Parte 1: l'echinacoside induce la morte delle cellule tumorali apoptotiche inibendo l'enzima disinfettante del pool di nucleotidi MTh1

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Astratto:L'inibizione dell'enzima disinfettante del pool di nucleotidi MTH1 provoca ampi danni ossidativi al DNA e apoptosi nelle cellule tumorali e quindi può essere utilizzata come strategia antitumorale. Poiché i prodotti naturali sono stati una ricca fonte di sostanze chimiche medicinali, nel presente studio abbiamo utilizzato la reazione enzimatica catalizzata da MTH1- come test di screening in vitro ad alto rendimento per cercare composti naturali in grado di inibire l'MTH1.Echinacoside, un composto derivato dalle piante medicinaliCistancheed Echinacea, in un saggio in vitro hanno efficacemente inibito l'attività catalitica dell'MTH1. Trattamento di varie linee cellulari tumorali umane conEchinacosideha determinato un aumento significativo del livello cellulare di guanina ossidata ({0}}oxoguanina), mentre il livello di specie reattive dell'ossigeno cellulare è rimasto invariato, indicando cheEchinacosideha anche inibito l'attività dell'MTH1 cellulare. Di conseguenza, il trattamento con echinacoside ha indotto un aumento immediato e drammatico dei marcatori di danno al DNA e la sovraregolazione dell'inibitore G1/S-CDK p21, che sono stati seguiti da marcata morte cellulare apoptotica e arresto del ciclo cellulare nel cancro ma non nelle cellule non cancerose. Presi insieme, questi studi hanno identificato un composto naturale come un inibitore dell'MTH1 e suggeriscono che i prodotti naturali possono essere un'importante fonte di agenti antitumorali.

Parole chiave: Echinacoside, MTH1, 8-oxoG, danno al DNA, apoptosi, arresto del ciclo cellulare

Cistancheestratto haanticancrobenefici alla salute

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introduzione

Il pool di nucleoside trifosfato (NTP) e deossinucleoside trifosfato (dNTP) cellulare e mitocondriale è un bersaglio significativo di varie specie reattive dell'ossigeno (ROS).1–3 Poiché la specificità delle DNA polimerasi è meno che perfetta,4,5 i dNTP ossidati possono essere incorporati nel DNA di nuova sintesi per causare aberrazioni genetiche se non corretti.6 Ad esempio, la principale base ossidata nel pool di nucleotidi, 8-oxoguanina (8-oxoG), può accoppiarsi con citosina e adenina. Se inserito nell'adenina opposta durante la replicazione del DNA, può potenzialmente causare la trasversione di T: A {7}} G: C,7 che è una delle mutazioni più comuni riscontrate nei tumori umani.8,9 Sebbene la maggior parte dei dNTP liberi ossidati vengono rimossi dagli enzimi igienizzanti del pool nucleotidico, studi in passato hanno rivelato che il pool nucleotidico è ancora un'importante fonte di basi ossidate nelle molecole di DNA e contribuisce in modo significativo ai danni ossidativi del DNA.3,10 l'enzima più importante per la sanificazione del nucleotide pool.15 Tuttavia, anche sotto la sorveglianza degli enzimi igienizzanti del pool di nucleotidi, una porzione significativa di dNTP ossidati viene incorporata nel DNA e le basi nelle molecole di DNA possono anche essere ossidate direttamente dai ROS.6 Le cellule si basano quindi su strategie più elaborate che coinvolgono vari Glicosilasi del DNA, come OGG1 e MUTYH, e processi di riparazione del DNA, inclusa la riparazione dell'escissione della base (BER) e la riparazione del mismatch (MMR), per fissare le basi problematiche nelle molecole di DNA.10,16,17 BER a nd L'MMR normalmente ripara numerose basi ossidate nel DNA al giorno e quindi svolge un ruolo importante nella protezione dell'integrità e della stabilità del genoma.

