Parte 1 Rilevazione dei prodotti medicinali Cstanches Herba (Rou Cong Rong) utilizzando firme nucleotidiche specifiche per specie

Per maggiori informazioni si prega di contattare:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* e Shi-lin Chen 3

1 Laboratorio chiave di sostanze e risorse bioattive Utilizzo della medicina erboristica cinese, Ministero dell'Istruzione, Istituto per lo sviluppo delle piante medicinali, Accademia cinese di scienze medicinali e Collegio medicinale dell'Unione di Pechino, Pechino, Cina, 2 Alleanza di ricerca NHP, Istituto di biodiversità dell'Ontario (BIO ), Università di Guelph, Guelph, ON, Canada,

3 Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, China

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Cstanches Herbaè una pianta medicinale che ha proprietà disintossicanti ed è comunemente usata in Asia. A causa dello squilibrio tra domanda e offerta, gli adulteranti vengono spesso aggiunti a scopo di lucro. Tuttavia, non esiste un controllo normativo perché gli strumenti di controllo della qualità non sono sufficienti per identificare i prodotti pesantemente trasformati. Pertanto, è stato sviluppato un nuovo strumento molecolare basato su firme nucleotidiche e primer specie-specifici. Le regioni ITS2 da 251Cstanches Herbae campioni adulteranti sono stati sequenziati. Sulla base dei siti SNP, sono state sviluppate quattro firme nucleotidiche entro 30~37 bp e sei primer specie-specifici, che sono stati convalidati da miscele sperimentali artificiali costituite da sei specie diverse e rapporti diversi. Questo metodo è stato applicato anche per rilevare 66Cstanches Herbaprodotti sul mercato, inclusi estratti e medicinali brevettati cinesi. I risultati hanno dimostrato l'utilità delle firme dei nucleotidi nell'identificazione degli adulteranti nelle miscele. Lo studio di mercato ha rivelato il 36,4% di adulterazione: il 19,7% riguardava l'adulterazione con Cynomorium songaricum oCistancheSinensis, e il 16,7% prevedeva la sostituzione con Cy. songaricum, Ci. sinensis o Boschniakia rossica. I risultati hanno anche rivelato che Cy. songaricum era l'adulterante più comune sul mercato. Pertanto, raccomandiamo l'uso di firme nucleotidiche specie-specifiche per regolare l'adulterazione e verificare la garanzia di qualità delle catene di approvvigionamento dei medicinali, in particolare per i prodotti trasformati il ​​cui DNA è degradato.

Parole chiave: Cstanches Herba, medicina brevettuale cinese, firma nucleotidica, DNA degradato, controllo di qualità della medicina

INTRODUZIONE

Cstanches Herba(Rou Cong Rong) è un noto medicinale registrato nella Farmacopea in Asia (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015; Japan Pharmacopeial Convention, 2016); questo medicinale è derivato dagli steli succulenti essiccati diCistanche deserticheYC Ma oCistanche tubulosetonico, in quanto non è tossico e può essere assunto per lunghi periodi di tempo (Li et al., 2016). Inoltre,CistanceHerba è stato insignito dell'onore di essere chiamato "Ginseng del deserto" per via del suo grande valore medicinale, soprattutto nel rafforzamento della funzione sessuale maschile (Zhang e Su, 2014; Gu et al., 2016). Ci sono più di 100 farmaci brevettati cinesi registrati nella Chinese Pharmacopoeia Commission (2015) e in altri standard ufficiali promulgati locali (Wang et al., 2012). Con l'aumento della popolazione degli anziani, c'è una notevole domanda diCstanches Herbae i suoi medicinali. Tuttavia, le risorse di materie prime stanno diventando sempre più scarse. Infatti le due specie originarie diCstanches Herbasono state aggiunte al China Plant Red Data Book come piante selvatiche protette dallo stato (categoria II) (Fu, 1991). I materiali medicinali sul mercato sono coltivati ​​principalmente nella Cina nord-occidentale.

A causa del notevole squilibrio tra domanda e offerta diCistanceHerba, molti adulteranti sono entrati nel mercato; questi adulteranti non sono coerenti con gli standard e possono minacciare la sicurezza dei farmaci. Gli adulteranti noti includono i gambi succulenti essiccati di Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang in cinese),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan e Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Questi adulteranti hanno caratteristiche morfologiche simili a quelle diCistanceHerba, rendendo difficile l'identificazione tassonomica tradizionale, in particolare dopo che il materiale è stato trasformato in medicinali. L'identificazione microscopica non è disponibile perchéCistanceErbanon ha caratteristiche microscopiche definitive o uniche. Gli attuali strumenti di chimica analitica non sono sufficienti per rilevare l'adulterazione di Cstanches Herba perché esistono composti simili anche all'interno dei noti adulteranti Ci. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) e Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Pertanto, lo sviluppo di un metodo molecolare rapido per l'autenticazione di Cistanches Herba e dei suoi prodotti è urgentemente necessario per adeguati sistemi di controllo della qualità nella medicina brevettuale cinese e in altre industrie di medicinali.

