Parte 1: Effetti antinfiammatori, antiossidanti, idratanti e antimelanogenesi della quercetina 3-O- - D-glucuronide nei cheratinociti umani e nelle cellule di melanoma tramite l'attivazione delle vie NF-κB e AP-1

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Astratto: Quercetina3-O- -D-glucuronide(Q-3-G), il coniugato glucuronide della quercetina, è stato segnalato come aventeantinfiammatorioproprietà nei macrofagi stimolati dai lipopolisaccaridi, nonché proprietà antitumorali e antiossidanti. A differenza della quercetina, che è stata ampiamente descritta per possedere un'ampia gamma di attività farmacologiche, compresi gli effetti protettivi della pelle, i benefici farmacologici e i meccanismi del Q-3-G nella pelle sono rimasti da chiarire. Questo studio si è concentrato sulla caratterizzazione delle proprietà protettive della pelle, comprese le proprietà antinfiammatorie e antiossidanti, del Q-3-contro lo stress ossidativo indotto da UVB o H2O2-, gli effetti di idratazione eantimelanogenesiattività che utilizzano cheratinociti umani (HaCaT) e cellule di melanoma (B16F10). Q-3-G ha down-regolato l'espressione del gene pro-infiammatorio e delle citochine come la ciclossigenasi-2 (COX-2) e il fattore di necrosi tumorale (TNF)- in H O o UVB- cellule HaCaT irradiate. Abbiamo anche dimostrato che gli O-3-Gexhibits hanno un effetto antiossidante utilizzando saggi di scavenging dei radicali liberi, citometria a flusso e un'aumentata espressione del fattore nucleare eritroide 2- correlato al fattore 2 (Nrf2). Q-3-G ha ridotto la produzione di melanina nelle cellule B16F10 indotte dall'ormone stimolante i melanociti (-MSH). Gli effetti e i meccanismi di idratazione del Q-3-G sono stati esaminati valutando i geni correlati al fattore idratante, come la transglutaminasi-1(TGM-1), la filaggrina (FLG) e l'acido ialuronico sintasi (HAS)-1. Inoltre, Q-3-G ha aumentato la fosforilazione di c-Jun, Jun N-terminal chinasi (JNK), protein chinasi attivata da mitogeno (MAPK) chinasi 4 (MKK4) e TAK1, coinvolti nei MAPKs/AP -1 percorso e la fosforilazione di IkB , IkB chinasi (IKK)- , Akt e Src, coinvolti nel percorso NF-kB. Nel loro insieme, abbiamo dimostrato che la Q-3-G esercita proprietà antinfiammatorie, antiossidanti, idratanti e antimelanogenesi nei cheratinociti umani e nelle cellule di melanoma attraverso le vie NF-kB e AP-1.

Parole chiave: quercetina 3-O- -D-glucuronide; protezione UV; idratante; antimelanogenesi; AP-1; NF-kB

1. Introduzione

La pelle, l'organo più grande del corpo, offre una barriera che svolge un ruolo importante nella protezione del corpo dall'ambiente esterno e da fattori dannosi come le radiazioni ultraviolette, i microbi infettivi e le sostanze chimiche nocive. Questa barriera regola anche l'equilibrio elettrolitico e la temperatura del corpo e previene la perdita di umidità [1,2]. La pelle umana è composta da tre strati: l'epidermide, il derma con appendici e il tessuto sottocutaneo [3]. Lo strato epidermico svolge un ruolo importante nel mantenimento della temperatura corporea.