Nelle cellule che sono sotto stress ossidativo elevato, una maggiore incorporazione di nucleotidi ossidati nel DNA può sopraffare la capacità di riparazione cellulare e innescare la risposta al danno del DNA (DDR).18 La segnalazione DDR persistente porterà all'arresto del ciclo cellulare, alla senescenza cellulare prematura oapoptosi, ponendo così una barriera alla tumorigenesi.19 Tuttavia, sebbene le cellule tumorali mostrino una tensione ossidativa altamente aumentata e generino un carico potenzialmente letale di nucleotidi ossidati,20 possono sopravvivere alla senescenza oapoptosi.21 Un gran numero di studi ha dimostrato che l'MTH1, rimuovendo efficacemente 8-oxodGTP e 2-OH-dATP nelle cellule tumorali, svolge un ruolo chiave nello sviluppo del cancro.22 MTH1 era trovato sovraespresso in diversi tipi di cancro,23–25 e 8- livelli di oxoG e l'estensione delle lesioni ossidative del DNA era inferiore nei tumori rispetto ai tessuti normali circostanti.26–28 Funzionalmente, la sovraespressione di MTH1 si è ridotta significativamente il numero di mutazioni del DNA osservate nei fibroblasti embrionali di topo carenti di MMR10 e hanno consentito alle cellule di superare la senescenza e l'apoptosi cellulare prematura indotta da Ras oncogenica;29 mentre la soppressione dell'MTH1 ha impedito lo sviluppo del cancro nei topi con deficit di OGG1-30 e promosso DDR indotta da ROS e senescenza cellulare nelle cellule trasformate da Ras.3,29,31 Pertanto, sebbene MTH1 svolga un ruolo protettivo prevenendo le mutazioni indotte da ROS nelle cellule sane, questi studi hanno scoperto che MTH1 è particolarmente richiesto per l'emergenza e la sopravvivenza delle cellule tumorali. Studi recenti hanno fornito ulteriori prove a sostegno del ruolo di MTH1 nello sviluppo del cancro.31-34 La soppressione di MTH1 da parte di RNAi o inibitori di piccole molecole in varie linee cellulari tumorali ha comportato un marcato aumento dell'incorporazione di 8-oxo d G nel DNA genomico , portando a danni estesi al DNA, morte cellulare apoptotica e ridotta sopravvivenza delle cellule tumorali.32,33 Negli studi sullo xenotrapianto di topi, l'inibizione di MTH1 ha soppresso in modo efficiente la crescita degli espianti di cancro. È importante sottolineare che la soppressione dell'MTH1 non ha influenzato la crescita e la sopravvivenza delle cellule normali, probabilmente perché le cellule normali hanno ROS più bassi e quindi sono meno dipendenti dall'MTH1 per la sopravvivenza.32,33 Questi risultati suggeriscono che l'inibizione dell'MTH1 è una nuova promettente strategia per combattere il cancro.

I prodotti naturali sono stati una ricca fonte di composti medicinali.35 Molte moderne terapie, compresi i farmaci antitumorali, sono state derivate da preparazioni a base di erbe o botaniche.36–39 Tuttavia, un gran numero di erbe tradizionali ha proposto di possedere varie proprietà terapeutiche per rimanere da caratterizzare, in gran parte a causa delle difficoltà nel controllare le loro composizioni per definirne inequivocabilmente l'efficacia ei meccanismi d'azione.40 Sono necessari nuovi approcci che consentano la rilevazione di composti attivi e l'analisi dei meccanismi molecolari. A questo proposito, lo screening in vitro ad alto rendimento mirato può essere determinante per trovare composti medicinali definiti meccanicamente dalle risorse naturali. Nel presente studio, abbiamo utilizzato la reazione enzimatica catalizzata da MTH1- come test in vitro ad alto rendimento per cercare composti naturali che possono inibire l'MTH1. Sorprendentemente, la proiezione lo ha rivelatoEchinacoside, un prodotto naturale noto soprattutto per la sua potente attività antiossidante, è in grado di inibire l'MTH1.

