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I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* e Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1Graduate Institute of Neural Regenerative Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, Taipei 11031, Taiwan

2Istituto di Biologia Molecolare, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Taiwan

4Centro di ricerca di medicina clinica, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Taiwan

5Dipartimento e istituto universitario di scienze biomediche, College of Medicine, Chang Gung University, Taoyuan 33302, Taiwan

6Centro di ricerca sulle neuroscienze, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Taiwan

7Contatto principale

*Corrispondenza: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche può migliorare la memoria

RIEPILOGO

La variazione fenotipica è un prerequisito fondamentale per l'evoluzione di cellule e organismi mediante selezione naturale. Mentre il ruolo dell'espressione genica stocastica nella diversità fenotipica di cellule geneticamente identiche è ben studiato, non si sa molto per quanto riguarda la relazione tra l'espressione genica stocastica e la variazione comportamentale individuale negli animali. Dimostriamo che uno specifico miRNA (miR-466f-3p) è sovraregolato nell'ippocampo di una porzione di topi consanguinei individuali durante un'attività di labirinto d'acqua Morris. È significativo che miR- 466f-3p regola positivamente la morfologia, la funzione e l'apprendimento spaziale dei neuroni ememoriacapacità dei topi. Meccanicamente, miR-466f-3p reprime la traduzione di MEF2A, un regolatore negativo dell'apprendimento/memoria. Infine, mostriamo che la varia sovraregolazione del miR ippocampale -466f-3 p risulta dalla fosforilazione randomizzata dell'elemento di risposta (CREB) dell'AMP ciclico ippocampale (cAMP) negli individui. Questa scoperta di modulazione dell'apprendimento spaziale ememoriatramite un asse di segnalazione ippocampale randomizzato sulla stimolazione neuronale rappresenta una dimostrazione di come la variazione nell'espressione genica dei tessuti porti a un comportamento animale vario.

INTRODUZIONE

La variazione fenotipica tra gli individui conferisce un vantaggio evolutivo poiché fornisce la diversità della popolazione su cui agisce la selezione naturale (Pavlicev et al., 2011). Il background genetico e i fattori ambientali contribuiscono a generare tale variazione naturale (Bendesky e Bargmann, 2011). Sperimentalmente, i topi consanguinei sono stati spesso utilizzati per studiare le basi molecolari e cellulari dei fenotipi e dei comportamenti medi in modo da ridurre al minimo gli effetti delle differenze genetiche tra gli individui testati (Casellas, 2011). Tuttavia, è stata mostrata una variazione dell'abbondanza della trascrizione dei tessuti tra i singoli topi isogenici. I geni che esibiscono livelli di espressione altamente variabili sono spesso associati alla funzione immunitaria, alle risposte allo stress e alla regolazione ormonale, cioè a processi sensibili ai segnali ambientali (Vedell et al., 2011). Alcuni di questi studi hanno anche dimostrato che le differenze nell'espressione genica o nella segnalazione cellulare, con o senza l'influenza di fattori ambientali come la leccatura materna, la fornitura di nutrienti in utero o la resilienza indotta dallo stress rispetto alla suscettibilità (Bale, 2015; Danchin et al ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), possono portare a differenze nei fenotipi e nei comportamenti (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Apprendimento spaziale ememoriala formazione controllata dal cervello può essere suddivisa in due sistemi: (1) navigazione egocentrica che impiega auto-movimento e segnali interni e (2) navigazione allocentrica che coinvolge principalmente l'ippocampo e le strutture cerebrali vicine che è stimolata da segnali distali al di fuori degli organismi (Ekstrom et al., 2014). La capacità di apprendimento spaziale ememoriaconsente alla maggior parte delle specie animali di adattare progressivamente i propri comportamenti per adattarsi in ambienti spazialmente e temporalmente variabili, il che è fondamentale per la loro sopravvivenza. Questo può essere valutato negli animali da laboratorio applicando paradigmi comportamentali come il Morris Water Maze (MWM) (Vorhees and Williams, 2014). In particolare, è stato dimostrato che roditori consanguinei geneticamente identici mostrano variazioni fenotipiche nell'apprendimento spaziale ememoria(Tsai et al., 2002), ma i meccanismi alla base di questa variazione comportamentale sono rimasti sconosciuti.

