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Katharina Artinger', Alexander H. Kirsch', Agnes A. Mooslechner', Daniel J. Cooper23, Ida Aringer', Max Schuller', Corinna SchabhüttI', Konstantin A. Klötzer', Kerstin Schweighofer', Philipp Eller,Hideo Yagita', Anna L. Illert', Alexander R. Rosenkranz', Peter J. Lane2 e Kathrin Eller

Cistanche può aiutare molto bene con la funzione renale

'Divisione Clinica di Nefrologia, Dipartimento di Medicina Interna, Università di Medicina di Graz, Graz, Austria; Medical Research Council Center for Immune Regulation, Institute for Biomedical Research, University of Birmingham, Birmingham, UK; Divisione di salute globale e tropicale, Menzies School of Health Research e Charles Darwin University, Darwin, Northern Territory, Australia; Unità di Terapia Intensiva, Dipartimento di Medicina Interna, Università di Medicina di Graz, Graz Austria: 'Dipartimento di Immunologia, Scuola di Medicina Juntendo University, Tokyo, Giappone; e laurea Dipartimento di Medicina l, Centro medico-Università di Friburgo, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, Friburgo, Germania

La costimolazione è un prerequisito per l'attività patogena nelle malattie mediate dai linfociti T ed è stato dimostrato che raggiunge la tolleranza nell'autoimmunità organo-specifica come bersaglio terapeutico. Qui, abbiamo valutato il coinvolgimento dei membri della famiglia del fattore di necrosi tumorale CD30 e OX40 in immunocomplessi mediatirene patologia. Stimolazione e proliferazione in vitro, sono stati condotti studi con cellule CD4 plus da topi wild type e CD30/OX40 double knock-out （CD30OX40）. Studi in vivo sono stati condotti mediante induzione di nefrite sierica nefrotossica in topi wild type, CD30OX40, CD30', OX40 grado, ricostituiti Rag1~ e C57Bl/6J trattati con anticorpi CD30L aOX40L. CD30, OX40 e i loro ligandi sono stati sovraregolati su vari leucociti nella nefrite sierica nefrotossica. I topi CD30OX40, ma non i topi CD30/o OX40 erano protetti dalla nefrite sierica nefrotossica. Una protezione simile è stata trovata nei topi Rag1 iniettati con cellule T CD4 più da topi CD30OX40 rispetto ai topi Rag1 "iniettati con cellule CD4 T da topi wild-type. Inoltre, cellule T CD4 più carenti di CD30OX40 / mostravano una ridotta espressione di CCR6 in vivo. CD30OX40 * cellule ne erano pienamente capaci

differenziandosi in sottoinsiemi di cellule T helper che mediano la malattia, ma hanno mostrato livelli di proliferazione significativamente ridotti in vivo e in vitro rispetto alle cellule di tipo selvaggio. Il blocco degli anticorpi contro CD30L e OX40L ha migliorato la nefrite sierica nefrotossica senza influenzare le popolazioni di cellule T di memoria o pan-effettore. Pertanto, i nostri risultati indicano la promozione della malattia tramite la segnalazione CD30 e OX40 a causa della facilitazione della proliferazione delle cellule T esagerata e della migrazione delle cellule T helper 17 nella nefrite sierica nefrotossica. Quindi, il blocco della co-stimolazione mirato alle vie di segnalazione CD30 e X40 può fornire una nuova strategia terapeutica nel sistema immunitariomalattie renali.

Dichiarazione traslazionale

Questo articolo descrive l'applicabilità delle vie di segnalazione CD30 e OX40 come futuri bersagli terapeutici nella malattia glomerulare mediata da immunocomplessi utilizzando il modello murino di nefrite sierica nefrotossica. Il blocco combinato delle vie di costimolazione CD30 e OX40 è un modo per raggiungere la tolleranza periferica nell'autoimmunità riducendo l'iperproliferazione patogena negli organi linfoidi secondari e la migrazione delle cellule T helper 17 patogene alle cellulerene. Poiché le opzioni di trattamento tradizionali sono state accompagnate da gravi effetti avversi, il blocco combinato di CD30 e OX40 potrebbe comportare un minor numero di infezioni pericolose per la vita rispetto alle tradizionali terapie immunosoppressive.

