Xican Li 1,2,*,† ID , Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 e Dongfeng Chen 3,4

Contatto:joanna.jia@wecistanche.com

1 Scuola di Erboristeria Cinese, Università di Medicina Cinese di Guangzhou, Guangzhou 510006, Cina; xieyulu1900@163.com (Y.X.); xiehongxh1@163.com (H.X.); 15622178307@163.com (Q.G.); 15228738137@163.com (P.X.); pandiphd@163.com (Y.M.)

2 Laboratorio di ricerca e sviluppo innovativo di TCM, Università di medicina cinese di Guangzhou,

Guangzhou 510006, Cina

3 Scuola di Scienze Mediche di Base, Università di Medicina Cinese di Guangzhou, Guangzhou 510006, Cina; ys1090992678@163.com (K.L.); chen888@gzucm.edu.cn (D.C.)

4 Il Centro di ricerca di medicina integrativa di base, Università di Medicina cinese di Guangzhou,

Guangzhou 510006, Cina

5 School of Basic Medical Science, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510007, Cina

6 Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, No. 74 Zhongshan Road. 2, Guangzhou 510080, Cina; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 Dipartimento di Istologia ed Embriologia, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Cina;

† Questi autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.

Ricevuto il: 24 gennaio 2018; Accettato: 20 febbraio 2018; Pubblicato: 23 Febbraio 2018

Abstract: Lo studio ha cercato di esplorare il ruolo dei residui di zucchero e i meccanismi del fenolicofenilpropanoideantiossidanti.Acteoside, insieme al suo apioside forsitoside B e rhamnoside

poliumoside, sono stati comparativamente studiati utilizzando vari saggi antiossidanti. In tre saggi basati sul trasferimento di elettroni (ET) (FRAP, CUPRAC, PTIO·-scavenging a pH 4,5), i relativi livelli di antiossidanti sono stati approssimativamente dichiarati comeacteoside>forsitoside B > poliumoside. Tale ordine è stato osservato anche in

Saggio PTIO-scavenging A pH 7,4 e in tre saggi di scavenging radicale a più vie, ovvero ABTS+·-scavenging, DPPH·-scavenging e · Negli spettri UV-vis, ciascuno di essi mostrava uno spostamento verso il rosso a 335 364 nm e due picchi deboli (480 e 719 nm), se mescolati con Fe2+; tuttaviaacteosideha dato l'assorbimento più debole.

Nella cromatografia liquida ultra-performante accoppiata con l'analisi della spettrometria di massa tandem a tempo di volo (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS) a ionizzazione elettrospray accoppiata con l'analisi della spettrometria di massa in tandem a ionizzazione elettrospray (RAF), non è stato trovato alcun picco di formazione di radicali(RAF). Il test MTT ha rivelato che la poliumoside ha mostrato la più alta vitalità delle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo stressato ossidativo. In conclusione,acteoside, il forsitoside B e il poliumoside possono essere coinvolti in molteplici percorsi per esercitare l'azione antiossidante, tra cui ET, H + trasferimento o Fe2 + chelante, ma non RAF. Il trasferimento di ET e H+ può essere ostacolato da frazioni di ramnosile e apiosile; tuttavia, il potenziale chelante di Fe2+ può essere potenziato da due residui di zucchero (in particolare la frazione di ramnosil). L'effetto generale di rhamnosyl e apiosyl moieties è quello di migliorare gli effetti antiossidanti o citoprotettivi.

Parole chiavi:acteoside; apiosile; forsitoside B;fenilpropanoideglicosidi; poliumoside; rhamnosyl

cistanche ha l'effetto di anti-ossidazione

1. Introduzione

Recentemente, acteoside (verbascoside, Figura 1), un fenolicofenilpropanoideglicosideche si verificano nella verbena e in altre piante [1], è stato trovato per migliorare l'efficienza del trasferimento nucleare delle cellule somatiche canine (SCNT) durante il processo di clonazione del cane [2]. Inoltre, l'acteoside potrebbe proteggere le cellule del neuroblastoma umano SH-SY5Y dai danni indotti dall'amiloide α [3] e dai fibroblasti della pelle umana contro i danni indotti dai raggi X [4]. Il suo apioside forsitoside B (Figura 1) è distribuito anche nelle piante [5], ed è stato osservato per esercitare potenti effetti neuroprotettivi con una finestra temporale terapeutica favorevole [6]. Si ritiene che questi effetti benefici su cellule e tessuti siano associati alla protezione di alcune biomolecole, come i lipidi e il DNA. Infatti, l'acteoside e il suo analogo cistanoside F hanno dimostrato di inibire la perossidazione lipidica mitocondriale nei ratti [7]. La perossidazione lipidica è nota per essere il risultato dello stress ossidativo cellulare e, in ultima analisi, delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).

