati la velocità media (AS), il cambiamento di velocità (ΔS), il tasso di recupero della discinesia (DRR) e l'efficienza della risposta (RE, percentuale ) per valutare il recupero della discinesia in zebra¦sh.

Dopo il trattamento da 3 dpf a 7 dpf, sono state raccolte larve di zebra¦sh per misurare l'attività di AChE e ChAT. Sulla base del protocollo del produttore, l'attività è stata rilevata dai kit di test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Cina). E le concentrazioni proteiche di diversi campioni sono state determinate con il metodo BCA.

Le cellule BV-2 sono state seminate in un 6-pozzetto separatamente (n=6/gruppo). Dopo il trattamento, il mezzo è stato rimosso e le cellule sono state lavate tre volte con PBS freddo. Quindi esposto immediatamente all'azoto liquido per sopprimere il metabolismo cellulare. Le cellule sono state raccolte con metanolo freddo all'80 percento (1 mL/pozzetto) e la sospensione è stata trasferita in una provetta Eppendorf da 2 mL. Per facilitare la precipitazione delle proteine, agitare vigorosamente su vortex per 1 min e centrifugare a 13,{8}} rpm per 15 min a 4 gradi . La sospensione cellulare è stata trasferita in una nuova provetta Eppendorf da 2 mL ed essiccata sotto un flusso di azoto e conservata a -80 gradi fino all'analisi. Il residuo essiccato è stato ricostituito in 150 μL di acetonitrile pre-raffreddato al 25%. Al fine di garantire la stabilità e l'accuratezza dell'analisi della sequenza, volumi uguali (10 μL) di ciascun campione cellulare sono stati combinati come campioni di controllo di qualità (QC). Durante il rilevamento dei metaboliti, questi campioni sono stati iniettati dopo ogni sei campioni cellulari per confermare la loro stabilità. Un'aliquota di 1 μL è stata iniettata per HPLC-Q-TOF-MS.

L'analisi HPLC-Q-TOF-MS è stata eseguita sul sistema HPLC Agilent 1290 collegato allo spettrometro di massa Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). La separazione è stata effettuata su una colonna ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1×100 mm, 1,7 μm). La fase mobile era composta da 0,1 percento di acido formico-acqua (v/v; A) e acetonitrile (B).

La velocità di §flusso è stata impostata a {{0}},4 ml/min con la seguente condizione di eluizione del gradiente ottimale: da 0 a 2 min, 5% B; da 2 a 20 min, dal 5% al ​​95% B (modalità ioni positivi); da 0 a 2 minuti, 5 percento B; Da 2 a 20 min, dal 5% al ​​95% B (modalità ioni negativi). I parametri di funzionamento dello spettrometro di massa sono stati impostati come segue: temperatura del gas, 320 gradi; gas essiccante, 10 L/min; nebulizzatore, 35 psi; VCap, 4000 V; frammento, 120 V.

I dati grezzi sono stati gestiti con MassHunter Workstation Software versione B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). I dati grezzi sono stati pre-elaborati dalla piattaforma XCMS. L'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (PLS-DA) dei dati normalizzati sono state condotte con MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). In combinazione con la letteratura, i metaboliti differenziali (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">