Chen et al. per primo ha suggerito lo spaziatore interno trascritto 2 (ITS2) come codice a barre universale per piante medicinali (Chen et al., 2010). Sole et al. verificato la regione ITS2 come codice a barre del DNA preferibile per l'identificazioneCistanceHerba e i suoi adulteranti (Sun et al., 2012). Tuttavia, ITS2 non può essere utilizzato per distinguere la medicina brevettuale cinese dal DNA degradato. Recentemente, un numero crescente di studi ha dimostrato che il "mini codice a barre" è un metodo utile per amplificare il DNA degradato (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Tuttavia, le firme dei nucleotidi sono più appropriate dei mini codici a barre, poiché i primi si riferiscono a uno o più nucleotidi che sono unici per una specie e possono essere efficacemente utilizzati da molte tecniche molecolari, come sonde di DNA, microfluidica e amplificazione isotermica mediata da loop ( de Boer et al., 2015). Han et al. ha sviluppato firme nucleotidiche per Panax ginseng, Angelica Sinensis e Lonicera japonica e ha identificato con successo i farmaci brevettati cinesi associati (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

prodotti funzionali contenentiCistanceErba. In particolare, abbiamo (1) sviluppato quattro firme nucleotidiche e sei coppie di primer specifici per differenziare l'autenticoCistanceHerba e noti adulteranti, (2) hanno convalidato le quattro firme nucleotidiche in esperimenti che includevano miscele di note tassonomiche utilizzate per preparare i prodotti Cstanches Herba che contengono ingredienti sia autentici che adulterati e (3) hanno condotto un'indagine di mercato su 66CistanceProdotti Herba attraverso le loro firme nucleotidiche.

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MATERIALI E METODI

Raccolta e preparazione dei campioni

In totale, sono stati raccolti 251 campioni dalla Mongolia Interna, dallo Xinjiang e dal Ningxia, tra le altre aree; questi campioni includevano 214Cstanches Herbae 37 adulteranti e sono dettagliati nella tabella supplementare S1. I campioni di voucher corrispondenti sono stati convalidati dai tassonomi e depositati nell'erbario dell'Istituto per lo sviluppo delle piante medicinali, Accademia cinese delle scienze mediche, Pechino, Cina. Un totale di 35 lotti di polveri, spezie ed estratti diCistanceHerba sono stati acquistati da negozi online e farmacie di mattoni e malta a Pechino e Chengdu (Tabella 1). In totale, 31 lotti di medicina brevettuale cinese contenentiCistanceHerba è stato acquistato da diverse farmacie (Tabella 2) e le composizioni dichiarate di diversi farmaci brevettati cinesi sono mostrate nella Tabella Supplementare S3. Le diverse caratteristiche morfologiche delle diverse forme di dosaggio sono mostrate nella Figura 1.

Campioni misti: Polveri di Ci.desertico, Ci.tubulosa, Ci. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica e O. coerulescens sono stati miscelati artificialmente in diverse combinazioni (in un rapporto di 1:1) prima dell'estrazione. I dettagli di questi campioni misti sono mostrati nella legenda della Figura 3. Inoltre, le polveri di quattro adulteranti sono state mescolate con il Ci autentico. deserticola a diversi rapporti di peso: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 e 60000:1 (Tabella 3). E i due prodotti genuini si mescolano nelle stesse proporzioni.

Decotto: Fette di Ci. deserticola e Cy. songaricum veniva usato per preparare il decotto. Le fette (10 g) sono state bollite in 300 mL di acqua bidistillata per 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 minuti e quindi utilizzate per l'estrazione del DNA.

