PARTE 1 Il polisaccaride di Cistanche Deserticola inibisce la perdita ossea indotta da OVX nei topi e l'osteoclastogenesi indotta da RANKL

1. Introduzione

L'osteoporosi – una malattia caratterizzata da diminuzione della massa ossea, microstruttura anormale del tessuto osseo, aumento della fragilità ossea e frattura (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006) – attualmente colpisce più di 200 milioni di persone in tutto il mondo e presenta un notevole onere medico e socioeconomico sulla società moderna (Strom et al., 2011). Il trattamento clinico dell'osteoporosi si concentra principalmente sulla terapia ormonale sostitutiva, bifosfonata o denosumab. Questi metodi sono efficaci ma pongono effetti collaterali a lungo termine come il potenziale rischio di cancro al seno e fratture atipiche del femore (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof- Bauer, 2011). Quindi, c'è un urgente bisogno di esplorare farmaci che non solo possono inibireosteoporosima possiedono anche meno effetti collaterali indesiderati.

Cistanche deserticola(CD), un alimento tonico e medicinale ampiamente usato in Cina, noto come "ginseng del deserto", è il gambo succulento essiccato con scaglie fogliari diC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) e ha diversi ed efficacifarmacologicoAttività, come la regolazione immunitaria, l'anti-ossidazione e l'anti-osteoporosiproprietà (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Precedenti studi sui principi attivi della CD sul trattamento dell'osteoporosi si sono concentrati principalmente sufeniletanoideglicosidi(Li, Jiang e Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao e Ma, 2017). Tuttavia, il CD contiene anche altri componenti efficaci come iridoidi, lignani,polisaccaridi(Wang, Zhang, & Xie, 2012). L'applicazione clinica della medicina tradizionale cinese (MTC) è principalmente la decodifica dell'acqua.Polisaccaridisono componenti idrosolubili e hanno maggiori probabilità di essere i principali componenti farmacodinamici della MTC. I polisaccaridi estratti dalla MTC sono stati selvaggiamente segnalati per avere un anti-osteoporosie alcuni effetti collaterali indesiderati, che sono stati generalmente utilizzati nelle cliniche (ad esempio, polisaccaridi estratti da Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai e Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang e Yan, 2018) e Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Pertanto, abbiamo ipotizzato cheCistanche deserticolapolisaccaride(CDP) estratto da CD può essere un farmaco potenzialmente sicuro per il trattamento dell'osteoporosi.

Tipicamente, il riassorbimento osseo e la formazione ossea mantengono un equilibrio dinamico durante il rimodellamento osseo in coordinamento con diversi tipi di cellule, tra cui osteoclasti, osteoblasti, cellule di rivestimento osseo e osteociti (Kular, Tickner, Chim e Xu, 2012). Una rottura di questo equilibrio può causare una varietà di malattie metaboliche ossee, comeosteoporosi(Zhu et al., 2018) e osteosclerosi (Ihde et al., 2011). Gli osteoclasti, come cellule end-differentiated derivate dal lignaggio mononucleato/macrofagico, sono le uniche cellule con funzione di riassorbimento osseo (Teitelbaum, 2000). Esistono due citochine chiave che partecipano alla differenziazione e alla maturazione degli osteoclasti (Koga et al., 2004): il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e l'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF media la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche in progenitori osteoclasti e promuove la differenziazione degli osteoclasti sovraregolando l'espressione del recettore RANK (Takayanagi, 2007). Il legame di RANKL e RANK sulla superficie cellulare dell'osteoclasto si traduce in quanto segue: (1) reclutamento di molecole adattatori di segnalazione come il fattore 6 associato al recettore del TNF (TRAF6); (2) attivazione di più bersagli a valle, tra cui NF-κB e chinasi proteiche attivate da mitogeni (MAPK); e (3) upregulation dei livelli di espressione del fattore nucleare delle cellule T attivate, citoplasmatico 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). L'attivazione di queste vie di segnalazione regola direttamente l'espressione dei geni degli osteoclasti, tra cui la fosfatasi acida 5 (Acp5) [che codifica per la fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAcP)], la metalloproteinasi 9 della matrice (MMP9) e la catepsina K (CTSK) (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Pertanto, l'inibizione delle vie di segnalazione correlate alla differenziazione degli osteoclasti indotte da RANKL è un potenziale metodo terapeutico per l'osteoporosi.