Echinacosidein cistance puòanti-apoptosi

Materiali e metodi

Materiali

I composti naturali a base di erbe sono stati acquistati da Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Repubblica popolare cinese. Il nome, il numero di catalogo, il numero di registro del Chemical Abstracts Service (CAS) e la purezza di ciascun composto sono elencati nella Tabella S1. Le soluzioni madre dei composti sono state preparate in dimetilsolfossido al 100% (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) e le soluzioni di lavoro sono state preparate in tampone di analisi o mezzo di coltura cellulare completo. La stessa soluzione senza il composto di prova ma contenente la stessa quantità di DMSO è stata utilizzata come controllo del veicolo. (S)-crizotinib è stato acquistato da Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

screening in vitro

Il test enzimatico in vitro utilizzato per lo screening dei composti vegetali naturali ha seguito le procedure descritte da Gad et al.32 In breve, sono state preparate diluizioni seriali dei singoli composti nel tampone del test costituito da 100 mM Tris- acetato (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg acetato, 0,005 percento Tween 20 e 1 mM DTT. Successivamente, sono stati aggiunti 0,5 nM umano MTH1 ricombinante (Abcam, Cambridge, Regno Unito), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e 0,2 U/mL pirofosfatasi inorganiche (Thermo Fisher Scientific) e le piastre sono state incubate su uno shaker per 1 ora a temperatura ambiente. Il volume di reazione finale era di 100 μL in una 96-piastra a pozzetti. Al termine della reazione è stato aggiunto verde malachite (J&K Scientific, Pechino, Repubblica popolare cinese)41 e le piastre sono state incubate a temperatura ambiente per altri 15 minuti. L'assorbanza a 630 nm è stata misurata da un lettore di micropiastre BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). I valori di concentrazione inibitoria (IC50) sono stati determinati mediante analisi di regressione non lineare utilizzando il software GraphPad Prism.

coltura cellulare

L'osteosarcoma umano MG-63, l'epatocarcinoma SK-HEP-1, il cancro al seno MCF7, il cancro del colon-retto SW480, il rene embrionale HEK293 e le linee cellulari di fibroblasti NIH/3T3 di topo provenivano da American Type Culture Collection e le linee cellulari umane normali la linea cellulare epatica L-O2 è stata acquistata da KenGen Biotech, Nanchino, Repubblica popolare cinese. Queste celle sono state mantenute a 37 gradi in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2, seguendo le istruzioni fornite dai fornitori. Nessuna dichiarazione etica è stata richiesta dal comitato di revisione istituzionale per l'uso di queste linee cellulari.

La misurazione dei livelli intracellulari di {{0}}oxo Intracellulare 8-oxoG è stata misurata mediante colorazione con avidina coniugata con Cy3-.42 Sono state rilevate 1 × 104 cellule in totale. seminato su un vetrino coprioggetto rotondo in 12-piastre a pozzetti. Il giorno successivo, le cellule sono state trattate con echinacoside 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM o 80 μM per 5 ore, 12 ore o 24 ore e quindi fissate con ghiaccio -metanolo freddo per 20 minuti, seguito da incubazione in soluzione fisiologica tamponata con Tris (TBS) con 0,1 percento di Triton X-100 (Sigma-Aldrich) per 15 minuti. I campioni sono stati bloccati in TBS con lo 0,1% di Triton X-100 e il 15% di siero bovino fetale per 1 ora a temperatura ambiente e quindi colorati con avidina coniugata con Cy3-(0,5 ug/mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) in soluzione bloccante per 1 ora a 37 gradi. Dopo il lavaggio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 3 volte per 5 minuti, i vetrini coprioggetto sono stati sigillati su vetrini protettivi per insetti con mezzo di montaggio con 4′,{37}}diamidino-2-fenilindolo (Vector Laboratories, Burlingame, CA , STATI UNITI D'AMERICA). Le immagini sono state acquisite e analizzate da un microscopio confocale Zeiss LCM 510.

La misurazione dei livelli di ROS intracellulari di Ros è stata misurata mediante citometria a flusso utilizzando un kit di test ROS basato su cellule (Beyotime Biotechnology, Haimen, Repubblica popolare cinese). Le cellule cresciute in piastre a sei pozzetti sono state trattate con 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM o 80 μM di echinacoside per 5 ore, 12 ore o 24 ore, lavate due volte con PBS e incubate con 10 μM diclorofluoresceina diacetato per 30 minuti a 37 gradi. Le cellule sono state quindi tripsinizzate e analizzate dal citometro a flusso FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). I livelli intracellulari di ROS sono stati espressi come l'intensità media della fluorescenza della diclorodiidrofluoresceina delle cellule. I numeri mostrati erano medie di tre esperimenti indipendenti.