I cheratinociti, il componente abbondante nell'epidermide cutanea, interagiscono strettamente tra loro attraverso desmosomi e giunzioni strette che consentono un'efficace barriera fisico-chimica[4]. Sebbene la pelle funzioni come una barriera protettiva, le radiazioni ultraviolette (UV) hanno un effetto significativo sulla maggior parte delle cellule, compresi i cheratinociti, lo strato esterno della pelle. Le radiazioni UV possono causare invecchiamento della pelle, danni alla pelle, rughe e iperpigmentazione, che è considerato uno dei fattori di rischio più censurabili [5]. La luce UV è composta da tre gamme di lunghezze d'onda: UVA(320-400 nm), UVB (280-320 nm) e UVC (200-280 nm). Oltre al perossido di idrogeno (H2O2), noto per contribuire allo stress ossidativo, gli UVB possono portare alla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) attraverso l'attivazione di enzimi generatori di ROS [6]. È stato descritto che l'accumulo incontrollato di ROS nelle cellule, inclusi i cheratinociti, causa modificazioni ossidative di lipidi, proteine, acidi nucleici e altre molecole intracellulari che successivamente portano a vari tipi di danni alla pelle e processi legati all'invecchiamento come morte cellulare, stress ossidativo, e infiammazione [7,8]. Inoltre, è noto che la risposta allo stress ossidativo influenza il danno di vari componenti cellulari [9]. Le cellule della pelle danneggiate possono anche portare a risposte infiammatorie, con conseguente danneggiamento cronico della pelle [10]. Un tipo di danno cutaneo mediato da UVB o H2O2-attraverso processi biologici è l'espressione di geni infiammatori come la ciclossigenasi-2 (COX-2) e le citochine pro-infiammatorie [11]. Pertanto, lo sviluppo di effetti protettivi per la pelle più sicuri, più robusti ed efficienti è essenziale per prevenire e bloccare le malattie associate ai danni cutanei mediati da UVB o H2O2.

Anche l'idratazione della pelle svolge un ruolo importante nel mantenimento della sua normale funzione. In particolare, lo strato corneo (SC) ha un effetto protettivo contro la perdita di acqua [12]. Il contenuto d'acqua dello strato corneo partecipa alla desquamazione cutanea e alla corretta maturazione, mentre l'insufficienza d'acqua nella SC favorisce l'accumulo e la disfunzione dei corneociti [12,13]. Nelle fasi finali della differenziazione dei cheratinociti, la sua membrana plasmatica e gli organelli cellulari scompaiono, quindi l'afflusso di calcio induce la transglutaminasi (TGM) per la reticolazione con altre proteine. Una carenza o una perdita di TGM-1 porta a una reticolazione difettosa dell'involucro cellulare. L'ittiosi lamellare è un esempio di malattia causata da una perdita di MGT-1. Inoltre, la filaggrina (FLG), la matrice di cheratina formata, svolge un ruolo nella formazione di SC in quanto funge da impalcatura per legare proteine ​​​​e lipidi dell'involucro cornificato [14] catalizzando reazioni di reticolazione della g-glutamil lisina, ATGM e membrana -enzimi associati, conferendo integrità alle SC [15]. Inoltre, l'acido ialuronico (HA) è un tipo di fattore di idratazione naturale (NMF) coinvolto nella ritenzione di umidità nella pelle e mostra un profilo distinto nell'invecchiamento cutaneo intrinseco, è un agente di rilascio del farmaco ed è un componente importante della matrice extracellulare [16,17]. L'HA svolge un ruolo nell'aumentare l'idratazione della pelle regolando i geni dell'acido ialuronico sintasi (HAS); inoltre, l'acido retinoico (vitamina A) può regolare efficacemente l'HA nell'epidermide [17]. TGM-1, FLG e HAS-12,3 sono geni associati alla produzione di NMF [18]. Inoltre, l'attivazione di fattori di trascrizione come la proteina attivatore-1(AP-1) e il fattore nucleare (NF)-kB sono coinvolti nella produzione di sostanze pro-infiammatorie che ottimizzano la barriera cutanea e l'idratazione cutanea attraverso i percorsi AP-1 e NF-kB[19]. Gli enzimi di segnalazione a monte nella via AP-1 includono le protein chinasi attivate da mitogeni (MAPK) come la c-Jun N-terminal chinasi (JNK), la chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK) e p38, mentre Src, Akt, IkB -kinase (IKKo/ ) e KBO(IkBa) appartengono al percorso NF-KB [20. La pelle produce anche melanina nello strato epidermico, specialmente nei melanociti, la principale fonte di melanina, che contribuiscono alla determinazione del colore della pelle e della melanogenesi [21]. L'irradiazione UVB e l'ormone stimolante i melanociti (o-MSH) possono stimolare la secrezione di melanina, innescando così la melanogenesi [22. Durante la melanogenesi, -MSH attiva la proteina chinasi A (PKA), il fattore di trascrizione associato alla microftalmia proteica (MITF) e il legame dell'elemento di risposta del cAMP (CREB)[23]. Una delle funzioni della melanina è considerata la prevenzione dei danni alla pelle causati dai raggi UV, compresa la luce solare. Tuttavia, l'eccessiva produzione di melanina o l'assenza di contenuto di melanina causata dall'invecchiamento, dall'ormone stimolante i melanociti e dall'esposizione ai raggi UV promuove lentiggini, melasma, lentiggini senili e altri disturbi di iper/ipopigmentazione che potrebbero avere un impatto negativo sull'aspetto e sulla pelle salute [24]. Pertanto, si desidera anche controllare la melanogenesi per mantenere sia la salute che l'aspetto estetico del corpo umano.