La segnalazione costimolatoria è un prerequisito per l'attivazione, la differenziazione, la funzione effettrice e la sopravvivenza dei linfociti T. Il blocco della costimolazione è stato identificato come una strategia per raggiungere la tolleranza immunitaria. Accanto alla superfamiglia Ig, tra cui CD28 e B7, le molecole più co-stimolanti sono membri della superfamiglia del fattore di necrosi tumorale (TNF) evolutivamente antica e altamente conservata." CD30 e OX40 sono membri proinfiammatori della superfamiglia del TNF che non solo condividono vie di segnalazione comuni ma anche funzionalmente agiscono sinergicamente.I fattori associati al recettore del TNF interagiscono con le regioni recettoriali intracellulari e promuovono la sopravvivenza cellulare tramite la segnalazione del fattore nu-dear-KB in entrambi i casi. CD30 e OX40, così come i loro ligandi CD30L e OX40L, possono essere espressi su T e cellule B e su una varietà di cellule presentanti l'antigene.

Il CD30 svolge un ruolo proinfiammatorio critico nel diabete autoimmune, nella colite e nell'encefalomielite murini.-1 L'indagine su modelli sperimentali ha trovato ruoli patogeni per OX40 nell'uveite autoimmune, nell'artrite e nell'infiammazione allergica,12-1 mentre un recente rapporto ha suggerito la via OX40/OX40L per proteggere dalla glomerulonefrite crescente stimolando la proliferazione dei linfociti T regolatori. Tuttavia, entrambe le molecole sono state collegate indipendentemente alla patogenesi del lupus eritematoso sistemico (LES). Il CD30 solubile è un marker dell'attività della malattia in SLEl6,17 a e un aplotipo OX40L è associato a un aumentato rischio di sviluppare la malattia.8 Inoltre, le cellule T helper 17(Th17) esprimono livelli aumentati di OX40 nei pazienti con LES e L'espressione di OX40 è rilevabile sui leucociti perivascolari nella nefrite da lupus.

Opzioni terapeutiche efficaci per il trattamento della glomerulonefrite sono associate ad un aumento della morbilità e ad un alto rischio di effetti avversi1; quindi, è necessaria una terapia più specificamente mirata. Un approccio crescente nel prendere di mira le risposte immunitarie è l'induzione della tolleranza.]Le opzioni terapeutiche per raggiungere la tolleranza periferica includono la delezione clonale, l'ignoranza, la regolazione immunitaria e, infine, l'energia, che era già stata dimostrata una valida strategia immunosoppressiva quando i linfociti T citotossici- sono state introdotte proteine ​​di fusione associate alle proteine ​​4-lg.

Il blocco OX40L è attualmente in fase di valutazione clinica; tuttavia, il targeting combinato di CD30 e OX40 non è stato finora studiato in modo completo. L'autoimmunità CD4-dipendente dipende in modo critico dall'interazione di entrambe le coppie recettore-ligando, dimostrata dalla necessità di un'abrogazione combinata della segnalazione di CD30 e OX40 per proteggere i topi carenti di forkhead box P3(FoxP3) dallo sviluppo di letali precoci malattia autoimmune. La nefrite sierica nefrotossica (NTS) è un modello murino di glomerulonefrite immunocomplessa che ha dimostrato di essere strettamente dipendente dalle cellule T, comprese le cellule T helper 1(Th1) e Th17. La presentazione dell'antigene in questo modello avviene principalmente negli organi linfoidi secondari, ma anche localmente all'interno delrene. Pertanto, abbiamo ipotizzato che l'attivazione delle vie di costimolazione CD30 e OX40 presumibilmente pro-moti NTS.

METODI Animali

CD30OX407topi a doppio knockout carenti di CD30 e OX40 sono stati generati come descritto in precedenza.' CD30OX40-e CD30OX40 plus /littermate control, così come CD30~ e OX40~-sono stati allevati internamente. I topi CD30√ sono stati forniti anche dal Dr. alert, Freiburg, Germania. I topi C57BL/6J sono stati ottenuti da Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germania). I topi Ragland B6.Thyl.1 sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Tutti i topi erano su sfondo C57BL/6J.

