Parte 1|L'estratto di Herba Cistanche migliora la generazione di ATP mitocondriale nei cuori di ratto e nelle cellule H9c2

Contatto: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung e Kam Ming Ko

Dipartimento di Biochimica, Università di Scienza e Tecnologia di Hong Kong, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, Cina

Parole chiave: ATP,Cistanche desertiche, cellule H9c2, cuore, mitocondri

Astratto

Per indagare le basi farmacologiche del "Yang: tonificante" azione di Herbal Cistanche [la pianta intera essiccata diCistanche deserticheYC Ma (Orobanchaceae)], nella medicina cinese, gli effetti dell'estratto di metanolo di Herba Cistanche sulla capacità di generazione di ATP mitocondriale sono stati esaminati utilizzando un modello di cuore di ratto ex vivo e un test cellulare H9c2 in situ. Il trattamento con l'estratto di Herba Cistanche ha aumentato la capacità di generazione di ATP mitocondriale miocardico in modo dose-dipendente nei ratti, come valutato mediante misurazione in vitro. La stimolazione della capacità di generazione di ATP è stata associata a un aumento parallelo nel trasporto di elettroni mitocondriali supportato dal piruvato ma non dal succinato. Il trattamento con Herba Cistanche ha anche aumentato le attività del complesso mitocondriale miocardico I e del complesso III, con un'entità della stimolazione sull'attività del complesso I maggiore. Il trattamento con Herba Cistanche ha prodotto un aumento dipendente dalla dose e dal tempo della capacità di generazione di ATP mitocondriale nelle cellule H9c2. I risultati indicano che il trattamento Herba Cistanche puòaumentare la generazione di ATP mitocondrialein cuori di ratto ex vivo e cellule H9c2 in situ, possibilmente attraversopotenziando la fosforilazione ossidativa.

Cistanche può migliorare la funzione cardiaca, abbassare la pressione sanguigna e abbassare i lipidi nel sangue

introduzione

"Rinvigorimento Yang", che incarna il miglioramento generalizzato della funzione corporea nella medicina cinese, implica l'uso dell'energia nel guidare vari processi biochimici.

A questo proposito, l'ATP, che è la valuta universale dell'energia per alimentare la funzione cellulare, viene generato principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa nei mitocondri. Abbiamo postulato che le erbe "rinvigorenti Yang".possedere la capacità di aumentare la capacità di generazione di ATP mitocondriale(Ko et al., 2004). Ciò è supportato dalla nostra recente scoperta che le erbe tonificanti cinesi "rinvigorenti per lo Yang" ma non "che nutrono lo Yin" potrebbero aumentare la capacità di generazione di ATP miocardico nei cuori dei topi ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, la pianta parassita intera essiccata (escluso il fiore) di Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), è classificata come'Yang-rinvigorente' erba tonificante nella medicina tradizionale cinese (Chen, 1998), e appare come l'ingrediente più popolare in un certo numero di formule di brevetti cinesi utilizzate per il rinvigorimento Yang. In Cina e Giappone, Herba Cistanche è ampiamente utilizzata per il trattamento di una serie di sintomi da carenza di Yang. Studi farmacologici hanno indicato che Herba Cistanche potrebbespazzare via i radicali liberi(Xiong et al., 1996),produrre sedativo(Lu, 1998),anti età(Lee et al., 1990),effetti antinocicettivi e antinfiammatori(Lin et al., 2002), emigliorare la funzione immunitaria(Wu et al., 2005). Il principale ingrediente attivo di Herba Cistanche èglicosidi feniletanoidi(Ouyang et al., 2003), che sono stati trovati per avereantibatterico, antistress e antiossidanteproprietà (Xiong et al., 1998), nonché effetti anti-apoptotici sui neuroni in coltura (Tian & Pu, 2005). Nel presente studio, al fine di indagare le basi farmacologiche dell'azione tonificante Yang di Herba Cistanche, sono stati esaminati gli effetti del trattamento Herba Cistanche sulla capacità di generazione di ATP nei mitocondri isolati da cuori di ratto ex vivo e cardiomiociti H9c2 coltivati ​​in situ. Per esplorare il meccanismo biochimico alla base dell'azione di miglioramento della generazione di ATP, sono stati esaminati anche gli effetti del trattamento Herba Cistanche sul trasporto di elettroni mitocondriali e sulle attività complesse I-IV nei cuori di ratto.