Quercetinaè un flavonoide di tipo flavonolico allocato predominante presente in verdure, frutta, bevande e piante medicinali [25]. Di conseguenza, la quercetina è stata ampiamente studiata per possedere benefici farmacologici tra cui antinfiammatorio, antiaterosclerotico,antiossidante, proprietà antitumorali e protettive della pelle ed è correlato alla melanogenesi [24,26-29]. Tuttavia, diversi lavori che utilizzano metodi sensibili e affidabili hanno dimostrato che la quercetina non è stata rilevata nel plasma [30-33] e si trova a malapena nel cervello [34,35]. La quercetina, che generalmente si presenta sotto forma di glicoside, è ben assorbita e per lo più idrolizzata e metabolizzata nell'intestino tenue, nel colon, nel fegato e nei reni in metaboliti coniugati [30,36-38]. Nel sangue circolante vengono rilevati solo i metaboliti coniugati come il glucuronide o il solfato (metilato o non metilato, rispettivamente), piuttosto che la quercetina aglicone oi suoi glicosidi. 3/-metil-quercetina-3-glucuronide, quercetina-3-glucuronide e quercetina-3'-solfato sono stati identificati come principali metaboliti plasmatici dopo 1,5 ore dal consumo di cipolle fritte[30, 32]. Questi metaboliti della quercetina sono formati nell'intestino tenue e nel fegato da enzimi di biotrasformazione comprese le UDP-glucuroniltransferasi come risultato del metabolismo di fase II [29,39,40]. È stato anche riportato che i metaboliti coniugati della quercetina si accumulano nel plasma umano nell'intervallo di concentrazione da 10-" a 10- gradi M dopo l'ingestione periodica di cipolle durante i pasti per 1 settimana[41]. L'emivita dei metaboliti della quercetina è piuttosto alta, da circa 11 a 28 ore [29]. Poiché questi composti sono stati osservati come le principali forme di metaboliti coniugati della quercetina, sarebbero essenziali studi incentrati sull'attività biologica dei flavonoli che utilizzano questi metaboliti coniugati, il che ci ha spinto a studiare l'attività biologica di uno dei metaboliti coniugati della quercetina. Uno dei metaboliti più abbondanti del glucuronide che si trova principalmente nel plasma e nei tessuti, inclusi fegato, reni e cervello è la quercetina 3-O- -D-glucuronide(Q-3-G)(Figura 1) [31,35,40,42,43], che possono generare attività simili, più forti o più deboli rispetto ai composti progenitori in modelli diversi. Q-3-G viene trasportato ai tessuti bersaglio attraverso il plasma per esercitare la sua attività biologica [39]. O-3-G ha anche dimostrato di essere un metabolita efficace nel plasma di ratto dopo somministrazione orale di quercetina [43]. In altri studi, è stato riscontrato che il metabolita contenente Q-3-G si accumula nell'aorta dopo la somministrazione di cibo ricco di quercetina ed è stato identificato come un principio attivo rilevato nel sangue umano che varia da 0.{{48} } μM【44】. Inoltre, la Q-3-G si trova nel vino [45] e nelle piante medicinali come Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis e fagiolini [46-49].Q-3-G è stato descritto come un componente antinfiammatorio in condizioni stimolate da LPS e ha mostrato proprietà antiossidanti nel plasma sanguigno [50-52]. Tuttavia, rispetto alla lunga storia di applicazione e all'ampio studio della quercetina, resta da esplorare lo studio di Q{57}}G. Pertanto, Q-3-G è stato scelto come rappresentante dei metaboliti della quercetina come attore attivo in vivo della quercetina. Inoltre, anche il ruolo della Q-3-G sugli effetti protettivi della pelle non è stato ancora del tutto chiarito. In questo studio, utilizzando varie valutazioni in vitro, abbiamo studiato gli effetti protettivi della pelle di Q-3-G contro lo stress ossidativo e l'infiammazione indotti da UVBor H2O2-, l'idratazione della pelle in HaCaT (una linea cellulare di cheratinociti umani) cellule e attività antimelanogenesi nelle cellule B16F10 (una linea cellulare di melanoma murino).

