PARTE 1 Effetti antiossidanti e anticoagulanti dei glicosidi fenilpropanoidi isolati dal succiamele (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria e P. Ramosa)
Mar 06, 2022
Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,
Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*
a Università di Ło´d´z, Dipartimento di Biochimica Generale, Facoltà di Biologia e Protezione Ambientale, 90-236 Ł´od´z, Polonia
b Dipartimento di biochimica e qualità delle colture, Istituto di scienza del suolo e coltivazione delle piante, Istituto statale di ricerca, 24-100 Puławy, Polonia
Center for Research and Conservation of Biodiversity, Department of Environmental Biology, Institute of Biology, Jan Kochanowski University, 25-406 Kielce, Polonia
Astratto
Piante oloparassitarie delle Orobanchaceae, tra cuiCistanche, Orobanche e Phelipanche spp, sono noti per la loro ricchezza di glicosidi fenilpropanoidi (PPG). È stato scoperto che molti composti PPG possiedono un ampio spettro di attività, come antimicrobico, antinfiammatorio, antiossidante e potenziamento della memoria. Per esplorare meglio il potenziale di bioattività del succiamele europeo (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) e di dieci singoli costituenti fenilpropanoidi isolati, abbiamo studiato la loro azione antiradicalica, l'effetto protettivo contro l'ossidazione nel sistema plasma in vitro e influenza sui parametri della coagulazione. Gli estratti testati hanno mostrato un'attività di scavenging del 50-70 percento della potenza di Trolox. L'estratto OC, ricco diacteoside, aveva un potenziale antiradicalico migliore di oltre il 20% rispetto all'estratto di PR che era l'unico contenente PPG privo di una parte catecola dell'anello B nell'unità acilica. Inoltre, è stato riscontrato che solo otto PPG testati hanno dimostrato un potenziale antiossidante nel plasma umano trattato con H2O2/Fe; tuttavia, i tre PPG testati possedevano un potenziale anticoagulante oltre alle proprietà antiossidanti. Sembra che la struttura dei PPG, in particolare la presenza di gruppi acilici e catecolici, sia principalmente correlata alle loro proprietà antiossidanti. Il potenziale anticoagulante di questi composti è anche correlato alla loro struttura chimica. I PPG selezionati mostrano il potenziale per il trattamento di malattie cardiovascolari associate allo stress ossidativo.
Per maggiori informazioni si prega di contattare:Joanna.jia@wecistanche.com
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1. Introduzione
Lo stress ossidativo è ampiamente noto per il suo impatto negativo sulla salute degli organismi viventi, compreso l'invecchiamento accelerato e alcuni tipi di cancro. Il verificarsi di stress ossidativo è associato a un equilibrio disturbato tra i meccanismi ossidativi e antiossidanti (inclusa la difesa enzimatica (catalasi, glutatione perossidasi) e non enzimatica (glutatione) nelle cellule del corpo [1]. La sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), compresi i radicali ossidanti e le specie a guscio chiuso, è uno dei principali meccanismi alla base della formazione dello stress ossidativo. Tuttavia, l'effetto biologico causato dai ROS dipende in gran parte dalla concentrazione, dal tempo di esposizione e dalla posizione. In condizioni normali (bassa concentrazione), i radicali ossigeno/azoto possono svolgere il ruolo di messaggeri secondari, ma a un livello superiore possono iniziare a reagire con strutture biologiche, come le membrane cellulari [2]. Tra tutte le specie di ROS, un radicale idrossile (HO.) sta causando uno dei maggiori danni alle biomacromolecole: proteine, lipidi e DNA. Lo stress ossidativo è noto per svolgere un ruolo importante in una serie di malattie, comprese quelle cardiovascolari. Disturbi del sistema sanguigno sono stati correlati e/o preceduti da cambiamenti in vari parametri dell'emostasi e biomarcatori plasmatici [1,3].