Modello NTS

NTS è stato indotto come descritto in precedenza. In breve, i topi sono stati preimmunizzati sc con 2 mg/ml di coniglio lgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) sciolto in adiuvante di Freund incompleto (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con Mycobacterium tuberculosis H37a essiccato e non vitale (Difco Laboratories, Detroit, MI) 3 giorni prima della somministrazione di siero anti-topo nefrotossico di coniglio. La valutazione è stata effettuata dopo 4 o 14 giorni dopo l'iniezione del siero NTS, come indicato.

Trasferimento di cellule in Rag1-/topi

Ai topi Rag1- sono stati iniettati 1,5 × 10 gradi CD4 più cellule T da milza di topi wild-type (WT) o CD30OX40-- o cellule WT CD90.1 e sono state ottenute cellule knockout CD90.2 trasferito adottivamente in un rapporto 1:1. Un giorno dopo il trasferimento adottivo, NTS è stato indotto e valutato dopo 4 o 14 giorni. Le cellule T CD4 più sono state isolate dalla milza usando il kit di isolamento cellulare CD4 più del topo (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania).

Blocco degli esperimenti sugli anticorpi

I topi nefritici C57BL/6 sono stati trattati con anticorpi bloccanti contro OX40L(clone RM134L) e CD30L(clone RM153) di topo in combinazione o da soli a partire dal giorno dell'immunizzazione o 3 giorni dopo Induzione NTS. Ai topi sono stati iniettati ip con 0,5 mg di x-OX40L e/o 0,5 mg di anticorpi monoclonali a-CD30L o 1 mg di IgG di controllo (Sigma-Aldrich) 3 volte a settimana.

Misurazione dell'albumina urinaria, della creatinina e delle citochine surnatanti

Per la determinazione dell'escrezione urinaria di albumina, come riportato in precedenza (intervallo di rilevamento,0.781-200 ng/ml), è stato utilizzato un test immunoassorbente enzimatico a doppio sandwich (Abcam, Cambridge, MA). La creatinina urinaria è stata valutata fotometricamente utilizzando un kit a base di acido picrico disponibile in commercio (Sigma-Aldrich). Il rilevamento delle citochine nei supernatanti è stato eseguito come indicato nei metodi supplementari.

Valutazione della risposta anticorpale autologa

Le piastre sono state incubate per una notte con 100 ug/ml di IgG di coniglio (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Successivamente, il siero è stato incubato in diluizioni seriali per il rilevamento delle Ig anti-coniglio circolanti di topo. Utilizzando IgG anti-topo di capra coniugata con perossidasi di rafano (Jackson ImmunoResearch Laboratories), è stato rilevato IgG anti-coniglio di topo.

Azoto ureico nel sangue

Azoto ureico nel sangue

I livelli (BUN) nel siero sono stati ottenuti utilizzando un kit di rilevamento colorimetrico BUN disponibile in commercio (Invitrogen).

Valutazione dell'istopatologia e dell'immunopatologia

Valutazione della colorazione periodica con acido di Schiff (PAS).renele sezioni sono state eseguite come descritto in precedenza1,2 e nei metodi supplementari.

Una 3-tecnica di colorazione dell'immunoperossidasi a strati è stata utilizzata per la valutazione delle cellule infiltranti i tessuti (metodi supplementari).

Immunofluorescenza e microscopia confocale

I campioni di tessuto congelato sono stati colorati con anticorpi marcati in modo fluorescente (metodi supplementari) e valutati su un meta LSM510 (Zeiss, Oberkochen, Germania).