2. Risultato

2.1.Effetti antinfiammatori e antiossidanti di Q-3-G contro UVB o H2O{5}}cellule HaCaT stimolate

Il tessuto cutaneo può essere danneggiato dai raggi UV. Le radiazioni UV attivano diversi fattori dannosi, tra cui lo stress ossidativo, la morte cellulare apoptotica, l'infiammazione e l'invecchiamento cutaneo. Per determinare le attività di protezione UV di Q-3-G, inizialmente abbiamo valutato se Q-3-G ha effetti sulla vitalità cellulare dei cheratinociti umani. Utilizzando un saggio 3-(4-5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil{7}} tetrazolio bromuro (MTT), abbiamo studiato gli effetti citotossici di O-3-G nelle cellule HaCa. Come mostrato nella Figura 2a, non vi era alcuna interferenza significativa sulla vitalità cellulare a una concentrazione di 2.5-20 uM da parte di Q-3-G, che indicava che O-3-G non mostrava citotossicità fino a 20 μM e non ha danneggiato i cheratinociti, lo strato superficiale delle cellule della pelle. Successivamente, abbiamo valutato gli effetti protettivi della pelle del Q-3-G nelle cellule HaCaT esposte ai raggi UVB. Dopo l'irradiazione UVB a 30 mJ/cm², Q-3-G ha protetto in modo significativo le cellule HaCaT dalla morte cellulare indotta da UVB in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 2b). In accordo con il test MTT, utilizzando una fotocamera collegata a un microscopio per catturare la morfologia delle cellule HaCaT, Q-3-G ha protetto dalla morte cellulare dovuta alle cellule HaCaT irradiate con UVB fino a una concentrazione di 10 μM (Figura 2c) . Il numero di cellule HaCaT in ciascuna condizione era 482 per il gruppo non trattato, 91 per il gruppo UVB 30 mJ/cm, 276 per il gruppo UVB 30 mJ/cm²più 5μM O-3-G e 320 per il gruppo UVB 30 mJ/cm² più 10μM Q-3-G gruppo (Figura 2d). Questi risultati hanno confermato che il Q-3-G inibisce il danno HaCaT indotto dai raggi UVB e salva l'effetto protettivo della pelle dall'irradiazione UVB.

Il verificarsi e l'esacerbazione dell'infiammazione nel corpo attivano occasionalmente i macrofagi e rilasciano alcune citochine. L'infiammazione è un segno distintivo dello stress ossidativo. Abbiamo studiato l'effetto antinfiammatorio di Q-3-G contro l'infiammazione indotta da UVB o HO2-. È noto che gli UVB possono promuovere danni al DNA e infiammazioni nelle cellule della pelle 【10】. Abbiamo irradiato le cellule HaCaT con UVB 30 mJ/cm² e incubato le cellule HaCaT con H2O2 (500 uM). Abbiamo impiegato un test PCR in tempo reale per controllare l'espressione dell'mRNA dell'enzima infiammatorio COX-2 e della citochina pro-infiammatoria TNF-. Come mostrato dai risultati nella Figura 2e,f, una concentrazione di 10 μM di O-3-G ha inibito significativamente l'espressione di mRNA di COX-2 e TNF- . Di conseguenza, Q-3-G ha soppresso le risposte infiammatorie indotte nelle cellule HaCaT dopo l'esposizione all'irradiazione UVB o H2O2.