Gli ingredienti efficaci di Cistanche possono eliminare vari radicali liberi dell'ossigeno attivo

Materiali e metodi

Sostanze chimiche, colture cellulari e materiali erboristici

ATP, ADP e 3-[4,5-dimetiltiozolo-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT) sono stati acquistati da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). La soluzione di luciferasi (ATPlite) è stata ottenuta da PerkinElmer (Boston, MA, USA). Il mezzo Eagle's modificato (DMEM) e il siero fetale bovino (FBS) di Dulbecco sono stati acquistati da GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA). La linea cellulare H9c2 è stata acquistata da ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche è stata fornita da un commerciante di erbe locale (Lee Hoong Kee). L'erba è stata autenticata dal fornitore e un campione di voucher (HKUSTY00301) è stato depositato presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Scienza e Tecnologia di Hong Kong (HKUST).

Estrazione di erbe

Herba Cistanche (100g) è stata tagliata in piccoli pezzi e quindi estratta mediante riscaldamento a riflusso in 300 mL di metanolo a 65°C per 2 ore. La procedura è stata ripetuta due volte. L'estratto riunito è stato essiccato evaporando il solvente a pressione ridotta e l'estratto metanolo di Herba Cistanche è stato ottenuto con una resa del 39 percento (p/p). L'analisi chimica ha indicato che l'estratto di metanolo di Herba Cistanche conteneva saponine totali, flavonoidi totali, lignani totali e polisaccaridi a concentrazioni rispettivamente di 1,62% (p/p), 0,08%, 0,15% e 75,6%.

Cura degli animali

Ratti Sprague-Dawley maschi adulti (8–10 settimane; 250–300 g) sono stati mantenuti in un ciclo di luce/oscurità di 12-h in una stanza con aria/umidità controllata a circa 22°C e hanno permesso cibo e acqua ad libitum nelle strutture per la cura degli animali a HKUST. I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Research Practice Committee di HKUST.

Trattamento farmacologico

Gli animali sono stati divisi casualmente in gruppi, da cinque a sei animali ciascuno. Nei gruppi di trattamento, ai ratti è stato somministrato per via intragastrica l'estratto di metanolo di Herba Cistanche (sciolto/sospeso in acqua) a dosi giornaliere crescenti ({0}}.031–0,5 g/kg) per 3 giorni. Gli animali di controllo ricevevano solo acqua. Ventiquattro ore dopo l'ultima somministrazione, il cuore è stato ottenuto da animali anestetizzati con fenobarbital e sottoposto ad analisi biochimica.

Preparazione di frazioni mitocondriali e misurazione della capacità di generazione di ATP (ATP-GC) ex vivo

I campioni di tessuto del ventricolo sinistro del cuore sono stati asportati e risciacquati con tampone isotonico ghiacciato (0.32 M saccarosio, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4). Le frazioni mitocondriali cardiache sono state preparate mediante centrifugazione differenziale in tampone isotonico a 4°C. È stato preparato un omogenato cardiaco al 10 percento (p/v) omogeneizzando il tessuto ventricolare tritato con un omogeneizzatore di vetro teflon a 4000 giri/min per 20-30 ictus completi. L'omogeneizzato è stato centrifugato a 600 × g per 10 minuti per rimuovere nuclei e detriti cellulari. Il supernatante è stato quindi centrifugato a 8000 × g per 30 minuti per sedimentare i mitocondri (Evan, 1992). I pellet sono stati risospesi in 1 ml di tampone isotonico e ricostituito le frazioni mitocondriali. L'ATP-GC mitocondriale di animali non trattati è stato misurato con il metodo di Leung et al. (2005)

I polisaccaridi Cistanche possono ritardare la degenerazione fisiologica degli organi e la degenerazione della morfologia cellulare