Figura 1| CD30, OX40, ligando CD30 (CD30L) e ligando OX40 (OX40L) sono espressi in modo differenziale sui leucociti splenici nella nefrite sierica nefrotossica (NTS). Espressione di CD30, OX40, CD30L e OX40L su cellule T CD4 più in topi C57Bl/6J sani e nefritici dopo 12 ore.24 ore,72 ore,7 giorni e 14 giorni di topi NTS(n =5/ gruppo). L'espressione dei rispettivi recettori e ligandi è stata valutata su (a) cellule T CD4 più, (b) cellule CD8T, (c) cellule B, (d) cellule CD11cdendritiche, (e) CD11bLv6G più neutrofili SSChi, (f) CD11btLy6GCD115 più Ly6C più monociti classici e (g) CD11btLy6G-CD115 più Ly6C monociti non classici.Tutti i dati mostrano intervalli mediani e interquartile.I significati statistici sono forniti rispetto ai topi sani.*P<><><0.001,><>

Citometria a flusso

La lisi dei globuli rossi utilizzando la soluzione tampone di lisi 1 × RBC (eBioscience) è stata eseguita con campioni di sangue prima di ottenere una sospensione unicellulare da sangue, milza e linfonodi utilizzando 70- filtri per cellule um. Isolamento cellulare dareniè stato eseguito utilizzando la centrifugazione in gradiente di densità Percoll dopo la digestione del tritato finementereninel terreno Roswell Park Memorial Institute 1640 (Thermo Fisher Scientific) integrato con collagenasi D e DNAsi I a 37 gradi, come descritto in precedenza.

Le colorazioni e le valutazioni della citometria a flusso sono state eseguite come descritto nei metodi supplementari.

Saggio di proliferazione dei linfociti T CD4 più

Le cellule T CD4 più sono state incubate con Celltrace Violet (CellTrace Violet Cell Proliferation Kit; Invitrogen), secondo il protocollo del produttore, e seminate a 2,5 × 10/ml per l'incubazione con 5 ug/ml di concanavalina-A (Sigma-Aldrich) o 5 ug/ml di fitoemoagglutinina (Sigma-Aldrich). Dopo 7 giorni, è stata utilizzata la citometria a flusso per valutare l'intensità di Celltrace Violet in queste cellule.

Stimolazione splenocitaria

Splenociti da topi nefritici trattati con anticorpi isotipici o anticorpi xCD30LxOX40L sono stati raccolti dopo 14 giorni di NTS. Gli splenociti sono stati seminati a 2 × 10 percento / ml in pozzetti prerivestiti con IgG di coniglio e restimolati per 24 ore prima della citometria a flusso. Gli splenociti di topi nefritici WT e CD30OX40~ (giorno 14) sono stati seminati a 2 × 1097 ml e stimolati con xCD3 (5 ug/ml) e xCD28 (1 ug/ml) (entrambi da eBioscience) per 3 giorni prima della valutazione del supernatante della coltura cellulare .

CD4 più esperimenti di polarizzazione dei linfociti T

CD4 più CD62L più cellule T sono stati isolati dalla milza usando il CD4 più CD62L più kit di isolamento II (Miltenyi Biotec) e stimolati come indicato nei metodi supplementari.

Reazione a catena della polimerasi in tempo reale della trascrizione inversa L'RNA totale è stato estratto dai linfonodi ereniutilizzando il reagente TRI (Sigma-Aldrich) e successivamente, il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il kit di trascrizione Superscript II (Invitrogen) e primer casuali (Invitrogen) per la trascrizione inversa di 2 ug di RNA totale. La reazione a catena della polimerasi in tempo reale è stata eseguita in duplicato su un sistema in tempo reale CFX96 (BioRad, Hercules, CA). gene TaqMan