D'altra parte, molte sostanze naturali, come i polifenoli e gli acidi grassi polinsaturi, sono state identificate come potenti antiossidanti in grado di prevenire la formazione e/o la diminuzione di specie reattive dell'ossigeno. Composti con tali proprietà si trovano in molti prodotti alimentari e preparati farmaceutici di origine vegetale. Una dieta arricchita con frutta e verdura fresca, e terapie antiossidanti a base di antiossidanti naturali, sono quindi ampiamente consigliate in quanto possono ridurre il livello di stress ossidativo e prevenire vari processi fisiopatologici [4,5]. I polifenoli vegetali sono un gruppo eterogeneo di metaboliti secondari, tra i quali gli acidi fenolici occupano un posto importante, poiché sono ampiamente distribuiti e mostrano una varietà di effetti biologici, come antimicrobici, antiossidanti e antinfiammatori. I glicosidi fenilpropanoidi (PPG) sono esteri derivati dell'acido idrossicinnamico e sono la principale/unica classe di metaboliti secondari presenti nelle piante oloparassita delle Orobanchaceae, compreseCistanche, Orobanche e Phelipanche spp. Diverse specie di questa famiglia sono seri parassiti delle colture di cui gli agricoltori vogliono sbarazzarsi nei campi (esempio di Phelipanche ramosa), poche sono utilizzate in farmacologia, mentre la maggior parte sono di scarsa importanza per l'uomo. ErbaCistancheè ampiamente utilizzato nella medicina tradizionale asiatica nel trattamento della carenza renale e come agente di potenziamento dell'immunità e della memoria, anti-invecchiamento e antifatica [6]. Analisi fitochimiche di vari gruppi di ricerca hanno dimostrato che i glicosidi fenilpropanoidi, come acetonide, echinacoside e lato del podio, sono uno dei principali ingredienti attivi di Herba Cistanche [7]. Un recente studio su diverse specie di succiamele trovate in Polonia da Jedrejek et al. [8] ha dimostrato che questo materiale vegetale ha una composizione qualitativa simile (dominio dei PPG), inoltre è uguale o addirittura superiore alCistanchespp. in termini di contenuto di sostanze attive [8].
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Il presente studio era volto a valutare il potenziale antiradicalico e antiossidante, nonché l'influenza sui parametri emostatici dei tre estratti di succiamele (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA e P. ramosa – PR) ricchi di vari fenili -
prostanoidi, così come i loro singoli costituenti PPG. La capacità antiradicalica è stata misurata utilizzando 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolino{4}}acido solfonico/Trolox equivalente (ABTS/TE) e 2,2-difenil-1-picrylhybrazil (DPPH ) prove. Lo stress ossidativo nel sistema di test al plasma è stato indotto utilizzando un radicale idrossile (H2O2/Fe), quindi sono stati misurati la perossidazione lipidica (saggio delle specie reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS)) e il livello dei gruppi proteici carbonile e tiolo. Tra i parametri determinati dell'emostasi c'erano: tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT), tempo di protrombina (PT) e tempo di trombina (TT).
2. Materiali e metodi
2.1. Sostanze chimiche
Radicale 2,2-difenil{2}}picrylidrazil (DPPH), acido 2,2′-azinobis-3-et-ilbenztiazolina{8}}solfonico (ABTS), persolfato di potassio, {{9 }}idrossi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acido carbossilico (Trolox), dimetilsolfossido (DMSO), acido tiobarbiturico (TBA), acido formico (grado LC-MS), e H2O2 sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA). Metanolo (grado gradiente HPLC) e acetonitrile (grado LC-MS) sono stati acquisiti da Merck (Darmstadt, Germania). dieci fenil-
composti propanoici testati in questo lavoro, tra cui 2′-O-acetilacteoside (97 percento), 2′-O-acetilpoliumoside (98 percento), 3- O-metilpoliumoside (96 percento), acetonide (99 percento), arena inside (97 percento), crenatoside (98 percento), teniposide (99 percento), poliumoside (99 percento), tubuloside A (96 percento) e wiedemaannioside D (96 percento) sono stati precedentemente isolati da noi da materiale vegetale sotto indicato [ 8]. La purezza dei composti è stata valutata utilizzando un'analisi UHPLC-PDA-MS. L'acqua ultrapura è stata preparata internamente utilizzando un sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q (Millipore Co.). Altri reagenti erano di grado analitico e venivano forniti da fornitori commerciali nazionali.