La formazione di nuove memorie è un processo complesso che richiede trascrizione generata dall'attività, nuova sintesi proteica e

Figura 1. Correlazione tra la variazione dell'apprendimento spaziale ememoriacapacità e induzione miR-466f-3p

(A) Compito MWM di topi consanguinei C57BL/6J di tipo selvatico. Pannello di sinistra: prestazioni MWM di topi GLN (punti) e topi PLN (quadrati). Su un totale di 289 topi testati, 180 sono stati classificati come GLN e 109 come PLN. Riquadro destro: test dell'attività MWM (n=47 e 30 in ogni gruppo). Nell'istogramma vengono confrontate le medie trascorsa in ciascuno dei quattro quadranti e la regione della piattaforma. P, luogo della piattaforma mancante; T, zona target senza P; R, zona destra; O, zona opposta; L, zona sinistra. (B) Analisi RT-qPCR dell'espressione di miRNA. I livelli di espressione relativa di sei miRNA situati all'interno del cluster miR-466-669 e del miR-132-3p, come controllo positivo arricchito nel cervello, sono stati analizzati e normalizzati con il controllo interno U6 snRNA dall'ippocampo di topo GLN e PLN (n=9–18 per gruppo). Io, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i{20}}p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3pag.

rete neuronale specifica finemente sintonizzata comememoriaengram per creare nuove connessioni neuronali e plasticità sostenuta (Asok et al., 2019). Gli engram ippocampali, che sono popolazioni sparse di neuroni nel giro dentato (DG), rappresentano insiemi di neuroni che mostrano una maggiore attività dopomemoriaformazione. Mentre i neuroni dell'engram DG mostrano un pattern di espressione genica altamente distinto (Rao-Ruiz et al., 2019), i meccanismi molecolari specifici dell'engram alla basememoriail consolidamento rimane in gran parte sconosciuto. È noto che vari fattori e vie di segnalazione regolano positivamente o negativamente l'apprendimento ememoriai processi sono stati identificati (Abraham et al., 2019; Humeau e Choquet, 2019). Tra questi, la forma attivata di AMP ciclico (cAMP)-response element-binding protein (CREB) stimola la trascrizione genica in risposta agli aumenti attività-dipendenti del Ca2 plus intracellulare nei neuroni (Kandel, 2012). D'altra parte, il campo/PKApathway reprime l'attività trascrizionale del fattore 2 (MEF2) impedendo l'esportazione nucleare del suo co-repressore, HDAC5, e l'importazione nucleare del co-attivatore NFAT (Belfield et al., 2006). Inoltre, a differenza di CREB, l'attività MEF2A limitamemoriaformazione (Cole et al., 2012). Oltre ai fattori proteici, i microRNA (miRNA) sono coinvolti anche nella regolazione delle funzioni neuronali, inclusi l'apprendimento e la memoria (McNeill e Van Vactor, 2012). I miRNA sono piccoli (22 nt) RNA non codificanti che agiscono principalmente come regolatori post-trascrizionali dell'espressione genica tramite l'associazione di basi specifiche per sequenza con i loro siti di riconoscimento nelle 30 regioni non tradotte (30 UTR) di mRNA specifici (Daugaard e Hansen, 2017). I miRNA partecipano a una serie di vie di segnalazione nei neuroni post-mitotici e mediano i processi cellulari dipendenti dall'attività, tra cui la crescita e la ramificazione dendritica, la formazione di sinapsi e la maturazione. Regolando l'espressione genica, svolgono anche ruoli importanti nelle forme durature di plasticità sinaptica che sono alla basememoriaformazione, recupero e consolidamento (Chen e Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

Di seguito, presentiamo prove di un nesso causale tra l'espressione genica del tessuto stocastico e la variazione comportamentale individuale negli animali. In particolare, dimostriamo che l'attivazione stocastica di un asse ippocampale CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A modula la variazione individuale dell'apprendimento spaziale ememoriacapacità nei topi consanguinei.

RISULTATI

Variazione individuale dell'apprendimento spaziale ememoriala capacità è correlata con l'induzione di miR-466f-3p da uno specifico cluster di miRNA

Identificare i miRNA coinvolti nella regolazione dell'apprendimento ememoriaformazione, abbiamo utilizzato l'attività MWM per distinguere i topi C57BL/6J di tipo selvatico consanguinei con capacità di apprendimento e memoria buone o scarse (Figura 1A). Abbiamo definito i topi che hanno completato il compito entro 30 s nell'ultima (6a) sessione come "buoni studenti" (GLN), mentre i topi che non sono riusciti a trovare la piattaforma entro 30 s nell'ultima sessione sono stati considerati "poveri studenti" ' (PLN). Come mostrato nella Figura 1A (pannello di sinistra), il 62% dei topi apparteneva al gruppo GLN (180 su 289 topi), esibendo una marcata riduzione della latenza di fuga da 98,1 s (1a sessione) a 21,8 s (6a sessione). Al contrario, la latenza di fuga del restante 38% dei topi, il gruppo PLN (109 topi su 289), è stata ridotta solo moderatamente tra la prima e la sesta sessione (da 111,8 s nella 1a sessione a 82,1 s nella 6a sessione) . Il test della sonda, indicando che i topi avevano effettivamente appreso il compito nelle sei sessioni, ha anche mostrato che i topi GLN sono rimasti più a lungo nella regione della piattaforma rispetto ai topi PLN (Figura 1A, coppia di barre a sinistra nel pannello di destra).