Figura 2| I topi CD30OX40- sono protetti dalla nefrite sierica nefrotossica (NTS). CD30OX40-/-topi, topi CD30 single knockout e OX40 topi single knockout, nonché topi wild-type (WT), controlli (n {9}} topi per gruppo) sono stati sottoposti a 14 giorni di NTS Sono stati valutati (a) albuminuria e (b) livelli sierici di azoto ureico (BUN). (ce) Rappresentante periodico colorato con acido di Schiff (PAS).reni, oltre ai punteggi PAS, vengono mostrati (f) punteggio crescente, (g) punteggio dei trombi intralaminari, (h) formazione del gesso tubulare e (i) punteggio del danno tubulare acuto. () Sono forniti cellule T CD68 più infiltranti renali, (k) neutrofili, () cellule CD4T e (m) cellule T CD8 più. Il numero totale di cellule e il numero di cellule T CD45 più CD4 in (n) linfonodi e (o) la milza di WT e CD30OX40-/-topi sono stati valutati mediante citometria a flusso. (p) Numero totale di leucociti renali valutati mediante citometria a flusso e (g) percentuali di cellule T CD4 più, cellule T CD8 più, neutrofili Ly6G più SSChi, monociti Ly6C più e monociti Ly6C inrenidi topi CD30OX40 e W. (r) È stato valutato lgG anti-coniglio di topo (n=10 topi/gruppo). (s) Vengono mostrati i numeri totali di CD4 più CD28 più cellule/linfonodi di topi nefritici WT (n {6}} topi) e CD30OX40-/ (n {9}} topi). Ingrandimento originale ×40.I dati mostrano (a,b,r,s) media ± SEM; (c,fg) le mediane sono indicate da una linea orizzontale. I dati sono rappresentativi di 4 esperimenti indipendenti. I significati statistici sono forniti rispetto ai topi WT.*P<><0.01,><0.001,and>< 0.0001.hpf,="" high-power="" field;="" od,="" optical="" density.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

sono stati utilizzati saggi di espressione (Applied Biosystems, Foster City, CA) e SYBR green (BioRad) (metodi supplementari).

analisi statistica

Tutte le valutazioni statistiche (metodi supplementari) sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 6.0 per Macintosh (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Dichiarazione etica

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali del ministero austriaco (BMWFW-66.010/0054-WF/V/3b/2015).

RISULTATI

L'espressione di CD30 e OX40 e dei loro ligandi cambia nel corso del tempo di NTS sulle cellule dell'immunità innata e adattativa L'espressione di CD30 e OX40 è aumentata sulle cellule T spleniche CD4 più nel corso del tempo di NTS (Figura la). Entrambi i livelli di espressione di CD30L e OX40L erano significativamente aumentati sui linfociti T splenici CD4 più di topi nefritici dopo 7 e 14 giorni (Figura la). Su CD4 * CD25Foxp3 più cellule T regolatorie (Tregs), è stato riscontrato un aumento simile dell'espressione di CD30, CD30L e OX40 nel tempo (Figura supplementare S1A). CD30, OX40 e OX40L sono stati significativamente aumentati sulle cellule Th17 (Figura supplementare S1D) dopo 14 giorni di NTS rispetto ai topi sani. Inoltre, CD30 e OX40 erano entrambi significativamente aumentati sui linfociti T CD8 a partire da 12 ore dopo l'induzione di NTS rispetto ai topi sani (Figura 1b). Le cellule B hanno mostrato un profilo di espressione simile alle cellule T CD4 più (Figura 1c). OX40L è stato sottoregolato già dopo 12 ore di NTS e successivamente è rimasto diminuito sulle cellule dendritiche (Figura 1d). Allo stesso modo, CD30L e OX40L erano down-CD11b più Ly6G più SSChineutrofili, regolati sui monociti Ly6G-CD115 più Ly6Ct e Ly6G-CD115Ly6C nel corso del tempo di NTS (gamba della figura). Sui neutrofili, le cellule dendritiche e i monociti CD30 e OX40 tendevano ad aumentare in NTS (Figura ld-g). CD30L è stato sempre più espresso sulle cellule linfoidi innate di tipo 2 12 ore dopo l'induzione di NTS e anche CD30L e OX40L sono stati aumentati dopo 14 giorni di NTS (Figura supplementare S1B). Il numero di leucociti che esprimono CD30, CD30L, OX40 e OX40L è aumentato in NTS, il che era in linea con i risultati sulle cellule spleniche (Figura supplementare SIE-G). L'espressione dell'mRNA di Cd30 e Ox40l non era rilevabile inrenidopo 7 e 14 giorni di NTS (Figura supplementare S1H). Tuttavia, l'mRNA di Cd30l è aumentato dopo 7 e 14 giorni di NTS, mentre l'espressione di mRNA di Ox40 è rimasta invariata dopo 14 giorni di NTS inreni(Figura supplementare S1H).