Figura 1. Le strutture (a sinistra) e i modelli a sfera e bastone basati sulla conformazione preferenziale (a destra) di tre naturalifenilpropanoideglicosidi(acteoside, forsitoside B e poliumoside).

Dal punto di vista della protezione del DNA, l'acteoside e i suoi derivati possono riparare rapidamente i radicali del DNA, come la 2'-deossiadenosina-5'-monofosfato (dAMP) e la 2'-deossiguanosina-5'-monofosfato (dGMP) [8]. Questi radicali deossinucleotidici secondari possono danneggiare ulteriormente le cellule ossidativamente portando alla mutagenesi e alla carcinogenesi [9]. Lo studio biofisico ha indicato che l'acteoside e i suoi derivati potrebbero ancorarsi in solchi minori del DNA e riparare rapidamente tale danno ossidativo al DNA [10]. Il modello ball-stick basato sulla conformazione preferenziale propone (Figura 1, a destra) che queste molecole siano prolate e possano facilmente raggiungere il ciclo del DNA e, quindi, siano in grado di riparare rapidamente il danno dei radicali del DNA [8].

Tuttavia, dal punto di vista della biochimica, la riparazione è essenzialmente soddisfatta attraverso un percorso ROS-scavenging (cioè antiossidante). Come accennato in precedenza, la generazione di cationi radicali deossinucleotidici deriva in ultima analisi dall'attacco dei ROS, compresi i radicali liberi (ad esempio, · Radicale OH [11]) e molecole ossidanti (ad esempio, H2O2 [12]). Si ritiene che il ROS-scavenging riduca in modo efficiente lo stato ossidativo cellulare [13,14] e migliori la qualità delle cellule staminali [12,15]. Pertanto, è necessario studiare la loro capacità antiossidante e discutere ulteriormente i possibili meccanismi.

In questo studio, tre fenolicifenilpropanoideglicosidi(acteoside, forsitoside B e poliumoside) sono stati comparativamente studiati utilizzando vari saggi antiossidanti, tra cui il saggio di scavenging del 2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-ossal-3-ossido radicale (PTIO·), il saggio di riduzione del potere antiossidante dello ione ferrico (FRAP), il saggio di riduzione della capacità antiossidante cuprica (CUPRAC), il saggio di 2,2→-azino-bis(radicale dell'acido 3-etilbenzene-tiazolina-6-solfonico (ABTS+·),

Saggio dell'1,1-difenil-2-picril-idrazina (DPPH·) e · Saggio di O2.-scavenging e analisi degli spettri UV Fe2+-chelanti. Successivamente, i loro prodotti di reazione con DPPH· sono stati determinati utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con l'analisi di spettrometria di massa tandem a quadrupolo a ionizzazione elettrospray (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS). Infine, il loro effetto citoprotettivo nei confronti delle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (bmMSCs) è stato stimato utilizzando il

Saggio del 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenile (MTT). Come si vede nella Figura 1, la differenza tra i tre fenolicifenilpropanoideglicosidi(cioè acteoside, forsitoside B e poliumoside) è il tipo di glicoside: il forsitoside B è un apioside di acteoside, mentre il poliumoside è un rhamnoside di acteoside. Pertanto, questo studio comparativo aiuta anche a comprendere i ruoli di apiosyl e rhamnosyl inantiossidanteEffetti.

cistanche effetto sbiancante sulla pelle all'anti-ossidazione

2. Risultati

2.1. Saggi di riduzione dei metalli (FRAP e CUPRAC)

Nello studio, abbiamo effettuato due saggi di riduzione dei metalli, ovvero il test FRAP e il test CUPRAC. Come illustrato nel Suppl. 1, l'acteoside e i suoi derivati hanno aumentato le percentuali relative di FRAP (o potenza riducente Cu2+) a 0-10 βg/L in modo dose-dipendente. Il loro ordine di livelli relativi di riduzione dei metalli è diminuito approssimativamente nell'ordine di acteoside > forsitoside B > poliumoside (Tabella 1).