Successivamente, abbiamo analizzato gli RNA dell'ippocampo di topi GLN e PLN mediante ibridazione di microarray miRNA (n {0}} ciascun gruppo). In generale, abbiamo osservato differenze relativamente minori nei profili di espressione dei miRNA dell'ippocampo da topi GLN e PLN. Tuttavia, abbiamo notato che i primi 10 miRNA per i quali i livelli di espressione erano più alti nei topi GLN rispetto ai topi PLN (dati non mostrati) erano tutti derivati ​​​​dallo stesso cluster di miRNA specifico per roditore, miR-466-669, situato nell'introne 10 di il gene mSfmbt2 (vedi sotto). Sulla base dell'analisi della reazione a catena della polimerasi quantitativa di trascrizione inversa (RT-qPCR) i livelli di espressione di miRNA selezionati nel cluster, abbiamo scelto miR-466f{9}}p per ulteriori indagini (Figura 1B). L'espressione media di questo miRNA era 1.5-più alta nell'ippocampo dei topi GLN rispetto ai topi PLN. In particolare, i livelli medi di miR ippocampale-466f-3p erano simili tra il gruppo PLN, il gruppo di controllo della gabbia domestica (HC) e il gruppo di controllo del nuoto (Figura 1C), escludendo così gli effetti legati all'esercizio durante nuoto e sostenere ulteriormente l'idea che miR-466f-3p sia stato indotto durante l'apprendimento spaziale ememoriaformazione.

Nella Figura 1C, i dati rivelano che i livelli di espressione di miR ippocampale-466f-3p di oltre il 42% dei topi GLN erano almeno 1.5-volte superiori al livello di espressione medio di Topi di controllo HC, mentre i livelli nel 15% dei topi PLN erano la metà di quelli dei topi HC. Circa il 25% dei topi GLN e il 55% dei topi PLN avevano livelli simili di miR-466f{{10}}p (da 0.8- a 1.2- piega rispetto a HC). Il grafico a dispersione della correlazione di Pearson che mostra una correlazione positiva tra i livelli di miR-466f-3p e la durata percentuale sulla piattaforma durante il test del probe è presentato nella Figura 1D. Abbiamo anche eseguito miR-466f-3p e U6 piccolo RNA nucleare (snRNA) in situ ibridazione (ISH) delle fette di cervello nei topi GLN e PLN (Figura 1E). L'analisi statistica dei segnali miR- 466f-3p tramite ISH ha confermato che l'induzione di miR-466f- 3p era effettivamente maggiore nella DG dei topi GLN rispetto a quella di

Topi PLN, mentre non è stata trovata alcuna differenza quando sono stati confrontati i segnali snRNA U6 (istogramma a destra, Figura 1E). Sebbene i segnali miR-466-3p non fossero uguali tra le singole cellule granulari in DG, sono comunque aumentati in modo significativo e onnipresente nell'ippocampo dei topi GLN rispetto ai topi PLN. Pertanto, l'induzione di miR-466f-3p non è avvenuta solo in una piccola porzione di cellule, ad esempio i neuroni dell'engram. Questi dati indicano che la sovraregolazione di miR-466f-3p durante l'attività MWM è strettamente associata a un migliore apprendimento spaziale ememoriacapacità tra una proporzione significativa di topi GLN.

Abbiamo anche analizzato i livelli medi di espressione di diversi miRNA specifici del cervello mediante RT-qPCR. Tra questi, miR-132-3p è stato sovraregolato nell'ippocampo del topo dopo l'attività MWM, ma non abbiamo osservato differenze significative tra i gruppi GLN e PLN (coppia di barre VII, Figura 1B). I livelli di espressione di miR-335-5p e miR-22 erano simili tra i gruppi GLN, PLN e HC (Figura S1A). Pertanto, a differenza di miR-466f-3p, l'espressione ippocampale di questi miRNA durante l'allenamento MWM non è correlata con l'apprendimento spaziale ememoriacapacità dei topi.