In questo studio, abbiamo mirato a determinare gli effetti del trattamento con CDP sull'ovariectomizzazione (OVX) indottaosteoporosimodello murino in vivo e sull'attività osteoclasta indotta da RANKL in vitro, con particolare attenzione all'espressione di geni osteoclast-specifici e all'attivazione di NFATc1 e delle vie di segnalazione NF-κB e MAPK. I nostri risultati possono fornire nuove informazioni sul potenziale della CDP come farmaco sicuro ed efficace per il trattamento dell'osteoporosi.

Per ulteriori informazioni si prega di contattare:Joanna.jia@wecistanche.com

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2. Materiali e metodi

2.1. Prodotti chimici e raccolta dei campioni

CD (n. 180801) è stato acquistato da Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Cina) e identificato dal professor Haibo Huang della School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Cina. Le compresse di estradiolo valerato sono state acquistate da Bayer (Leverkusen, Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania). Mezzo essenziale minimo alfa-modificato

(α-MEM) e siero bovino fetale (FBS) sono stati ottenuti da Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicillina/streptomicina e il kit di colorazione TRAcP sono stati acquisiti da Solarbio (Pechino, Cina). Il topo ricombinante M-CSF e il topo ricombinante RANKL sono stati pro-cured di R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Le piastre rivestite di idrossiapatite sono state acquistate da Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Gli anticorpi primari per NFATc1 e CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-α, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK e P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan-vers, MA, USA); e β-actina (CWBIO, Pechino, Cina) è stata ottenuta. Gli altri reagenti utilizzati in questo studio erano di grado analitico e l'acqua è stata purificata dal sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).

2.2. Estrazione CDP

Il CD è stato macinato in polvere fine e mescolato con etere di petrolio tre volte per sconfiggerlo. Il residuo solido è stato raccolto per filtrazione e quindi essiccato a temperatura ambiente. Lepolisaccaridisono stati estratti dai campioni pretrattati tre volte con acqua per 2 ore, concentrata, precipitata con l'aggiunta di etanolo anidro ad una concentrazione finale dell'80% (v/v), e conservati a 4 ◦C per 24 ore. I precipitati sono stati raccolti per centrifugazione a 3000 giri/min per 20 min, disciolti in acqua distillata e purificati (rimozione di proteine libere) utilizzando il metodo Sevag (Zhao et al., 2019). Il recuperatopolisaccaridisono stati dializzati, essiccati e conservati fino a nuovo utilizzo. Inoltre, i risultati della composizione chimica hanno mostrato che il contenuto totale di zucchero, acido uronico, solfato e proteine del CDP era 67,63 0,98%, 21,05 0,49%, 1,90 0,24% e 8,81 0,36%.

La composizione monosaccaride e l'analisi infrarossa della trasformata di Fourier di CDP sono state mostrate nelle Fig. 1 e 2 supplementari.

2.3. Modello murino di osteoporosi indotta da OVX

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato etico animale dell'Università di medicina cinese di Guangzhou (approvato SYXK 2019-0202). Trenta topi C57BL/6 di 6 settimane sono stati forniti dall'Experiment Animal Center dell'Università di Medicina Cinese di Guangzhou. Dopo l'acclimatazione per 1 settimana, a un gruppo di topi è stata somministrata un'operazione fittizia (gruppo Sham), mentre i restanti topi sono stati sottoposti a un'operazione di ovariectomia (gruppo OVX). Dopo l'intervento chirurgico, ai topi è stato permesso di recuperare per 1 settimana. Quindi, i topi modellati con successo sono stati divisi casualmente in 5 gruppi, con 6 topi per gruppo:

(1) Gruppo Sham: trattato con acqua distillata, (2) Gruppo OVX: trattato con acqua distillata, (3) Gruppo OVX E2 (E2): trattato con 0,13 mg/kg di estradiolo valerato compresse, (4) OVX CDP gruppo a basso dosaggio (CDP-L): trattato con 300 mg/kg di CDP, (5) OVX CDP ad alto dosaggio (CDP-H): trattato con 600 mg/kg di CDP. L'acqua distillata, E2 o CDP è stata somministrata da gavage una volta al giorno. Tutti i topi sono stati sacrificati dopo il periodo di trattamento di 12 settimane (Fig. 1A). Gli uteri sono stati raccolti e pesati e le tibie sinistre sono state raccolte per esami successivi. Sono stati raccolti campioni di sangue intero e centrifugati a 5000 giri/min per

15 min a 4 ◦C. I supernatanti sierici sono stati aspirati e conservati a

—80 ◦C fino ad ulteriore analisi.

2.4. Analisi della tomografia microcinetica (micro-TC) e istomorfometria ossea

Le tibie sinistre sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 48 ore e successivamente poste in tubi centrifughi contenenti soluzione salina normale. I campioni fissi sono stati scansionati con lo strumento micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgio) utilizzando le seguenti impostazioni: tensione, 80 kV; corrente di sorgente, 100 μA; Al, filtro da 0,5 mm; pixel

dimensioni, 9,76 μm; e passo di rotazione, 0,6◦. Diversi parametri del

l'osso trabecolare, compresa la densità minerale ossea (BMD), la frazione volumetrica ossea (BV/TV), la superficie ossea per volume totale (BS/TV), il numero trabecolare (Tb. N) e la spaziatura trabecolare (Tb. Sp) sono stati misurati utilizzando il software CT-Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Le immagini tridimensionali sono state generate utilizzando il software CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).

Dopo l'analisi micro-TC, le tibie sinistre sono state decalcificate in soluzione di EDTA al 14% e incorporate nella paraffina per il sezionamento. I campioni sono stati tagliati in sezioni da 5 μm utilizzando un microtomo prima degli esperimenti di colorazione ematossilina ed eosina (H & E) e TRAcP. Le sezioni macchiate sono state esaminate e documentate utilizzando il micro-telescopio Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Giappone).

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2.5. Analisi del siero

Le concentrazioni di calcio (Ca) e fosforo (P) sono state determinate secondo le istruzioni del kit progettate dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina). I livelli di TRAcP-5b e RANKL nel siero sono stati analizzati utilizzando rispettivamente il kit ELISA TRAcP-5b (CUSABIO, Wuhan, Cina) e il kit RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Cina).

2.6. Saggio di osteoclastogenesi in vitro

I BBM sono stati isolati dalla tibia e dal femore di topi C57BL/6 di 6 settimane. Le cellule isolate sono state coltivate in α-MEM contenente 25 ng/mL M-CSF, 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina. Al raggiungimento della confluenza, i BMM (1 104 cellule/pozzetto) sono stati seminati in piastre a 96 pozzetti e trattati con CDP in presenza di 50 ng/mL RANKL. Il mezzo e CDP sono stati sostituiti ogni 2 giorni. Dopo 7 giorni, le cellule sono state fissate con il 4% di paraformaldeide e colorate per la presenza di TRAcP. Il numero di osteoclasti, definiti come cellule TRAcP-positive con tre o più nuclei, è stato contato e documentato utilizzando un microscopio ottico.

2.7. Saggio di proliferazione cellulare

I BMM (1 × 104 cellule / pozzetto) sono stati seminati in una piastra a 96 pozzetti e incubati durante la notte. Successivamente, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 μg / mL) per 48 ore. La confluenza cellulare è stata rilevata e analizzata utilizzando IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), un sistema di imaging dinamico a lungo termine e in tempo reale.