Tabella 1. I valori IC50 di acteoside, forsitoside B e poliumoside in variantiossidantiSaggi.

2.2. Saggio PTIO·-Scavenging

Il test PTIO·-scavenging è stato recentemente sviluppato dal nostro laboratorio [16]. Può essere utilizzato per valutare i livelli di antiossidanti e per esplorare i percorsi antiossidanti. Come mostrato nel Suppl. 1, l'acteoside e i suoi derivati potrebbero eliminare con successo la PTIO. a pH 4,5 e pH 7,4. Tuttavia, secondo i valori IC50 nella Tabella 1, i loro livelli relativi di PTIO·-scavenging allo stesso valore di pH erano diversi l'uno dall'altro. Inoltre, ogni acteoside e i suoi derivati hanno mostrato diversi livelli di PTIO·-scavenging tra pH 4,5 e pH 7,4. In generale, i livelli di PTIO·-scavenging a 7,4 erano superiori a quelli a pH 4,5.

2.3. Saggi ABTS+·-Scavenging e DPPH·-Scavenging

L'ABTS+·-scavenging e il DPPH·-scavenging sono ora ampiamente utilizzati per gli studi antiossidanti di composti o estratti puri. Come si è visto nel Suppl. 1, l'acteoside e i suoi derivati in base alla concentrazione hanno aumentato le percentuali abTS+·-scavenging o DPPH·-scavenging.

Tuttavia, in termini di valori IC50 nella Tabella 1, i loro livelli relativi di ABTS+·-scavenging sono stati trovati nell'ordine di acteoside > forsitoside B > poliumoside > Trolox. Un ordine simile potrebbe essere osservato anche nel test DPPH·-scavenging.

2.4. Analisi UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS del DPPH· Prodotti di reazione

Il prodotto di reazione di DPPH· con ciascuno dei trefenilpropanoideglicosidiè stato esplorato utilizzando l'analisi UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Nell'analisi (Suppl. 2), nessuno dei tre glicosidi fenilpropanoidi ha prodotto il picco del prodotto RAF. In confronto, l'acido caffeico è risultato produrre un prodotto dimero (m / z 359-360, Suppl. 2).

2.5. Analisi uv-vis-spectra di prodotti Fe2+-chelanti

Poiché gli spettri UV-vis-spec possono caratterizzare complessi metallici, lo studio ha quindi utilizzato gli spettri UV-vis per analizzare la possibile reazione Fe2+-chelante con trefenilpropanoide glicosidi. Come mostrato nella Figura 2, ognuno di essi potrebbe produrre uno spostamento batocromico (335 nm● 364 nm) negli spettri UV. Nel frattempo, ognuno di essi potrebbe fornire due deboli picchi di vis-spettri negli spettri visibili (480 nm e 719 nm) e portare a un aspetto verde chiaro. Tuttavia, l'intensità di picco era in ordine decrescente di poliumoside > forsitoside B > acteoside.

2.6. Saggio di autoossidazione del pirogallolo per l'anione superossido (· O2.) Pulitura

Il test di autoossidazione del pirogallolo è stato migliorato dal nostro laboratorio nel 2012 [17]. È stato utilizzato per stimare il · Potenziale di O2.-scavenging nel presente studio. Come si vede nel Suppl. 1, tutti gli acteoside e i suoi derivati potrebbero aumentare dose-dipendentemente il · O2.-percentuali di scavenging. Tuttavia, la bioattività relativa è diminuita nell'ordine della poliumoside > del forstitoside B > dell'acteoside, secondo i valori IC50 nella Tabella 1.

2.7. Effetto citoprotettivo nei confronti delle bmMSC stressate ossidativamente (saggio MTT)

Per valutare gli effetti citoprotettivi dell'acteoside e dei suoi derivati, abbiamo eseguito un test MTT. Nel test, le bmMSC sono state danneggiate dal reagente ossidativo H2O2, le bmMSC danneggiate sono state quindi trattate con acteoside e suoi derivati. I valori di A490nm sono stati utilizzati per valutare i relativi effetti citoprotettivi. Come si vede nella Tabella 2, ogni acteoside e i suoi derivati hanno aumentato i valori di A490nm in modo dose-dipendente. Tuttavia, alla stessa concentrazione, il poliumoside ha dato i più alti valori di A490nm.