2.2. Materiale vegetale
Le piante da fiore di tre specie di succiamele, tra cui Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel e P. Ramos (L.) Pomel sono state identificate dal prof. Renata Piwowarczyk (Università Jan Kochanowski, Kielce, Polonia) e raccolti da una fonte naturale in Polonia.
Esemplari voucher (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), praterie xerotermiche, parassita Galium boreale, maggio 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), praterie psammomale e maggese, parassita Artemisia campestris, giugno 2014;
P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), campo, parassita Solanum Lycopersicum, settembre 2014) sono depositati presso l'Erbario dell'Università Jan Kochanowski di Kielce (KTC). Il materiale vegetale è stato liofilizzato e finemente macinato prima dell'estrazione.
2.3. Preparazione degli estratti di succiamele
Il materiale vegetale in polvere (O. Caryophyllaceae (OC) - 2 g, P. Arenaria (PA) - 3 g e P. ramosa (PR) - 3 g) è stato estratto con l'80% di MeOH a 40 ◦C e 1500 psi (pressione del solvente ) utilizzando un ASE 200 accelerato
estrattore di solventi (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). Gli estratti sono stati evaporati e liofilizzati (liofilizzatore Gamma 2–16 LSC, Christ, Germania). L'efficienza di estrazione per OC, PA e PR era rispettivamente del 55%, 37% e 43% in peso del materiale vegetale. A causa dell'alto contenuto di carboidrati (dati non mostrati), gli estratti grezzi sono stati ulteriormente purificati mediante estrazione in fase solida (SPE) su microcolonna Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Gli zuccheri sono stati rimossi con 1% di MeOH, quindi i composti di interesse sono stati eluiti con 80% di MeOH. Dopo aver rimosso il solvente, gli estratti OC, PA e PR sono stati liofilizzati (liofilizzatore Gamma 2–16 LSC) e le rese della purificazione SPE erano del 53% (OC), 67% (PA) e 51% (PR) .
2.4. Caratteristiche fitochimiche degli estratti di succiamele
Le analisi qualitative e quantitative degli estratti di succiamele sono state eseguite utilizzando un sistema ACQUITY UPLC (Waters) collegato a un rilevatore di array di fotodiodi (PDA) e uno spettrometro di massa a quadrupolo tandem (TQD-MS/MS). Gli estratti liofilizzati di OC, PA e PR sono stati sciolti in 50 percento di metanolo a una concentrazione di 0,50 mg/mL e quindi
cromatografato su colonna BEH C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters). Le condizioni cromatografiche erano le seguenti: temperatura del forno – 25 ◦C,
gradiente lineare 10→25 percento di fase mobile B (0.1 percento di acido formico in acetonitrile) nella fase mobile A (0.1 percento di acido formico in H2O) oltre 12 min, portata – 0,4 mL/min, volume di iniezione – 2 μL, intervallo UV – 190–490 nm (risoluzione 3,6 nm). L'analisi MS è stata eseguita in modalità a ioni negativi con ionizzazione elettrospray (ESI), utilizzando le seguenti impostazioni: intervallo di scansione 100–1200 m/z; tensione capillare 2,8 kV; tensione del cono 35 V;
temperatura sorgente 150 ◦C; temperatura di desolvatazione 450 ◦C; desolvatazione
flusso di gas 900 L/h e flusso di gas conico 100 L/h. L'acquisizione e l'elaborazione dei dati sono state eseguite utilizzando il software Waters MassLynx 4.1.