Abbiamo utilizzato 2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico)(ABTS) e 2,{7}}difenil-lpicrylidrazyl(DPPH) saggi di scavenging radicalico, sistemi modello ampiamente utilizzati per studiare le attività di scavenging in vitro di composti naturali, per valutare la proprietà antiossidante del Q-3-G a diverse concentrazioni. Le cellule HaCaT sono state trattate con Q-3-G in modo dipendente dalla concentrazione da 2.{14}} μM in presenza di DPPH e il risultato ha mostrato un'attività di scavenging significativa a più di 2,5 uM (Figura 2g) . Il test ABTS ha anche dimostrato in modo significativo gli effetti di Q-3-G sullo scavenging dei radicali liberi in modo dipendente dalla concentrazione con un valore IC50 di 1,75 μM (Figura 2h). L'acido ascorbico （AA）, come controllo positivo, ha mostrato i maggiori effetti antiossidanti sia nei test DPPH che ABTS. Fattore nucleare eritroide 2-fattore 2 correlato (Nrf2), uno dei geni dipendenti dall'elemento di risposta antiossidante (ARE), regola le ossidoreduttasi protettive e i suoi substrati nucleofili, promuovendo così gli enzimi antiossidanti per rimuovere i danni e riparare sistemi [53]. Successivamente, abbiamo esaminato il livello di espressione di Nrf2 nelle cellule HaCaT irradiate con UVB. Rafforzando i risultati di cui sopra, O-3-G ha migliorato significativamente il livello di espressione di Nrf2 dopo l'irradiazione UVB rispetto al controllo in modo dipendente dalla concentrazione, fino a 10 uM(Figura2i), il che implicava che Q-3- G presenta un effetto antiossidante sia chimicamente che biologicamente con una proprietà di scavenging dei radicali liberi e aumenta l'effetto protettivo della segnalazione ARE Nrf2-dipendente, rispettivamente. Inoltre, abbiamo anche eseguito la citometria a flusso ROS utilizzando diclorodiidrofluoresceina diacetato (DCFDA) nella condizione UV. L'antiossidante è ampiamente noto per sopprimere i fattori di stress cellulare inibendo la produzione di ROS [54]. Il risultato ha mostrato che il trattamento con Q-3-G a concentrazioni di 5 e 10 μM ha ridotto il livello di ROS indotto da UVB (Figura 2j). Presi insieme, questi dati implicavano che Q-3-Gexerts proprietà protettive della pelle come effetti antinfiammatori e antiossidanti contro H2O o stress ossidativo indotto da UVB e infiammazione nelle cellule HaCaT.

2.2. Effetto antimelanogenesi in B16F10 ed effetto idratante nelle cellule HaCaT di Q-3-G

Per esaminare gli effetti di O{0}}G sulla melanogenesi, le cellule di melanoma sono state trattate con -MSH per 48 ore per secernere melanina nelle cellule B16F10. Impiegando i saggi MTT, abbiamo prima confermato che Q-3-G non aveva citotossicità nelle cellule B16F10 a concentrazioni fino a 20 μM per 48 ore (Figura 3a). Questo risultato ha mostrato, per le successive valutazioni, che gli effetti di O-3-G in B16F10 non erano dovuti alla morte cellulare. Successivamente, abbiamo valutato B16F10 con Q-3-Gand -MSH per 48 ore per determinare gli effetti di Q-3-G sulla melanogenesi. Come mostrato nella Figura 3b, Q-3-G ha inibito significativamente la secrezione di melanina. Il controllo positivo arbutina ha anche ridotto significativamente la secrezione di melanina.