3. Discussione

L'azione antiossidante dei composti fenolici naturali è nota per essere coinvolta nel trasferimento di elettroni (ET) [18,19]. Pertanto, alcuni saggi di riduzione dei metalli a base di ET sono stati ampiamente utilizzati per valutare i livelli antiossidanti di fenoli, come i saggi FRAP e CUPRAC. Le linee guida per il dosaggio FRAP devono essere soddisfatte con un pH inferiore a 3,6. Un tale ambiente acido ha soppresso con successo la ionizzazione H + dai fenoli; pertanto, il test FRAP è considerato un semplice processo ET [20,21]. L'efficacia dell'acteoside e dei suoi derivati nel saggio FRAP implica che, quando l'acteoside e i suoi derivati agiscono comeantiossidanti, possono utilizzare la via ET per esercitare la loro azione antiossidante.

Inoltre, abbiamo anche eseguito un test CUPRAC in un tampone a pH 7,4. Come si è visto nel Suppl. 1, l'acteoside e i suoi derivati hanno aumentato dose-dipendente le loro percentuali di potenza di riduzione di Cu2+, indicando che potrebbero rimanere potenziale ET a pH fisiologico. Tuttavia, i loro potenziali ET sono diminuiti nel seguente ordine: acteoside > forsitoside B > poliumoside (Tabella 1). Questa dinamica suggerisce chiaramente che la porzione di apiosile nel forsitoside B e la frazione di ramnosil nella poliumoside hanno abbassato il potenziale ET.

cistancheè un inibitore della tirosinasi

Per testare la possibilità che l'ET si verifichi durante i loro processi di scavenging dei radicali radicali, una PTIO di radicali liberi centrata sull'ossigeno. è stato introdotto nello studio. L'evidenza della voltammetria ciclica ha rivelato che lo scavenging PTIO·-scavenging al di sotto di pH 5,0 è una singola reazione elettrone-redox [22]. L'osservazione che l'acteoside e i suoi derivati potrebbero efficacemente eliminare la PTIO· radicale a pH 4,5, suggerisce la possibilità di ET durante i loro processi di scavenging radicale. Ovviamente, questa scoperta supporta ulteriormente i suddetti risultati dei test FRAP e CUPRAC e i risultati precedenti che un elettrone donatore (e) è una caratteristica del fenolicoantiossidanti[23]. A pH fisiologico 7,4, tuttavia, il saggio PTIO -scavenging non è semplicemente un percorso ET, ma include anche un percorso di trasferimento protonico-(H+). Durante il processo, PTIO è stato suggerito di accettare H + dai fenoli per produrre il picco del prodotto ([PTIO-H]+) [16]. Poiché il trasferimento di H+ è sempre accompagnato da ET in meccanismi graduali o sincroni [24], il prodotto realistico (o finale) è una molecola [PTIO-H] [22]. Il PTIO·-scavenging a pH 7,4 (Suppl. 1) implica che l'acteoside e i suoi derivati possiedono anche un potenziale di trasferimento H+. I valori IC50 (Tabella 1) indicavano che il

i potenziali di trasferimento H+ relativi erano in ordine decrescente di acteoside > forsitoside B > poliumoside. Chiaramente, le parti apiosyl e rhamnosyl hanno anche indebolito il potenziale di trasferimento H + durante il processo antiossidante.

Come discusso in precedenza, durante il processo antiossidante dei fenoli, l'ET è solitamente accompagnato dal trasferimento di protoni (H +) per formare diversi meccanismi antiossidanti [24], come il trasferimento idrogeno-atomo (HAT) [23,25-27], il trasferimento sequenziale elettrone-protone (SEPT) [26,27], il trasferimento sequenziale di protoni a singolo elettrone (SPLET) [26] e il trasferimento di elettroni accoppiati a protoni (PCET) [24-26,28].

