Parte 1: Identificazione dei neuroni dopaminergici che possono sia stabilire la memoria associativa che terminare in modo acuto la sua espressione comportamentale

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Michael Schleyer,1* Alice Weiglein,1 Juliane Thoener,1 Martin Strauch,2 Volker Hartenstein,3

Melisa Kantar Weigelt,1 Sarah Schuller,1 Timo Saumweber,1 Katharina Eichler,4,5,6 Astrid Rohwedder,4,7 Dorit Merhof,2 Marta Zlatic,5,7 Andreas S. Thum,4,8 e Bertram Gerber1,9 ,10*

1Leibniz Institute for Neurobiology, Department Genetics of Learning andMemoria, 39118 Magdeburg, Germania, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aquisgrana, Germania, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute for Biology, 78464 Konstanz, Germania, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institute of Neurobiology, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, Regno Unito, 8Università di Lipsia, Institute for Biology, 04103 Lipsia, Germania, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Germania, e 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Germania

Una transizione adattativa dall'esplorazione dell'ambiente alla ricerca di risorse vitali allo sfruttamento di queste risorse una volta che la ricerca ha avuto successo è importante per tutti gli animali. Qui studiamo il circuito neuronale che consente alla Drosophila melanogaster larvale di entrambi i sessi di negoziare questa transizione di esplorazione-sfruttamento. Lo facciamo combinando il condizionamento pavloviano con il monitoraggio comportamentale ad alta risoluzione, la manipolazione optogenetica di neuroni identificati individualmente e le analisi dell'organizzazione sinaptica basate sui dati EM. Troviamo che l'attivazione optogenetica del neurone dopaminergico DAN-i1 può entrambi stabilirememoriadurante l'addestramento e terminare in modo acuto il comportamento di ricerca appreso in un successivo test di richiamo. La sua attivazione lascia comunque inalterato il comportamento innato. In particolare, l'attivazione di DAN-i1 può stabilire memorie associative di valenza opposta dopo l'allenamento accoppiato e non accoppiato con l'odore e la sua attivazione durante il test di richiamo può terminare il comportamento di ricerca risultante da una di queste memorie. I nostri risultati suggeriscono inoltre che nel suo significato comportamentale l'attivazione di DAN-i1 assomiglia, ma non è uguale alla ricompensa dello zucchero. Le analisi del dendrogramma di tutte le connessioni sinaptiche tra DAN-i1 e i suoi due bersagli principali, le cellule Kenyon e il neurone di output del corpo del fungo MBON-i1, suggeriscono inoltre che i segnali DAN-i1 durante l'allenamento e durante il test di richiamo potrebbero essere inviati a le cellule Kenyon e a MBON-i1, rispettivamente, all'interno di strutture ramificate precedentemente non riconosciute e confinate localmente. Ciò fornirebbe un elegante motivo di circuito per terminare la ricerca una volta completata con successo.

Parole chiave: dopamina; esplorazione-sfruttamento; corpo di funghi; optogenetica; rinforzo; ricerca

Cistanchepuò migliorare la memoria

Dichiarazione di significato

Nella lotta per la sopravvivenza, gli animali devono esplorare il loro ambiente in cerca di cibo. Una volta trovato il cibo, tuttavia, è adattivo dare la priorità allo sfruttamento rispetto a continuare una ricerca che ora sarebbe inutile come cercare gli occhiali che indossi. Questo compromesso esplorazione-sfruttamento è importante per gli animali e gli esseri umani, nonché per i dispositivi di ricerca tecnica. Indaghiamo quale dei soli 10,{3}} neuroni di una larva di moscerino della frutta può ribaltare l'equilibrio in questo compromesso e identifichiamo un singolo neurone della dopamina chiamato DAN-i1 che può farlo. Date le somiglianze nella funzione del neurone della dopamina nel re animale-

dom, questo può riflettere un principio generale di come la ricerca viene terminata una volta che ha avuto successo.

introduzione

Un animale che esplora il suo ambiente può utilizzare l'esperienza passata per guidare la sua ricerca di cibo. Quando si trova del cibo, tuttavia, è opportuno terminare la ricerca e sfruttare invece la fonte di cibo. Qui studiamo i circuiti che consentono alla Drosophila melanogaster larvale di negoziare questa transizione di esplorazione-sfruttamento. La semplicità numerica del cervello larvale, combinata con l'espressione del transgene cellula-specifica e la conoscenza della sua connettività sinaptica (Pfeiffer et al., 2010; Li et al., 2014; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020), consente di indagare a livello di neuroni identificati individualmente.

Le larve di D. melanogaster associano prontamente gli odori a una ricompensa alimentare (Scherer et al., 2003; Gerber e Hendel, 2006; Schipanski et al., 2008; Rohwedder et al., 2012; Apostolopoulou et al., 2014; Kudow et al. , 2017, 2019). Criticamente, il comportamento appreso basato su queste associazioni odore-cibo cessa se durante un test di richiamo è presente la ricompensa (Fig. 1A). Il comportamento appreso può quindi essere visto come una ricerca, che è terminata in modo adattivo dal risultato cercato (cioè dalla ricompensa) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). Anche il comportamento olfattivo innato non è influenzato (Fig. 1B), suggerendo che tale comportamento innato è organizzato in modo riflesso (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a, b). Pertanto, le ricompense naturali possono indurre due effetti: durante l'allenamento, forniscono un segnale di ricompensa che può essere associato a segnali che successivamente guidano la ricerca della ricompensa; e durante il test di richiamo, possono interrompere acutamente questa ricerca appresa, impedendo agli animali di allontanarsi da una risorsa una volta trovata. Questa transizione riflette quindi un cambiamento nella strategia per ottenere una ricompensa, non un cambiamento nella motivazione (cioè, non una perdita di interesse per la ricompensa).