2.8. Saggio di riassorbimento dell'idrossiapatite

I BMM (1 104 cellule/pozzetto) sono stati seminati in una piastra rivestita di idrossiapatite, trattati con CDP alle concentrazioni indicate (0, 5 e 10 μg/mL) e coltivati in α-MEM completo contenente 25 ng/mL M-CSF e 50 ng/mL RANKL. Dopo 7 giorni, le cellule sono state lavate con una soluzione di candeggina al 10% per rimuovere i componenti cellulari. Le immagini delle aree di riassorbimento dell'idrossiapatite sono state catturate utilizzando IncuCyte ZOOM® e analizzate utilizzando il software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).

2.9. Isolamento dell'RNA e analisi IN TEMPO REALE DELLA PCR quantitativa di trascrizione inversa (RT-qPCR)

I BMM (1 105 cellule/pozzetto) sono stati seminati in una piastra a 6 pozzetti e stimolati con RANKL e M-CSF in presenza di CDP a diverse concentrazioni (0, 5 e 10 μg/mL) per 5 giorni. L'RNA totale è stato isolato dalle cellule o dal tessuto osseo dei topi utilizzando il reagente TRIzol (Sigma-Aldrich). Il DNA complementare è stato sintetizzato da 2 μg di RNA totale utilizzando un kit di trascrittasi inversa (TransGen Biotech, Pechino, Cina). Le reazioni RT-qPCR sono state preparate utilizzando PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) e rilevate dal sistema ABI 7500 (Applicato

Biosistemi, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). I parametri ciclici per la PCR sono stati impostati come segue: 95 ◦C per 5 min, seguiti da 40 cicli di 95 ◦C per 15 s e 60 ◦C per 30 s. I primer specifici utilizzati sono mostrati nella Tabella 1 e la quantità di ciascun gene bersaglio è stata normalizzata a GAPDH (controllo interno).

2.10. Analisi western blot

I BMM (5 105 cellule/pozzetto) sono stati seminati in una piastra a 6 pozzetti. Per esperimenti a breve termine, le cellule sono state pre-incubate con le diverse concentrazioni di CDP (0, 5 e 10 μg / mL) per 1 ora, e quindi trattate con 50 ng / mL RANKL per 30 minuti. Per un lungo periodo di tempo, le cellule sono state stimolate con 50 ng / mL RANKL nei giorni 3, 5 e 7 in presenza di CDP (0, 5 e 10 μg / mL). Le proteine totali sono state estratte utilizzando il tampone di lisi RIPA (CWBIO). Le proteine sono state separate dal 10% di SDS-PAGE e trasferite alle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% a temperatura ambiente per 2 ore, incubate con primario

durante la notte a 4 ◦C, e poi con il corrispondente secondario

anticorpi per 1,5 h. Le membrane sono state sviluppate utilizzando reagenti ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) e le immagini sono state scattate utilizzando Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, Cina).

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2.11. Individuazione della traslocazione NFATc1 mediante test di immunofluorescenza

I BMM sono stati seminati su coverslip a 12 pozzetti, stimolati con RANKL e M-CSF e trattati con CDP da 10 μg/mL per 5 giorni. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti, lavate tre volte con PBS e permeabilizzate con 0,1% Triton X-100 per 10 minuti. Le cellule sono state miscelate con siero di capra al 10% (CWBIO) e incubate per 2 ore. Successivamente, le cellule sono state incubate con l'anticorpo primario durante la notte a 4 ◦C e poi con l'anticorpo secondario anti-topo di capra Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, USA) al buio per 1 ora. I coverslip sono stati lavati con PBS, montati in Prolong Gold Antifade Reagent con 4′, 6-diamidino-2-fenil in-dole (DAPI) (Solare), e

ispezionato utilizzando Zeiss LSM 800 con microscopio confocale Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania).

2.12. Analisi statistica

Tutti i dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando il software statistico SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). I dati per gli studi sugli animali e sulle cellule sono espressi rispettivamente come mezzi ± SEM e mezzi ± SD. I risultati utilizzano l'analisi unidirezionale della varianza o il t-test dello studente. Valori di p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

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