Parte 1: L'echinacoside protegge dall'apoptosi neuronale indotta da MPP plus tramite il regolamento del percorso ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Contatto:joanna.jia@wecistanche.com

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anche le specie (ROS) contribuiscono al suo sviluppo [3]. Caratteristiche simili al PD possono essere indotte da diverse tossine ambientali, tra cui 1-metil-4-fenil- 1,2,3,{6}}tetraidropiridina (MPTP), cianuro, disolfuro di carbonio, e toluene. L'MPTP è ampiamente utilizzato per indurre modelli animali di PD e il suo metabolita attivo, 1-metil-4- fenilpiridinio ione (MPP?), è utilizzato nei modelli cellulari di PD [4, 5]. MPP? inibisce selettivamente la catena di trasporto degli elettroni e provoca un'eccessiva produzione di ROS, inducendo così la morte neuronale e una sindrome simile al PD [6]. Studi recenti hanno dimostrato che MPP? induce molteplici vie in un modello di PD in vitro, tra cui aumento della fosforilazione di GSK3B (pY206) e accumulo di a-sinucleina [5], sovraregolazione dell'eme ossigenasi-1/ni-nicotinamide adenin dinucleotide fosfato ossidasi/asse ROS [7, 8], aumento dell'espressione del fattore di trascrizione attivo 3 (ATF3) e arresto della crescita tramite la proteina omologa del danno 153 (GADD153)/C/EBP (CHOP) [9]. Nel trattamento clinico, la soppressione dei prodotti ROS è una delle strategie più importanti per la sopravvivenza dei neuroni e il trattamento del PD [1].

Echinacoside(ECH, Fig. 1A), un naturalefeniletanoidetrovato in molte piante medicinali, è un costituente principale delfeniletanoideglicosidiisolato dall'erba tradizionale cinese,Cistanchesalsa [10]. È interessante notare che studi recenti lo hanno dimostratoECHha effetti protettivi in ​​un modello murino di PD indotto da MPTP [10, 11].ECHattenua anche l'apoptosi delle cellule di neuroblastoma indotta dal fattore di necrosi tumorale-a o 6- idrossidopamina in vitro [12, 13]. Tuttavia, i meccanismi con cuiECHpromuove la sopravvivenza dei neuroni nel modello cellulare PD indotto da MPP? rimane poco chiaro.

Lo abbiamo mostratoECHnotevolmente ridotto i prodotti ROS indotti da MPP? nelle cellule SH-SY5Y.ECHha anche inibito l'espressione indotta da MPP? di ATF3, CHOP e a-sinucleina, oltre a sopprimere l'attivazione delle proteine ​​​​pro-apoptosi caspasi-3 e poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP).

Cistancheechinacosidehaneuroprotettivoeffetti

Materiali e metodi

Reagenti

Il terreno essenziale minimo (DMEM) di Dulbecco, il siero bovino fetale, 0.25% di tripsina, 1% di penicillina/streptomicina e il reagente TRIzol provenivano da Life Technologies (Grand Island, NY). Il colorante della cromatina bisbenzimmide (Hoechst 33342), poli-L-lisina, MPP? ioduro e MPTP provenivano da Sigma (St. Louis, MO). Il kit di analisi della perossidazione lipidica malondialdeide (MDA) e il diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) provenivano da Beyotime Biotech (Haimen, Cina). ECH di purezza C98 per cento proveniva da Push Biotechnology (Chengdu, Cina).

Animali e Trattamenti

Il mantenimento e il trattamento degli animali sono stati descritti in precedenza [14]. Abbiamo utilizzato topi maschi C57BL/6 (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, Cina) del peso di 24–26 g a 10 settimane di età. Gli animali sono stati mantenuti in condizioni standard (12:12 h di luce: ciclo di buio, 21 ± 2°C e umidità relativa 40 percento) e hanno consentito l'accesso a cibo e acqua ad libitum. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per l'etica degli animali dell'ospedale Zhongshan, Università di Fudan, ed eseguite in conformità con la Guida per la cura e l'uso del National Institutes of Health Guide for the Care and Use of

Animali da laboratorio.

I topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (10 topi/gruppo): gruppo A, gruppo di controllo del veicolo, dato un volume uguale (500 lL) di soluzione fisiologica (NS); gruppo B, gruppo di controllo ECH, somministrato 20 mg/kg di ECH; gruppo C, gruppo modello MPTP, pretrattato con un uguale volume di NS; e gruppo D, gruppo trattato con ECH, pretrattato con 20 mg/kgECH. ECHè stato disciolto in NS e somministrato per somministrazione intragastrica ogni 24 h per 15 giorni consecutivi. Il modello murino di PD per i gruppi C e D è stato generato da cinque iniezioni intraperitoneali consecutive di 30 mg/kg di MPTP ogni 24 ore dal giorno 11 al giorno 15. I topi sono stati uccisi per dislocazione o perfusione cervicale narcotizzati dal 10% di cloralidrato (3,6 mg/ kg) per via intraperitoneale 24 h dopo il trattamento finale.

La perfusione e l'elaborazione dei tessuti erano come descritto in precedenza [14]. Dopo la perfusione intracardiaca, i campioni di cervello sono stati raccolti e fissati in paraformaldeide al 4% per 24 ore a 4°C, incorporati in paraffina, e sezioni coronali che comprendevano l'intero SNc (coordinate stereotassiche anteroposteriori -3.64-{7}}.92 mm rispetto al bregma) sono stati tagliati a 5 ml.

Altri 5 animali di ciascun gruppo sono stati uccisi dalla lussazione cervicale e il mesencefalo ventrale è stato rapidamente lisato in un tampone di lisi SDS all'1% su ghiaccio. I livelli di proteine ​​CHOP e ATF3 nel lisato sono stati analizzati mediante western blotting.

Cistancheechinacosideha l'effetto di rinvigorire ilrene

Cultura del mesencefalo ventrale di ratto (VM)

Neuroni dopaminergici

Ratti Wistar in gravidanza sono stati acquistati dalla Shanghai Laboratory Animal Co., (Shanghai, Cina). I neuroni DA nella VM sono stati isolati il ​​giorno embrionale 14. La VM è stata sezionata ed elaborata per stabilire colture di neuroni DA VM primarie come descritto in precedenza [15, 16]. In breve, i pezzi di tessuto sono stati raccolti in una soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) ghiacciata e centrifugati a 1000 rpm a 4°C per 5 minuti. Il pellet di tessuto è stato incubato in 750 lL di tripsina-HBSS allo 0,1% per 15 minuti a 37°C con il 5% di CO2. Il siero fetale di vitello (FCS; 750 lL) è stato utilizzato per inattivare la tripsina e i tessuti sono stati dissociati mediante una delicata triturazione

utilizzando una pipetta Pasteur sterilizzata. Le sospensioni cellulari sono state centrifugate a 1000 rpm per 4 minuti a 4°C e risospese in un mezzo di differenziazione (mezzo di Eagle modificato da Dulbecco/F12, 33 mmol/L di D-glucosio, 1% di L-glutammina e 1% di FCS, integrato con il 2% di B27). Le cellule sono state seminate su 24-piastre di coltura tissutale rivestite con poli-D-lisina (Sigma) a 5 9 104 cellule/pozzetto in un mezzo di differenziazione da 500 lL a 37°C con il 5% di CO2 per 10 giorni per svilupparsi in

neuroni DA maturi. I neuroni VM DA sono stati caratterizzati da immunofluorescenza con anticorpo anti-b-tubulina isotipo III e anticorpo tirosina idrossilasi (TH) (Fig. S1). Le cellule sono state trattate con 1 mmol/L MPP?, 40 LG/ml ECH, una combinazione di MPP? e ECH, o solo PBS come controllo. La vitalità cellulare è stata analizzata con il reagente CCK-8 dopo 96 ore di trattamento.

e sono presentati come media ± DS (n {{0}}}; **P \0.01 vs controllo, #P \ 0.05, ##P \0.01 vs MPP ? trattamento). C Immagini al microscopio ottico di cambiamenti morfologici indotti da MPP? o MPP? ed ECH. a, controllo PBS; b, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? e 10 lg/mL di ECH; e, 1 mmol/L MPP? e 20 lg/mL di ECH; f, 1 mmol/L MPP? e 40 lg/mL ECH (barra della scala, 200 lm).