Ad esempio, ABTS+·-scavenging, una reazione dominata dal trasferimento di un singolo elettrone (SET) [29], ha anche dimostrato di essere influenzata dai livelli di H + di recente [30]. ABTS+·-scavenging è, quindi, un saggio antiossidante multi-pathway [21,31]. Il fatto che l'acteoside e i suoi derivati potrebbero eliminare ABTS+· indica che la loro azione antiossidante può anche essere mediata da multi-vie. Questa ipotesi è ulteriormente confermata dalle evidenze del test DPPH·-scavenging, una reazione che comprende HAT, ET, SEPT e PCET percorsi multipli [26,32]. Tuttavia, l'analisi quantitativa basata sui valori IC50 (Tabella 1) ha rivelato che negli aspetti ABTS+·-scavenging e DPPH·-scavenging basati su più pathway, l'acteoside era superiore al suo apioside forsitoside B e al poliumoside rhamnoside. Pertanto, si può dedurre che le moieties apiosyl e rhamnosyl alla fine ostacolano i potenziali multi-pathway (in particolare ET e H +-transfer) durante il processo di scavenging dei radicali liberi. Come notato dagli autori e da altri [14,26], durante il processo antiossidante, può verificarsi anche una reazione RAF. Per verificare la possibilità RAF, invece, trefenilpropanoideglicosidiinsieme all'acido caffeico sono stati studiati utilizzando UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS analisi. Si è scoperto che l'acido caffeico produce un prodotto dimero, mentre trefenilpropanoideglicosidinon ha prodotto alcun picco di prodotto RAF.

Questa scoperta suggerisce chiaramente che trefenilpropanoideglicosidinon possono subire la via RAF per esercitare la loro azione antiossidante. Poiché tre glicosidi fenilpropanoidi possono essere considerati come gli esteri dell'acido caffeico (Figura 1), una tale differenza tra gli esteri dell'acido caffeico e dell'acido caffeico indica anche che un'enorme quantità può ostacolare la generazione di RAF.

Presi insieme, da un punto di vista dello scavenging dei radicali liberi, l'acteoside e i suoi derivati possono subire molteplici percorsi per esercitare la loro azione antiossidante. Queste vie antiossidanti almeno sono coinvolte nel trasferimento di ET e H + (ma non RAF). I nostri risultati sono in parte supportati dallo studio teorico che l'acteoside potrebbe esercitare l'azione antiossidante attraverso la via SPLET. Nel processo, l'acteoside potrebbe in primo luogo deprotonato (H +-trasferimento) per produrre anione. Si pensa che la deprotonazione si verifichi nelle parti di catecoli con acidità debole. Successivamente, l'anione ha donato elettroni per dare origine alla forma di radicale fenossidico [33]. I radicali fenossici con coniugazione p-u tuttavia sono stabili in una certa misura. Naturalmente, a questo proposito, in futuro è necessario un ulteriore lavoro sperimentale.

Vale la pena ricordare che lo stress ossidativo cellulare può anche provenire da metalli di transizione (in particolare Fe2+). Lo ione Fe2+, tuttavia, può trasformare la molecola H2O2 in una delle più dannose · Radicali OH tramite la reazione di Fenton (Fe2+ + H2O2 ● Fe3+ + · OH + OH.). Pertanto, l'attenuazione dei livelli di Fe2+ può inibire efficacemente · Radicali OH per rilasciare lo stress ossidativo cellulare. Infatti, ferro-chelante da fenolico naturaleantiossidantiora è stata sviluppata in una terapia efficace per alcune malattie da stress ossidativo [34,35].

Nel presente studio, l'acteoside e i suoi derivati sono stati suggeriti come efficaci Fe2+-chelanti dai cambiamenti nella spettroscopia e nei colori della soluzione (Figura 2). Tuttavia, l'acteoside è inferiore ai due glucosidi nel chelante Fe2+ e il forsitoside B con apiosil moiety è inferiore al poliumoside con rhamnosyl moiety. Sulla base del confronto delle loro conformazioni preferenziali (Figura 1, a destra), si propone che la porzione di apiosile (o ramnosil) possa aiutare il ligando principale (fenilpropanoidegruppo) nel chelante Fe2+. Un tale effetto sinergico rafforza senza dubbio la capacità di Fe2+-chelante e allarga i picchi UV-vis. Tuttavia, il ramnosile è più efficace dell'apiosile nella sua capacità di Fe2+ chelante. La differenza può essere attribuita al fatto che il ramnosile si presenta in una forma esociclica (cioè,/-L-rhamnopyranosyl), mentre l'apiosil è in una forma pentaciclica (cioè α-D-apiofuranil). Una forma esociclica è nota per essere più grande e più stabile. Quindi, il rhamnosyl esociclico è più efficace rispetto all'apiosil pentaciclico nella sua capacità di Fe2+-chelante.