Misurazione del trasporto di elettroni mitocondriali

La misurazione del trasporto di elettroni nei mitocondri isolati, che si basa sulla riduzione dell'MTT, secondo quanto descritto da Cohen et al. (1997). I mitocondri sono stati preparati a una concentrazione proteica di 1 mg/mL con un tampone di incubazione (saccarosio 250 mM, HEPES 50 mM, KH2PO4 10 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4) . Un'aliquota (40 µl) dei mitocondri è stata miscelata con 100 µl ciascuno di 15 mM di piruvato o 0,5 mM di succinato e 0,42 mg/mL di MTT. La miscela di reazione è stata incubata a 37°C per 10 minuti agitando leggermente. Dopo l'incubazione, la miscela di reazione è stata terminata mediante l'aggiunta di 100 µL di tampone di lisi (10 percento, p/v, sodio dodecil solfato e 45 percento dimetilformammide, regolato a pH 4,7 con acido acetico glaciale). Dopo una sosta di 5 minuti, le letture dell'assorbanza della miscela di reazione sono state effettuate con un lettore di micropiastre (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) e riportate come differenza tra 570 nm e 630 nm. I dati sono stati espressi come percentuale del valore medio del gruppo di controllo (cioè, Herba Cistanche non trattato).

Coltura cellulare

Le cellule H9c2, una linea cellulare permanente derivata da mioblasti cardiaci (Hescheler et al., 1991), sono state coltivate come monostrati in DMEM integrato con il 10 percento (v/v) di FBS. Il terreno conteneva glucosio (4,5 g/l) e glutammina (4,5 mM), integrato con NaHCO3 (17 mM), penicillina (100 IU/mL) e streptomicina (100 µg/mL). Tutte le cellule sono state coltivate in un'atmosfera di 5% (v/v) di CO2 in aria a 37°C. Il mezzo è stato sostituito da un mezzo fresco ogni 2 o 3 giorni. Uno stock di cellule è stato coltivato in un pallone di coltura da 75 cm2 e diviso prima della confluenza con un rapporto di subcoltivazione di 1:10. Per il test ATP-GC, le cellule H9c2 sono state seminate a una densità di 2,5 × 104 cellule/pozzetto in una 24-piastra a pozzetti. Dopo l'adesione cellulare, nel mezzo è stato applicato l'estratto di Herba Cistanche (sciolto in soluzione salina tamponata con fosfato; PBS) e le cellule sono state incubate per periodi di tempo crescenti (2-16 ore). Alle cellule di controllo (non trattate) è stato somministrato solo il PBS.

Misurazione di ATP-GC in situ

Dopo i periodi di incubazione indicati con l'estratto di HerbaCistanche a concentrazioni crescenti (5{{10}}–300µg/mL), è stato eseguito il test ATP-GC. Il mezzo è stato aspirato e le cellule sono state trattate con digitonina (50 µg/mL) in un tampone di incubazione (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5 percento BSA, pH 7,4) per 3 minuti a 37 ◦C. Dopo aver aspirato la digitonina, glutammato (5 mM), malato (5 mM) e ADP (60 µM) sono stati aggiunti alle cellule per la generazione di ATP mitocondriale, che è stata monitorata a intervalli di tempo crescenti compresi tra 0 e 15 minuti. La reazione è stata terminata mediante l'aggiunta di 60 µL di acido perclorico (30 percento, p/v), e le miscele di reazione sono state quindi centrifugate a 600 × g per 10 minuti a 4°C. Un'aliquota (120 µl) del surnatante è stata miscelata con 90 µl di 1,4 M KHCO3 per la neutralizzazione. Le miscele sono state nuovamente centrifugate a 600 × g a 4°C e i surnatanti sono stati misurati per il contenuto di ATP come descritto in precedenza. L'ATP-GC delle cellule non trattate è stato stimato calcolando l'area sotto la curva del grafico (AUC1) tracciando l'ATP generato (proteina nmol/mg) rispetto al tempo (0-15 min) ed espresso in unità arbitrarie. Per le cellule trattate con HerbaCistanche, i valori di AUC1 dei tempi di incubazione crescenti (3, 5, 7, 10 e 15 min) sono stati normalizzati a un rispettivo valore medio di controllo da campioni non trattati ed espressi come controllo percentuale. Quindi, l'area sotto la curva (AUC2) del grafico che traccia i valori di controllo percentuale rispetto al tempo di incubazione (3–15 min) è stata calcolata ed espressa in unità arbitrarie. I dati dei gruppi trattati con Herba Cistanche sono stati espressi come percentuale del controllo dall'equazione:

[AUC2(HerbaCistanche - trattato)/AUC2(non trattato)]×100 percento

Misurazioni della sintasiattività del complesso I–IV e del citrato

Le attività del complesso I-III della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali (ETC) sono state misurate mediante metodi spettrofotometrici utilizzando substrati complessi specifici (NADH per il complesso I, succinato per il complesso II e decilubichinolo per il complesso III) come descritto (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005; Marco et al., 2001). L'attività del complesso IV è stata misurata utilizzando un kit di analisi della citocromo c ossidasi di Sigma. L'attività mitocondriale della citrato sintasi è stata misurata con il metodo di Srere (1969).

Analisi delle proteine

Le concentrazioni proteiche delle frazioni mitocondriali e dei lisati cellulari sono state determinate utilizzando un kit di analisi proteica BioRad utilizzando l'albumina sierica bovina come standard ({{0}}.038–0,600 mg/mL).

analisi statistica

Tutti i dati sono stati espressi come media ± errore standard del tema (SEM). Sono stati analizzati mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Sono stati effettuati confronti multipli post hoc con LSD. Valori P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Risultati

Effetti del trattamento Herba Cistanche sull'ATP-GC miocardicomitocondriale nei ratti

Come mostrato nella Figura 1, il trattamento con l'estratto di Herba Cistanche a dosi fino a 0,5 g/kg ha aumentato l'ATP-GC mitocondriale miocardico in modo dose-dipendente nei ratti, con il grado di stimolazione dell'89% a una dose di 0,5 g/kg.

Effetti del trattamento Herba Cistanche sul trasporto di elettroni mitocondriali nei cuori di ratto

L'entità del trasporto di elettroni nei mitocondri isolati è stata misurata monitorando la riduzione dell'MTT. Il substrato utilizzato per il dosaggio era piruvato o succinato.

Figura 1. L'effetto del trattamento con Herba Cistanche sulla capacità di generazione di ATP mitocondriale nei cuori di ratto ex vivo

Ogni barra rappresenta il tema ± SEM, con n {{0}}. Gli animali sono stati trattati per via orale con HerbaCistanche alle dosi giornaliere indicate per 3 giorni. La capacità di generazione di ATP è stata misurata come descritto in "Materiali e metodi". I dati sono stati espressi in percentuale di controllo rispetto ai valori (AUC2) del rispettivo gruppo di controllo non trattato. ∗Significativamente diverso dal rispettivo gruppo di controllo non trattato; significativamente diverso dal gruppo trattato con Herba Cistanche a 0,5 g/kg.

Figura 2. Effetti del trattamento Herba Cistanche sul trasporto di elettroni mitocondriali nei cuori di ratto

Ogni barra rappresenta la media ± SEM, con n {{0}}. (a) Il trasporto di elettroni mitocondriali supportato da piruvato (b) supportato da succinato è stato misurato mediante riduzione dell'MTT, come descritto in "Materiali e metodi". I dati sono stati espressi nella percentuale di valori di controllo non trattati [supportati da piruvato: OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ 10}}; succinato: maschio, 0,255 ± 0,015, n=5]. ∗Significativamente diverso dal rispettivo gruppo di controllo non trattato; un gruppo significativamente diverso da 0,5 g/kg.

Come mostrato nella Figura 2a, il trattamento con Herba Cistanche ha aumentato in modo dose-dipendente l'entità del trasporto di elettroni mitocondriali supportato dal piruvato nei cuori di ratto, con la stimolazione ottimale osservabile a dosi di 0,5 g/kg. Tuttavia, nei cuori di ratto trattati con Herba Cistanche non sono stati rilevati cambiamenti significativi nell'entità del trasporto di elettroni mitocondriali supportato dal succinato (Fig. 2b).

Per la parte 2,per favore clicca qui.