Cistanche echinacoside ha l'effetto di inibire l'apoptosi

Coltura cellulare SH-SY5Y

Le cellule SH-SY5Y provenivano dall'Istituto di biologia cellulare della banca cellulare di Shanghai (Accademia delle scienze cinese, Shanghai, Cina) e coltivate in DMEM integrate con il 10% di siero bovino fetale, 100 U/mL di penicillina e 100 U/mL di streptomicine. Le cellule sono state mantenute in un'incubatrice umidificata a 37°C fornita con il 5% di CO2. MPP? è stato sciolto in acqua sterile e utilizzato immediatamente. ECH è stato sciolto in PBS. Per esplorare l'espressione genica e i livelli proteici correlati ai ROS, le cellule sono state seminate in 6-piastre a pozzetti e coltivate per 24 ore. Le cellule sono state quindi alimentate con mezzo fresco contenente MPP?, ECH, una combinazione di MPP? e ECH, o solo PBS come controllo. Dopo 24 ore di trattamento, le cellule sono state lisate con tampone di lisi SDS all'1% (1% SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris-HCl, pH 6,5) per l'analisi western blot e l'RNA totale è stato isolato direttamente con Reagente TRIzolo.

Per analizzare la distribuzione di ATF3 e CHOP dopo il trattamento, sono stati utilizzati kit di reagenti di estrazione nucleare e citoplasmatica (Thermo Fisher, Waltham, MA) per estrarre frazioni citoplasmatiche e nucleari da cellule trattate con farmaci e di controllo.

Test di vitalità cellulare

Le cellule SH-SY5Y sono state seminate in 96-piastre a pozzetti e incubate per una notte. Le cellule sono state alimentate ogni 24 h con un mezzo fresco completo contenente farmaci diversi e mantenute per 3 giorni. Quindi la vitalità è stata valutata utilizzando il kit contatore di cellule CCK8 (Dojindo, Giappone). I dati sono stati normalizzati ai risultati del controllo PBS e sono presentati come media ± DS. Per analizzare la vitalità in cellule ATF3- knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNA) e cellule di controllo (GFP shRNA), le cellule sono state aggiunte a 96-piastre a pozzetti e coltivate per 14-16 ore. I plasmidi shRNA ATF3 o GFP shRNA sono stati trasfettati in cellule SH-SY5Y usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Le cellule sono state trattate con 1 mmol/L MPP? o un volume uguale di PBS dopo 24 h di trasfezione e sono stati quindi incubati per 3 giorni. I numeri delle cellule sono stati contati ogni giorno. I dati sono presentati come media ± DS.

Costrutti shRNA e oligo primer

pGV298-I costrutti di shRNA di controllo ATF3 (ATF3shRNA) e GFP provenivano da GeneChem Co. (Shanghai, Cina). La sequenza target ATF3 era 50-GCAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 dai metodi descritti in precedenza [17, 18]. Per rilevare l'espressione genica indotta da MPP?, i geni correlati allo stress ROS e associati al PD sono stati selezionati per qRT-PCR e GAPDH è stato utilizzato come controllo. Tutti i primer sono stati sintetizzati da Sangon Biotech Co. (Shanghai, Cina) e le sequenze dei primer sono elencate nella Tabella 1.

PCR in tempo reale

L'RNA totale è stato estratto con il reagente TRIzol secondo le istruzioni del produttore. La trascrizione inversa e la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) sono state eseguite come descritto in precedenza. La reazione di trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando il kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific, Waltham, MA) secondo le istruzioni del produttore. Il kit SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, Cina) è stato utilizzato per qRT-PCR: 20- sono stati utilizzati sistemi di reazione lL con ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). I parametri della PCR comprendevano le seguenti fasi: 95°C per 3 min, 1 ciclo; 95°C per 5 s e 60°C per 40 s, 40 cicli. I dati finali erano nor-

moralizzati a GAPDH e sono presentati come una ratio al controllo. I primer utilizzati per l'amplificazione sono elencati nella Tabella 1.

macchia occidentale

L'analisi Western blot è stata eseguita come precedentemente descritto [19]. Gli anticorpi primari erano anti-caspasi 3 e p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Cina) e anti- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA e anti-istone 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Gli anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano provenivano da Jackson Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). Le membrane PVDF provenivano da EMD Millipore (Billerica, MA) e il substrato ECL proveniva da CWBio (Suzhou, Cina). I livelli di proteine ​​​​relativi basati sui livelli di grigio dell'immagine sono stati analizzati con il software Tanon GIS (Tanon Biotech, Shanghai, Cina) e i dati sono presentati come il rapporto tra la proteina target e GAPDH.

Cistancheechinacosideha l'effetto di proteggere il fegato