La segnalazione reciproca di CD30 e OX40 è necessaria per lo sviluppo del fenotipo NTS

Abbiamo riscontrato una diminuzione dell'albuminuria e del BUN nei topi nefritici CD30OX40-/rispetto ai controlli WT (Figura 2a e b), mentre l'albuminuria nei topi CD30- e OX40- era paragonabile ai topi di controllo WT (Figura 2a). È stata osservata anche una diminuzione significativa inrenePositività PAS, formazione a mezzaluna, punteggio di trombi intraluminali, formazione di gesso tubulare e punteggio di danno tubulare acuto nei topi CD30OX40-/ rispetto ai topi WT (Figura 2c-i). Tutte queste caratteristiche istologiche non sono state significativamente alterate nei topi knockout singoli rispetto ai controlli WT (Figura 2c e fi). Abbiamo trovato un numero significativamente più basso di macrofagi CD68 nei reni dei topi CD30OX40-- rispetto ai controlli WT (Figura 2j). C'è stata una tendenza verso un numero ridotto direne-infiltrazione di CD68 più macrofagi in CD30- e OX40-/- topi a eliminazione diretta (Figura 2j). Neutrofili e cellule T CD8 sono stati trovati in numero significativamente ridotto inrenidi topi CD30OX40- rispetto ai controlli WT nefritici e topi CD30-- e OX40- hanno mostrato un numero inferiore di neutrofili e cellule T C8 più che si infiltravano nei reni (Figura 2k e m). Le cellule T CD4 più sono state trovate in numeri significativamente più bassi nei nefriticirenidi CD30OX40--(Figura 2l). La citometria a flusso dei reni ha rivelato risultati simili di riduzione del numero di cellule infiltranti (Figura 2p e q). Da notare, i topi knockout singoli e doppi ingenui non hanno mostrato differenze nella composizione dei leucociti splenici rispetto ai topi WT sani, quando sono stati valutati i linfociti T CD4 plus e CD8 plus, i neutrofili e i monociti (Figura supplementare S2). L'espressione di Icos e Gitr è stata ridottarenidi topi nefritici CD30OX40-(Figura supplementare S3B). Le risposte delle cellule B, misurate dalle IgG anti-coniglio di topo, sono state ridotte nei topi CD30OX40- rispetto ai controlli WT (Figura 2r).

Il numero di cellule T CD4 più non viene ridotto nei linfonodi dei topi CD30OX40-/-

La citometria a flusso non ha rivelato differenze nella cellularità totale dei linfonodi e della milza (Figura 2n e o) o nel numero di cellule CD4 plus. È interessante notare che non abbiamo rilevato alcuna differenza nelle Treg tra i topi WT e CD30OX40- (Figura supplementare S3). Da segnalare le citochine (TNF-d, interleuchina-6, interferone-Y, interleuchina-17, interleuchina-4 e interleuchina-10) misurate in supernatanti di splenociti restimolati isolati da I topi WT e CD30OX40-14 giorni dopo NTS non hanno mostrato differenze (dati non mostrati).