I picchi del glicoside fenilpropanoide (PPG) sono stati identificati confrontando i dati LC-MS ottenuti con quelli di composti precedentemente isolati [8]. La quantificazione dei PPG negli estratti di succiamele era basata sul metodo UPLC-UV con rilevamento a 330 nm e una calibrazione standard esterna utilizzandoacteoside(Sigma-Aldrich, 99 percento, HPLC) come
norma di gruppo. È stata preparata una curva di calibrazione lineare in sei concentrazioni nell'intervallo 1–200 ug/mL e ha mostrato una buona linearità (R2
0.999). I risultati quantitativi rappresentano il valore medio SD di tre iniezioni e sono stati espressi in milligrammiacteosideequivalenti (eq) per grammo di estratto (mgacteosideeq/g).
2.5. Attività antiradicalica in vitro
2.5.1. Saggio di scavenging radicale ABTS
Il test antiradicalico ABTS è stato effettuato utilizzando il metodo descritto da Kontek et al. [9], con lievi modifiche come segue: il 20% di MeOH è stato utilizzato per preparare i reagenti (7 mM ABTS e 4,9 mM di potassio per-
solfato); le soluzioni di estratti di OC, PA e PR, a quattro livelli di concentrazione nell'intervallo 100-400 ug/mL, e le soluzioni di Trolox, a sei livelli di concentrazione nell'intervallo di 10 250 ug/mL, sono state preparate con 50 percento MeOH. La proporzione del campione rispetto alla soluzione di lavoro ABTS era 1:25 (v/v). L'assorbanza a 734 nm è stata misurata dopo 30 minuti di incubazione
al buio utilizzando uno spettrofotometro UV–vis (Evolution 260 Bio,
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).
L'inibizione dell'assorbanza (percentuale) è stata calcolata come segue: [(Absecon-
trol–Absample)/Abscontrol] ×100.
Sono stati calcolati gli equivalenti di Trolox (TE) degli estratti di succiamele
utilizzando la formula TE=mcampione/mstandard, dove m è la pendenza del rettilineo
curve di linea (inibizione dell'assorbanza vs. concentrazione). Il valore TE di
l'esempio descrive la sua attività normalizzata contro Trolox (TEstandard =
1.0). I valori IC50 per gli estratti OC, PA e PR e Trolox erano
raggiunte sperimentalmente, quindi sono state calcolate dalla loro retta
curve (inibizione dell'assorbanza vs. concentrazione) e sono espresse in
ug/ml.
Il test è stato eseguito in triplicato e i risultati sono presentati
come mezzi ± deviazioni standard (SD).
2.5.2. Saggio di scavenging dei radicali DPPH
Il test antiradicalico DPPH è stato effettuato utilizzando il metodo descritto da Jedrejek et al. [8] e Brand-Williams et al. [10], con lievi modifiche come segue: le soluzioni di estratti OC, PA e PR, a quattro livelli di concentrazione nell'intervallo 50▽ 250 ug/mL, e le soluzioni di Trolox, a sei livelli di concentrazione nell'intervallo 10▽ 250 ug/mL, sono stati preparati con il 50 percento di MeOH. La proporzione del campione rispetto a DPPH era 1:19 (v/v). L'assorbanza a 517 nm è stata misurata dopo 30 minuti di incubazione al buio utilizzando uno spettrofotometro UV-vis (Evolution 260 Bio). L'inibizione dell'assorbanza (percentuale) è stata calcolata come segue: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. I valori Trolox Equivalent (TE) e IC50 dei campioni di prova sono stati calcolati allo stesso modo del test ABTS (Sezione 2.5.1). Il test è stato eseguito in triplicato e i risultati sono presentati come medie ± DS.