Estrazione del DNA, amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR) e sequenziamento

Campioni, decotto e campioni misti: i campioni (40-50 mg) sono stati macinati in polveri fini tramite un mulino miscelatore da laboratorio Retsch MM400 (Retsch Co., Germania) a una frequenza di 30 Hz. Il DNA genomico è stato successivamente estratto con un kit Plant Universal Genomic DNA (Tiangen Biotech Beijing Co., Cina) secondo le istruzioni del produttore. ITS2 è stato amplificato dai primer universali 2F/3R (Chen et al., 2010).

in parallelo per lotto. La polvere di medicina brevettuale cinese è stata lavata con 700 µL di tampone di prelavaggio [Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; acido etilendiamminotetraacetico 20 mM (EDTA), pH 8,0;

700 mM NaCl; 2% di polivinilpirrolidone (PVP)-40; e 0,4 percento -mercaptoetanolo] più volte fino a quando il supernatante era limpido e incolore, dopodiché la miscela è stata centrifugata a 7500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Il precipitato è stato successivamente utilizzato per estrarre il DNA genomico tramite il kit Plant Universal Genomic DNA (Tiangen Biotech Beijing Co.) secondo le istruzioni del produttore. Alla fine, il DNA di ciascun lotto è stato concentrato in una provetta. Sei coppie di primer specie-specifiche: SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR e LDF/LDR sono stati progettati tramite Primer Premier

6.0 software (Premier Co., Canada) per amplificare Cistanches Herba e i suoi adulteranti (i dettagli sono mostrati nella Tabella 4). La PCR è stata eseguita in una reazione di 50 µL di volume contenente 1 µL di

KOD FX (Toyobo Co., Giappone), 25 μL di 2 × tampone PCR, 10 μL di dNTP (2 mM), 1,5 μL di ciascun primer (10 μM) e 4 μL (∼50 ng) di modello di DNA; il volume rimanente era costituito da acqua bidistillata. Le reazioni sono state eseguite da

un termociclatore (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA); i programmi termici sono elencati nella Tabella 4. I prodotti della PCR sono stati esaminati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 3% e purificati per il sequenziamento bidirezionale con un sequenziatore ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) secondo il metodo di sequenziamento Sanger. Quindi, la sensibilità dei sei primer è stata testata tramite il dosaggio quantitativo PCR in tempo reale (qRT-PCR) con un sistema in tempo reale CFX96 (Bio-rad Lab., USA). Le soglie del ciclo sono state calcolate automaticamente dal sistema tramite il modello "PCR Baseline Subtracted Curve Fit". qRT-PCR è stata eseguita in una reazione di 15 µL di volume contenente 7,5 µL di SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Giappone), 1.0 µL di ciascun primer (10 µM) e 1,0 µL di stampo di DNA con il volume rimanente costituito da acqua bidistillata. La qRT-PCR è stata eseguita con tre repliche tecniche in base alle quali è stato calcolato l'errore standard.

Analisi della sequenza: le sequenze sono state modificate e assemblate manualmente tramite CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA).

Le sequenze ITS di GenBank sono state annotate tramite il modello Hidden Markov (HMM) per ottenere le sequenze ITS2 (Keller et al., 2009). Le sequenze sono state quindi allineate dal software MEGA 5.0 tramite il metodo di allineamento "Muscle" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

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RISULTATI

Sviluppo di firme nucleotidiche e coppie di primer specifici per specie per cistanches Herba e Adulterants

Le percentuali di successo dell'amplificazione PCR e del sequenziamento dei 251 campioni erano del 100 percento quando è stata utilizzata la coppia di primer 2F/3R. La lunghezza allineata del Cy. le sequenze di songaricum ITS2 erano 229 bp (Figura supplementare S1). L'analisi delle sequenze delle specie di erbario e di quelle di specie strettamente correlate recuperate da GenBank (Tabella Supplementare S2) ha rivelato due siti di polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) per Cy. songarico. Sulla base degli SNP, un Cy. è stata sviluppata la firma del nucleotide bp specifica di songaricum 30- (5'-caattattg aggtgcattg taagaagcgt-3') (Figura 2A). I risultati dello strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST) in NCBI hanno dimostrato che questa firma nucleotidica era unica per Cy. songaricum (Tabella 5). Con un'analisi simile delle sequenze di specie strettamente correlate, sono stati scoperti da uno a due SNP da Ci. sinensis, B. rossica e O. coerulescens. Sulla base degli SNP, anche le firme nucleotidiche per gli altri tre adulteranti sono state sviluppate in modo simile, inclusa una firma di 34 bp (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) per Ci. Sinensis, una firma di 37 bp (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') per B. rossica e una firma di 31 bp (5′-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg g-3′) per O. coerulescens (Figure 2BD). L'analisi BLAST in NCBI ha anche rivelato che queste firme nucleotidiche erano specifiche e non presenti in nessun'altra specie (Tabella 5).

Cstanches Herbae i suoi adulteranti potrebbero essere amplificati simultaneamente dalle miscele tramite la coppia di primer universali 2F/3R. Pertanto, abbiamo progettato primer specie-specifici per l'amplificazione della firma nucleotidica allineando le sequenze ITS2. Quattro coppie di primer specifici - SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR e LDF/LDR - sono state progettate per amplificare le firme nucleotidiche di Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis e O. coerulescens, rispettivamente (Tabella 4). Le lunghezze degli ampliconi erano rispettivamente di 123, 72, 131 e 71 bp.