Colorazione immunofluorescente

Le cellule cresciute su vetrini coprioggetto sono state trattate con {0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM o 80 μM Echinacoside per 5 ore, 12 ore o 24 ore e quindi lavate una volta con PBS, fissate con 4% di paraformaldeide in PBS per 20 minuti e bloccato in TBS con 0,1% di Triton X-100 e 15% di siero bovino fetale per 1 ora a temperatura ambiente. Le cellule fisse sono state colorate per 2 ore a temperatura ambiente con un anticorpo primario contro 8-oxoG (topo monoclonale anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (coniglio anti{20}}BP1; Beethyl Laboratories, Montgomery , TX, USA) o una caspasi attiva-3 (anti-caspasi di coniglio-3, Bioss, Pechino, Repubblica popolare cinese), seguita dalla colorazione con un 488-antitopo d'asino coniugato con Alexa ( Abcam) o Cy{26}}anticorpo secondario anti-coniglio di capra coniugato (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio in PBS 3 volte per 5 minuti, i vetrini coprioggetto sono stati sigillati su vetrini in VECTASHIELD Mounting Medium con DAPI (Vector Laboratories). Le immagini sono state riprese da un microscopio confocale Zeiss LCM 510.

test di formazione delle colonie

Il giorno prima del trattamento, le cellule sono state seminate in una piastra a sei pozzetti a una concentrazione di 1×1{3}}4 cellule per pozzetto. Sono stati quindi trattati con 0 μM, 60 μM o 80 μM di echinacoside per 7 giorni. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state fissate con metanolo ghiacciato e colorate con una soluzione di cristalvioletto (Sigma-Aldrich) (0,5% in 25% di metanolo). Le immagini sono state fotografate dopo aver asciugato le lastre durante la notte. I cristalli di cristalvioletto sono stati disciolti aggiungendo il 70 percento di etanolo e l'assorbanza a 595 nm è stata misurata con un lettore di micropiastre BioRad 680. I dati sono stati analizzati utilizzando il software GraphPad Prism.

Saggio MTT

Un giorno prima del trattamento, le cellule sono state seminate in 96-piastre a pozzetti a una concentrazione di 1 × 104 cellule per pozzetto, seguite dal trattamento con diluizioni seriali di echinacoside per 24 o 48 ore, o con 60 μM di echinacoside per 5 ore, 12 ore , o 24 ore. Il mezzo è stato rimosso e le cellule sono state lavate con PBS, quindi 20 μL di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,{{15} A ciascun pozzetto è stata aggiunta una soluzione di bromuro di difenil tetrazolio (MTT) (5 mg/mL in PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific). Le piastre sono state incubate a 37 gradi per altre 4 ore. Alla fine, la soluzione MTT è stata rimossa e in ciascun pozzetto sono stati aggiunti 150 μL di DMSO. Le piastre sono state incubate su un agitatore per piastre per 10 minuti e l'assorbanza a 570 nm è stata misurata da un lettore di micropiastre BioRad 680. Ogni esperimento è stato condotto due volte in triplicato. I dati sono stati analizzati utilizzando il software GraphPad Prism. I valori di IC50 sono stati determinati utilizzando l'analisi di regressione non lineare.

analisi del ciclo cellulare

Le cellule in piastre a sei pozzetti sono state trattate con 0 μM, 6{{10}} μM o 80 μM di echinacoside per 24 ore, raccolte con tripsina (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , lavato due volte con PBS e quindi fissato con etanolo ghiacciato (70 percento) per 2 ore a -20 gradi. Le cellule fisse sono state lavate due volte in PBS freddo e risospese in 300 μL di PBS appena preparato con 0,1 percento di Triton X-100, 0,2 mg/mL di RNasi A priva di DNasi (Sigma-Aldrich), 10 ug/mL di ioduro di propidio ( PI) (Hoffman-La Roche SA, Basilea, Svizzera). Dopo incubazione a 37 gradi al buio per 20 minuti, le cellule sono state filtrate attraverso una rete di nylon Falcon (BD Biosciences), caricate sul citometro a flusso FAC-SCalibur e analizzate utilizzando il software ModFit (BD Biosciences).