2.6. Soluzioni stock di composti vegetali testati ed estratti per esperimenti con plasma umano
Le soluzioni madre dei composti testati e degli estratti vegetali sono state preparate al 50 percento di DMSO. La concentrazione finale di DMSO nei campioni testati era inferiore allo 0,05% e i suoi effetti sono stati determinati in tutti gli esperimenti.
2.7. Isolamento del plasma umano
Il sangue umano, o plasma, è stato ottenuto da sei donatori regolari (uomini e donne non fumatori) a una banca del sangue (Lodz, Polonia) e un centro medico (Lodz, Polonia). Il sangue è stato raccolto come soluzione CPD (citrato/fosfato/destrosio; 9:1; sangue v/v/CPD) o soluzione CPDA (citrato/fosfato/destrosio/adenina; 8,5:1; v/v; sangue/CPDA). I donatori non avevano assunto farmaci o sostanze che creano dipendenza (inclusi tabacco, alcol e integratori di antiossidanti) per almeno due settimane prima di una donazione. La nostra analisi dei campioni di sangue è stata eseguita secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki per la ricerca umana e approvata dal Comitato per l'etica della ricerca nella sperimentazione umana dell'Università di Lodz. Il plasma è stato preparato mediante centrifugazione di sangue umano fresco a 4500 x g per 25 minuti a temperatura ambiente. La concentrazione proteica è stata calcolata misurando l'assorbanza dei campioni testati a 280 nm, secondo la procedura di Whitaker e Granum [11].
2.8. Marcatori di stress ossidativo nel plasma umano
2.8.1. Misurazione della perossidazione lipidica
La perossidazione lipidica plasmatica è stata quantificata misurando la concentrazione di sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS). La concentrazione di TBARS è stata calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione molare (ε=156,000 M 1 cm 1 ). Il metodo è descritto in modo più approfondito altrimenti [12,13]. 2.8.2. Misurazione dei gruppi carbonilici Il livello dei gruppi carbonilici è stato calcolato utilizzando il coefficiente di estinzione molare (ε=22,000 M 1 cm 1 ) ed è stato espresso come gruppi carbonilici nmol/mg di proteine plasmatiche, secondo Bartosz [ 13] e Levine et al. [14]. 2.8.3. Determinazione del gruppo tiolo Il contenuto del gruppo tiolo nelle proteine plasmatiche è stato misurato spettrofotometricamente utilizzando un lettore di micropiastre SPECTROstar (BMG LABTECH, Germania) mediante assorbanza a 412 nm con acido 5,5′-ditiolo-bis-({24}} nitrobenzoico). Il metodo è descritto più dettagliatamente altrove [15–17].
2.9. Parametri di emostasi
2.9.1. La misurazione del tempo di protrombina (PT)
Il PT è stato determinato coagulometricamente utilizzando una coagulazione ottica
Le lettere indicano i risultati del test di Tukey (p < 0.05), valori con lo stesso valore
lettera all'interno di una riga non è significativamente diversa.
2.9.2. La misurazione del tempo di trombina (TT)
Il TT è stato determinato coagulometricamente utilizzando un analizzatore di coagulazione ottica (modello K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polonia), secondo il metodo descritto da Malinowska et al. [18].
2.9.3. La misurazione del tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT)
L'APTT è stato determinato coagulometricamente utilizzando un analizzatore di coagulazione ottica K-3002 (Kselmed, Grudziadz, Polonia) secondo Mali now ska et al. [18].
2.10. Analisi dei dati Il test Q-Dixon è stato eseguito per eliminare i dati incerti.
I dati sono stati testati per la distribuzione normale con il test di Shapiro-Wilk e l'uguaglianza della varianza con il test di Levene. Differenze statisticamente significative sono state identificate utilizzando ANOVA, seguito dal test di confronto multiplo di Tukey o dal test di Kruskal-Wallis. I confronti sono stati considerati significativi a p < 0.05.="" i="" valori="" sono="" presentati="" come="" medie="" ±="">