La molecola correlata all'idratazione della pelle è l'acido ialuronico (HA). Come accennato in precedenza, l'HA, distribuito nell'epidermide e nel derma, è un NMF che migliora l'idratazione della pelle [55]. Abbiamo utilizzato un test PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) per esaminare il livello di trascrizione di HAS-1 dopo 12 ore con una concentrazione di Q-3-G fino a 30 uM. HAS promuove l'accumulo di HA di dimensioni intermedie all'interno dei cheratinociti [12]. Come mostrato nella Figura 3c, l'espressione di HAS-1 è stata aumentata dal trattamento con Q-3-G fino a 10 μM. Oltre al fattore idratante, abbiamo anche esaminato l'espressione di FLG e TGM{{ 13}}. Abbiamo usato il retinolo come gruppo di controllo positivo. I livelli di trascrizione di FLG e TGM-1 sono aumentati notevolmente dopo il trattamento con Q-3-G a concentrazioni fino a 10 μM (Figura 3d). Questi risultati suggeriscono che il Q-3-G ha un'attività idratante della pelle nelle cellule HaCaT. Inoltre, utilizzando SB203580 (inibitore di p38), SP600125 (inibitore di JNK), UO126 (inibitore di ERK) e Bay11-7082 (inibitore di NF-kB), abbiamo esaminato il coinvolgimento delle vie di segnalazione MAPK e NF-kB nell'idratazione fattore di cellule HaCaT trattate con Q-3-G. Sulla base dell'espressione genica indotta da O-3-G, entrambi i livelli di TGM-1 e FLG sono stati ridotti dal trattamento con SP600125, un inibitore di JNK (Figura 3e), suggerendo che è necessario JNK per aumentare l'espressione di TGM-1 e FLG in termini di effetto idratante sulla pelle di O-3-G. Inoltre, l'espressione di FLG è stata ridotta anche da Bay11-7082, un inibitore di IKK e IkB , suggerendo che anche il meccanismo farmaceutico di Q-3-G potrebbe appartenere alla via di segnalazione NF-kB.

2.3. Vie di segnalazione relative all'idratazione di Q-3-G tramite l'attivazione di AP-1 e NF-kB

Sulla base dei precedenti risultati dell'mRNA, abbiamo ipotizzato che il coinvolgimento della segnalazione di AP-1 e NF-kB sull'effetto di idratazione di Q-3-G possa verificarsi anche nei livelli proteici. Utilizzando un test Western blot, abbiamo esaminato la fosforilazione delle molecole a monte di AP-1 e NF-kB. Innanzitutto, nel percorso AP-1, la fosforilazione di c-Jun è stata aumentata dopo l'incubazione delle cellule HaCaT con Q-3-G per 24 ore (Figura 4a). Il livello di p-INK è stato aumentato anche dopo il trattamento con Q-3-G a concentrazioni di 2,5,5 e 10 μM. La forma totale di JNK è rimasta invariata (Figura 4b). Abbiamo ulteriormente esaminato la fosforilazione di MKK4 e TAK-1, che sono regolatori a monte di JNK. Come mostrato nella Figura 3c, dopo il trattamento delle cellule HaCaT con O-3-G, anche i livelli proteici di p-MKK4 e p-TAK1 erano sovraregolati.

Oltre alla segnalazione NF-kB, Q-3-G ha aumentato la fosforilazione di p50 e p65, una subunità di NF-kB (Figura 4c). Inoltre, abbiamo valutato l'attivazione di IKK e IkBa, anch'esse aumentate di Q-3-G fino a 10 uM rispetto al gruppo di controllo (Figura 4d). Alla fine, abbiamo determinato l'attivazione di molecole a monte coinvolte nella via di segnalazione NF-kB. La fosforilazione di Src e Akt (Ser473) è stata migliorata dal trattamento con O-3-G (Figura 4e). Nel complesso, questi dati indicano che gli effetti di protezione della pelle di Q-3-G mirano all'attivazione di TAK1 e Src aumentando il livello di proteine, sovraregolando così l'attività di AP-1 e NF-kB, rispettivamente.

2.4.Effetti di Q-3-G sull'attivazione trascrizionale di AP-1 e NF-kB

Abbiamo studiato la citotossicità cellulare di Q-3-G nelle cellule HEK293T della linea cellulare renale embrionale umana mediante un test MTT (Figura 4f). La vitalità delle cellule HEK293T non è stata significativamente influenzata dopo il trattamento con Q-3-G（2.{6}} μM） rispetto alle cellule non trattate.

Abbiamo impiegato un test della luciferasi per determinare se Q-3-G potesse modulare i test del promotore NF-kB e AP-1. Abbiamo confermato che O-3-G ha aumentato l'attività della luciferasi mediata da AP-1- (Figura 4g) e l'attività della luciferasi mediata da NF-kB (Figura 4h) in modo dipendente dalla concentrazione. Questi risultati confermano che l'attivazione di AP-1 e l'attivazione di NF-KB sono importanti bersagli farmacologici di Q-3-G.

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