La sovraregolazione miR-466f-3p promuove la crescita di neuriti e la formazione di spine dendritiche

Per confermare che miR-466f-3p era effettivamente espresso nei neuroni, abbiamo eseguito miRNA ISH combinato con la colorazione di immunofluorescenza (IF) di NeuN e MAP2 nei neuroni ippocampali primari. I risultati hanno mostrato che, analogamente ad altri miRNA (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p era espresso principalmente nella regione del soma neuronale, con alcuni segnali aggiuntivi nei dendriti (Figura S2A). Comprendere le basi molecolari e cellulari dell'associazione di miR-466f{9}}p sovraregolato con l'apprendimento ememoriaformazione, abbiamo prima sovraespresso transitoriamente miR-466f-3p insieme a un polipeptide di fusione dsRed sotto il controllo del promotore dell'ubiquitina dal pFUGW-miR-466f-3p- plasmide dsRed nei neuroni ippocampali primari DIV10 (Figura S2B). Attraverso miRNA ISH, abbiamo confermato che il segnale miR-466f-3p è più forte nel gruppo di sovraespressione miR-466f-3p rispetto al controllo vettoriale o al miR mutante{{ 12}}f-3gruppo p (frecce, Figura S2B). Parallelamente, abbiamo anche creato una piattaforma per esaminare l'effetto della perdita di funzione di miR-466f-3p per inibizione di miR-466f-3p utilizzando la spugna miR situata in il 30 UTR dell'mRNA di EGFP espresso dal plasmide pFUGW-miR-spugna-EGFP (Figura S2C). Il reporter EGFP nel plasmide spugna fungeva sia da indicatore dell'efficienza di trasfezione che da sensore dell'attività del miRNA cellulare (Kluiver et al., 2012). In una porzione significativa delle cellule HEK293T trasfettate, il segnale EGFP è diminuito durante la coespressione con miR di tipo selvaggio-466f-3p, ma non con miR mutante-466f{{32 }}p, a causa dell'inibizione della traduzione dell'mRNA di EGFP mediante il legame di miR-466f-3p a miR-spugna nel 30 UTR (confronta le quattro immagini a sinistra e due suo-programma, Figura S2C) . Al contrario, non abbiamo osservato una diminuzione del segnale EGFP sulla co-espressione della spugna di controllo che codifica otto copie di una sequenza criptata dal plasmide pFUGW-SCR-spugna-EGFP con miR-466f-3p o il suo mutante (confronta le quattro immagini e i due istogrammi a destra).

Come mostrato nella Figura 2A, l'espressione ectopica di miR-466f-3p ha provocato cambiamenti morfologici dei neuroni, in particolare una maggiore crescita dei neuriti rispetto ai neuroni di controllo trasfettati con il vettore pFUGW- che esprime dsRed dsRed o mutante miR-466f-3plasmide che esprime pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. I dati di quantificazione hanno mostrato che il numero medio di rami dendritici per neurone non era significativamente diverso tra il gruppo con sovraespressione di miR-466f-3p (barra II) e il controllo vettore o mutante (barre I e III) (a destra istogramma superiore, Figura 2A). Tuttavia, la lunghezza media totale dei dendriti e la lunghezza media dei dendriti primari sono aumentate in seguito alla sovraespressione di miR-466f-3p (confrontare la barra II con le barre I e III, istogramma in basso a destra della Figura 2A). Parallelamente, abbiamo inibito il miR endogeno-466f-3p utilizzando la spugna miR. Come visto, non vi era alcuna differenza significativa nel numero di rami dendritici tra i gruppi di inibizione miR-466f-3p-inibizione (confrontare la barra IV con le barre I e V, istogramma in alto a destra, Figura 2A) , ma il gruppo miR-466f-3p-inibizione ha mostrato una notevole riduzione della lunghezza media totale dei dendriti e delle lunghezze medie dei dendriti primari e secondari rispetto ad altri gruppi (confrontare la barra IV con le barre I e V, istogramma inferiore destro della Figura 2A). Inoltre, la colorazione IF ha dimostrato che la sovraespressione di miR- 466f-3p, ma non l'inibizione, aumentava anche la densità delle spine dendritiche (Figura 2B, pannelli superiori e istogramma in basso a sinistra). Abbiamo anche eseguito la co-colorazione per la proteina di densità postsinaptica 95 (PSD-95) e contato la densità delle spine dendritiche colocalizzate per stabilire il numero esatto di sinapsi eccitatorie (Figura 2B, istogramma in basso a destra), che ha rivelato che miR{{40 }}f-3p sovraespressione ha aumentato la densità delle spine PSD-95-positive rispetto ad altri gruppi di controllo. Tuttavia, l'inibizione di miR-466f-3p non ha alterato significativamente la densità delle spine PSD-95-positive rispetto a quella dei gruppi di controllo (Figura 2B, istogramma in basso a destra). Insieme, questi dati indicano che, in assenza di stimolazione neuronale, l'inibizione di miR-466f-3p da sola non influisce sulla densità delle sinapsi eccitatorie o delle spine dendritiche totali.