Inoltre, sono state analizzate un totale di 214 sequenze ITS2 da materiali sperimentali di Cistanches Herba. Due primer specifici brevi: HMRCF/HMRCR e GHRCF/GHRCR per Ci. deserticola e Ci. tubulosa, rispettivamente, sono stati progettati per amplificare le brevi regioni dei campioni degradati (Tabella 4). Le lunghezze degli ampliconi erano rispettivamente di 132 e 134 bp.

Convalida della firma nucleotidica e del metodo di primer specifico per specie basato su miscele artificiali e decotto

Le efficienze di amplificazione delle nuove coppie di primer sono state convalidate dalla miscela. I prodotti della PCR sono stati ottenuti tramite ciascuna coppia di primer per ciascuna specie mirata, come mostrato

cq valori di B. rossica o O. coerulescens potrebbero essere ottenuti anche la proporzione di campioni era 30000:1 o 40000:1, e i risultati di amplificazione di Ci. sinensis, Ci.tubulosa, e Ci deserticola potrebbe essere rilevato quando il rapporto era 20000:1. Ma non è stato possibile ottenere risultati rilevabili per Cy. songaricum quando costituiva la proporzione di 20000:1.

Per verificare se il metodo della firma del nucleotide funziona con i materiali lavorati, i decotti di Ci. deserticola e Cy. songaricum sono stati preparati. I risultati hanno mostrato che il codice a barre corto di Ci. deserticola potrebbe essere amplificato, anche dopo che i campioni sono stati bolliti per 210 min. Inoltre, la firma nucleotidica di Cy. songaricum potrebbe essere amplificato dopo che i campioni sono stati bolliti per 150 minuti, mentre nessun prodotto PCR è stato rilevato dopo che i campioni sono stati bolliti per 210 o 240 minuti (Figura 4). I risultati del sequenziamento hanno dimostrato che la firma del nucleotide corto è stata ottenuta con successo dal decotto.

Indagine di mercato sull'adulterazione tramite firma nucleotidica e primer specifici

Il metodo di cui sopra è stato applicato per la rilevazione diCistanceI prodotti Herba sul mercato. Trentacinque lotti diCistanceLe fette, le polveri e gli estratti di Herba sono stati amplificati e sequenziati utilizzando sei primer specifici progettati (i risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio sono mostrati nella figura supplementare S2 e le sequenze sono elencate nella scheda dati supplementare 1). L'analisi delle sequenze tramite le loro firme nucleotidiche ha rivelato che cinque lotti di fette erano autentici. Un lotto di fette e un lotto di polvere sono stati sostituiti con Cy. songaricum e un estratto sono stati sostituiti con Ci. sinensis. Gli altri sei lotti di polveri erano miscele: cinque sono state adulterate con Cy. songaricum e Ci. sinensis e uno sono stati adulterati con Cy. songaricum (Tabella 1). Inoltre, un lotto di fette è stato sostituito con Salvia miltiorrhiza.

Il Cistanches Herba nei medicinali brevettati cinesi è soggetto a vari processi che rendono difficile l'autenticazione. È stata testata la capacità delle sei coppie di primer di amplificare le regioni della firma nucleotidica specie-specifiche dei medicinali brevettati cinesi (i risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio sono mostrati nella Figura S2 supplementare). La maggior parte dei medicinali brevettati cinesi contiene componenti di diversi tipi di specie. Ad esempio, le pillole Shihu Yeguang (ZCY34) contengono 25 ingredienti, tra cui Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) e Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Da questi ingredienti, Cistanches Herba potrebbe essere amplificato in modo specifico tramite la coppia di primer GHRCF/GHRCR. Il sequenziamento diretto dei prodotti PCR ha rivelato tracce molto pulite. Tuttavia, non è stato possibile ottenere una banda visibile con la coppia di primer HMRCF/HMRCR.

Un altro esempio sono le pillole Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). Ci sono otto ingredienti in aggiunta aCistanceHerba in questo medicinale brevettato cinese, ma non c'erano bande visibili ottenute né da GHRCF/GHRCR né da HMRCF/HMRCR, il che significava che nessunCstanches Herbaera presente. Tuttavia, la regione adulterante di Cy. songaricum è stato amplificato con successo dalla specifica coppia di primer SYF1/SYR1. I risultati del sequenziamento hanno dimostrato la breve firma nucleotidica di Cy. songaricum è stato ottenuto con successo.

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