Le cellule T CD4 più carenti di CD30 e OX40 non riescono a promuovere NTS Per studiare il ruolo dell'espressione di CD30 e OX40 sulle cellule CD4 più in NTS, Rag1- sono state iniettate con cellule CD4 più (Figura supplementare S4) dalle milze di entrambi WT o CD30OX40-/topi. Il numero totale di cellule CD4 spleniche più e i tassi di cellule morte erano comparabili il giorno 4 dopo l'induzione di NTS (Figura supplementare S5). Sebbene i topi Rag1 ~ che hanno ricevuto cellule CD4 plus da topi WT abbiano sviluppato albuminuria e BUN significativi dopo 14 giorni di NTS, i topi Rag1-/ ricostituiti con cellule CD4 plus da topi CD30OX40 (Figura 3a) non lo hanno fatto. Il danno istologico è stato significativamente ridotto nei topi Ragl1-che hanno ricevuto CD4 più linfociti T da topi CD30OX40-- rispetto ai linfociti WT, come determinato dal punteggio PAS, punteggio crescente, punteggio dei trombi intraluminali, punteggio del danno tubulare acuto, e calchi tubolari (Figura 3b-g). Cellule che si infiltranorenidi topi Ragl, comprese le cellule CD4 più, i macrofagi CD68 e i neutrofili Ly6G più, erano anche significativamente ridotti se le cellule CD4 più trasferite non esprimevano CD30 e OX40 (Figura 3h-k). Le cellule T CD4 più isolate da topi WT che esprimono CD90 I topi .1 e CD30OX40- che esprimono CD90.2 sono stati ulteriormente trasferiti in modo adottivo a Rag1-/topi in un rapporto 1:1. Qui, i numeri assoluti di CD90.2 che esprimono CD30OX40-- CD4 più cellule T erano diminuiti nella milza rispetto a CD90.1 WT CD4 più cellule T (Figura 4t e u), ma le percentuali di Ifn-Y (Figura 4a e b), l4 (Figura 4d ed e) e Il17 (Figura 4g e h) le cellule produttrici erano significativamente più alte nelle cellule knockout che esprimono CD90.2. Tuttavia, allo stesso tempo, è stato riscontrato che percentuali ridotte di cellule knockout CD90.2 hanno un fenotipo Th17 nei reni rispetto alle cellule WT CD90.1 (Figura 4i), mentre è stato riscontrato il contrario per la cellula T helper 2 (Th2) )cellule dentroreni(Figura 4c ed f). Tuttavia, il numero assoluto di cellule knockout CD90.2 trasferite nelreneerano significativamente inferiori rispetto alle cellule WT CD90.1 (dati non mostrati).

La carenza di CD30 e OX40 interrompe la migrazione di Th17 dagli organi linfoidi secondari ai reni

Il recettore delle chemochine CXC (CXCR)3 (Figura 4j e k) è stato aumentato sulle cellule CD90.2 CD30OX40-/- rispetto alle cellule CD90.1 WT, mentre non sono state rilevate differenze per l'espressione CXCR6 (Figura 4l e m) . Ancora più importante, abbiamo riscontrato una diminuzione significativa del recettore delle chemochine CC (CCR) 6 sulle cellule knockout CD90.2 (Figura 4n e o). Nella fase successiva, le cellule T CD4 più ingenue sono state stimolate in vitro in condizioni di differenziazione Th1 o Th17 ( Figura supplementare S6). Abbiamo osservato una tendenza verso un maggiore potenziale per la differenziazione Th17 (Figura 5a e) e Th1 (Figura 5c e d) di cellule T CD4 più naive isolate da topi CD30OX40-/- rispetto ai topi WT in vitro. In particolare, i linfociti T CD4 più che esprimono CD28 sono risultati significativamente aumentati

Figura 3| Rag1-/topi che ricevono CD4 più cellule T da CD30OX40-/sono protetti dalla nefrite sierica nefrotossica (NTS). Rag1-/topi che ricevono cellule T CD4 da uno dei due tipi selvatici (WT ) o CD30OX40-topi sono stati sottoposti a NTS e seguiti per 14 giorni (n =6 fino a 7 topi per gruppo).(a) Sono stati valutati i livelli sierici di albuminuria e di azoto ureico (BUN).( e) Rappresentante periodico colorato con acido Schiff(PAS).renioltre a (b) vengono mostrati i punteggi PAS, (C) il punteggio crescente, (d) il punteggio dei trombi, (t) i modelli tubulari e (g) il punteggio del danno tubulare acuto. (h) Numero di cellule T CD4 (i) CD68 più macrofagi , e vengono mostrati (j) neutrofili Ly6Gt e (k) immagini rappresentative. Ingrandimento originale × 40 (numeri PAS, CD4, [continua] nei linfonodi dei topi nefritici CD30OX40-/ rispetto ai topi WT (Figura 2s).

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