Analisi della frammentazione del DNA

Le cellule cresciute in piastre a sei pozzetti sono state trattate con 0 μM, 60 μM o 80 μM di echinacoside per 24 ore e fissate in paraformaldeide ghiacciata al 4% (Sigma-Aldrich) per 20 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state sigillate in VECTASHIELD Mounting Medium con DAPI (Vector Laboratories). La morfologia nucleare è stata fotografata con un microscopio a fluorescenza Olympus. Per rilevare la frammentazione del DNA sui gel di agarosio, il DNA è stato estratto utilizzando il micro kit QIAamp DNA (Qiagen NV, Venlo, Paesi Bassi) ed è stata eseguita l'elettroforesi su gel di agarosio al 2% contenenti 0,1 ug/mL di bromuro di etidio.

Analisi dell'apoptosi mediante citometria a flusso Le cellule apoptotiche sono state esaminate utilizzando un kit di rilevamento dell'apoptosi con annessina V-FITC (Bestbio, Shanghai, Repubblica popolare cinese), seguendo le istruzioni del produttore. Le cellule cresciute in 96-piastre a pozzetti sono state trattate con 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM o 160 μM Echinacoside per 2 ore, 5 ore, 12 ore o 24 ore, lavato due volte con PBS e poi risospeso in un buffer di legame. Successivamente, sono stati aggiunti in sequenza 5 μL di annessina V-FITC e 5 μL di PI (Roche) e le cellule sono state incubate per 15 minuti al buio a temperatura ambiente. Le cellule sono state caricate sul citometro a flusso FACSCalibur (BD Biosciences) e i dati sono stati analizzati utilizzando il software Cell Quest (BD Biosciences).

Analisi Western blot

Le cellule cresciute in piastre a sei pozzetti sono state trattate con 0 μM, 6{{10}} μM o 80 μM di echinacoside per 5 ore, 12 ore o 24 ore, lavato due volte con PBS e raschiato via dalla piastra utilizzando 100 μL di tampone di radioimmunoprecipitazione (NaCl 150 mM, 1,0 percento di IGEPAL CA-630, 0,5 percento di desossicolato di sodio, 0,1 percento di dodecil solfato di sodio e Tris 50 mM, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) contenente fluoruro di fenilmetano sulfonil 1 mM. I campioni sono stati centrifugati a 12,{22}}× g per 20 minuti a 4 gradi . Le concentrazioni proteiche nei supernatanti sono state determinate dal reagente Bradford (Dingguo, Changchun, Repubblica popolare cinese). I campioni sono stati denaturati a 95 gradi per 10 minuti e separati su gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 12%. Dopo l'elettroforesi, le proteine ​​sono state trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene (Millipore), seguite dal blocco in soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (Tris 10 mM, pH 7,5; NaCl 100 mM; Tween 20 0,1 percento) contenente il 5 percento (p/v) latte scremato per 1 ora a temperatura ambiente. Le macchie sono state analizzate con anticorpi primari contro p21 (Abcam), poli (ADP-ribosio) polimerasi (Bioss) o caspasi attivata-3 (Bioss), seguiti da anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (Jackson ImmunoResearch Laboratories). I segnali sono stati sviluppati utilizzando il kit di rilevamento Western blotting a chemiluminescenza potenziato (Transgen Biotech, Changchun, Repubblica popolare cinese). Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.

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Misurazione del mitocondriale

potenziale di membrana

Il potenziale della membrana mitocondriale è stato misurato utilizzando il colorante JC{{0}} (biotecnologia), seguendo le istruzioni del produttore. Le cellule cresciute in piastre a sei pozzetti sono state trattate con echinacoside 0 μM, 60 μM o 80 μM per 5 ore, 12 ore o 24 ore, lavate due volte in PBS e quindi incubate con JC-1 per 20 minuti. Le immagini sono state riprese utilizzando un microscopio a fluorescenza Olympus.

analisi statistica

L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism. La significatività è stata calcolata utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza e P0.05 è stato considerato statisticamente significativo. I risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard.

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