Per verificare se l'acteoside e i suoi derivati possono eliminare i ROS, abbiamo condotto un test di autoxidazione del pirogallolo. Come si vede nel Suppl. 1, tutti potrebbero efficacemente scovare il · O2. radicale, un tipico ROS che si verifica nelle cellule. Tuttavia, la bioattività relativa è diminuita nell'ordine poliumoside > forsitoside B > acteoside. Questo ordine è anche parallelo a quello degli effetti citoprotettivi (Tabella 2). Questa scoperta indica che l'effetto generale della frazione di rhamnosyl o della porzione di apiosil è quello di migliorare gli effetti ROS-scavenging o citoprotettivi.

cistancheavere ilfunzionedisbiancantepelle

4. Materiali e metodi

4.1. Sostanze chimiche e animali

Acteoside (numero CAS: 61276-17-3, 97%), forsitoside B (numero CAS: 81525-13-5, 97%) sono stati ottenuti da BioBioPha (Kunming, Cina, Suppl. 3). La poliumoside (numero CAS: 94079-81-9, 97%) è stata isolata dal nostro team dall'erba tradizionale cinese Callicarpa pei H.T. Chang (Suppl. 3). Il DPPH·, (o)-6-idrossil-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-acido carbossilico (Trolox), 2,9-dimetil-1,10-fenantrolina (neocuproina), 2,4,6-tripiridiltriazina (TPTZ) e pirogallolo sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Shanghai, Cina). (NH4)2ABTS [2,2→-azinobis (sale di diammonio dell'acido 3-etilbenzene-tiazolina-6-solfonico)] è stato ottenuto da Amresco Chemical Co. (Solon, OH, USA). PTIO· radical è stato acquistato da TCI Development Co., Ltd. (Shanghai, Cina). L'acido caffeico è stato acquistato dall'Istituto nazionale per il controllo dei prodotti farmaceutici e biologici (Pechino, Cina). Il mezzo dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM), il siero bovino fetale (FBS) e la tripsina sono stati acquistati da Gibco (Grand Island, NY, USA). Il kit per il dosaggio dell'annessina V/ioduro di propidio (PI) è stato acquistato da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Tutti gli altri reagenti erano di grado analitico.

I ratti Sprague-Dawley (SD) di 4 settimane di età sono stati ottenuti dall'Animal Center dell'Università di Medicina Cinese di Guangzhou. Il protocollo di questo esperimento è stato eseguito sotto la supervisione del Comitato istituzionale di etica animale dell'Università cinese di Guangzhou (numero di approvazione 20170306A).

4.2. Saggi di riduzione dei metalli (FRAP e CUPRAC)

I saggi di riduzione dei metalli includono il test di potenza riducente Fe3 + e il test di potenza riducente Cu2 +. Il test di riduzione Fe3+ è stato istituito da Benzie and Strain ed è formalmente chiamato FRAP [20]. Il protocollo sperimentale di questo test è stato descritto in un precedente rapporto [9]. In breve, il reagente FRAP è stato preparato fresco mescolando 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3 e tampone di acetato da 0,25 M in un rapporto di 1:1:10 a pH 3,6. Il campione di prova (x = 4-20 βL, 0,05 mg/mL) è stato aggiunto a (20 . x) βL di etanolo al 95% seguito da 80 βL di reagente FRAP. Dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, l'assorbanza è stata misurata a 595 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Multiskan FC, Thermo Scientific, Shanghai, Cina). Il potere riducente relativo del campione è stato calcolato utilizzando la seguente formula:

dove Amax era l'assorbanza massima della miscela di reazione con il campione e Amin è l'assorbanza minima nella prova. A è l'assorbanza del campione.

Il potere riducente cu2 + può anche caratterizzare il livello antiossidante e quindi è chiamato CUPRAC. Questo test è stato effettuato secondo un metodo precedentemente pubblicato [36]. In breve, 12 βL di soluzione acquosa di CuSO4 (10 mmol/L), 12 βL di soluzione etanolica di neocospino (7,5 mmol/L) e (75. x) βL di soluzione tampone CH3COONH4 (0,1 mol/L, pH 7,5) sono stati aggiunti a pozzetti con diversi volumi di campione (0,05 mg/mL, 4-20 βL). L'assorbanza a 450 nm dopo 30 min è stata misurata utilizzando il suddetto lettore di micropiastre. La potenza relativa di CUPRAC è stata calcolata utilizzando la formula per FRAP. Amax era la massima assorbanza della miscela di reazione con la sample, e Amin è l'assorbanza minima nel test. A è l'assorbanza del campione.

cistanchehanno gli effetti dello sbiancamento della pelle

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