Invertebrati e invertebrati allo stesso modo, i neuroni dopaminergici (DAN) forniscono segnali di rinforzo per l'apprendimento associativo (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun e Rothenfluh, 2017). In D. melanogaster, insiemi distinti di DAN trasmettono rispettivamente rinforzo appetitivo e avversivo (larve: Schroll et al., 2006; Rohwedder et al., 2016; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; mosche adulte: Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Liu et al., 2012) (uno scenario simile potrebbe anche essere l'emergere di invertebrati: Lammel et al., 2012; Groessl et al., 2018; Menegas et al. al., 2018). Istituendo una struttura compartimentale, questi DAN intersecano le fibre parallele delle cellule Kenyon (KC), i neuroni intrinseci del centro olfattivo di ordine più elevato degli insetti, chiamato corpo del fungo. Rispettando questa stessa struttura compartimentale, i neuroni di output del corpo dei funghi (MBON) raccolgono informazioni attraverso i KC e le inviano verso i circuiti efferenti (vedi Fig. 2A-D) (larve: Selcho et al., 2009; Pauls et al., 2010 ; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; adulti: Sejourne et al., 2011; Places et al., 2013; Aso et al., 2014a,b; Oswald e Waddell , 2015; Takemura et al., 2017). In particolare, una recente ricostruzione al microscopio elettronico ha rivelato che i DAN hanno due obiettivi principali: i KC e gli MBON (vedi Fig. 2B) (larve: Eichler et al., 2017; adulti: Takemura et al., 2017).

Nella larva D. melanogaster, l'attivazione dei DAN dal cluster pPAM può esercitare un effetto gratificante durante l'allenamento (Rohwedder et al., 2016). Dai quattro giorni di questo cluster, due possono conferire individualmente un tale effetto gratificante (DAN-h1 e DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). Qui abbiamo scelto di concentrarci

Figura 1. Lo zucchero può conferire segnali di ricompensa e di terminazione della ricerca. Le larve sono state addestrate in modo tale che un odore fosse presentato sia accoppiato che non accoppiato con lo zucchero. In un successivo test di richiamo, sono stati saggiati per la loro preferenza per l'odore in assenza o in presenza dello zucchero (schizzo verso l'alto). I test in assenza di zucchero hanno rivelato l'olfatto associativomemoria, quantificato come PI positivo. L'espressione comportamentale di questomemoriaè stato terminato in presenza di zucchero. Pertanto, lo zucchero può conferire due tipi di segnali: durante l'addestramento, fornisce un segnale di ricompensa che può essere associato all'odore per guidare gli animali in seguito nella loro ricerca della ricompensa; e durante il test di richiamo, lo zucchero come ricompensa ricercata fornisce un segnale per terminare questa ricerca appresa. Dimensioni del campione: N=29, N =28. B, le larve sono state testate per la preferenza dell'odore innato, in assenza o in presenza di zucchero (schizzo verso l'alto). Lo zucchero non ha influenzato il comportamento olfattivo innato, suggerendo la sua organizzazione simile a un riflesso. Dimensioni del campione: N=20 ciascuna. Lettere diverse sopra i box plot indicano un significato a coppie (test U di Mann–Whitney, p, 0.05, corretto secondo Bonferroni-Holm). *Significato da zero (test del segno di un campione, p, 0,05, corretto secondo Bonferroni-Holm). ns, non significativo. Tutti i test statistici e i relativi risultati vengono riportati insieme ai dati di origine nella figura dei dati estesi 1-1. Per i valori di preferenza dell'odore alla base dei punteggi PI di questo esperimento, vedere la Figura 9A.

Figura 2. Il circuito della matrice DAN-KC-MBON. Il chiasma del lobo mediale. Le informazioni sull'odore vengono elaborate per indurre un approccio innato, così come verso la regione del calice dei KC del corpo del fungo (viola; visualizzato completamente è un esempio KC sul lato destro). Allo stesso modo, le informazioni sulla ricompensa del gusto vengono elaborate per guidare il comportamento innato, nonché tramite neuroni modulatori per lo più aminergici (visualizzato è DAN-i1, turchese/nero) verso i singoli compartimenti dei lobi del corpo del fungo (sul lato sinistro sono indicati i compartimenti). Ciascuno dei quattro compartimenti del lobo mediale (hk) riceve input da un singolo DAN che innerva anche lo stesso compartimento nell'emisfero controlaterale. Gli MBON del lobo mediale attingono da singoli compartimenti, tipicamente di entrambi gli emisferi (visualizzato è MBON-i1, magenta/giallo) e forniscono il loro output, in configurazioni che differiscono tra i compartimenti, attraverso lo spartiacque emisferico. Collettivamente, gli MBON sono responsabilimemoriacomportamento di ricerca basato. I dati si basano su Eichler et al. (2017) e Saumweber et al. (2018). B, La matrice DAN-KC-MBON nel compartimento i. DAN-i1 e la maggior parte dei KC stabiliscono sinapsi chimiche reciproche e sia DAN-i1 che KC forniscono output a MBON-i1. Per semplicità, vengono mostrate in dettaglio solo le sinapsi con i neuroni DAN-i1 e MBON-i1 di sinistra. La stessa connettività si trova nella maggior parte, se non in tutti, gli altri compartimenti (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). C, DAN-i1 (turchese) riceve input dall'esterno del corpo del fungo (grigio scuro) omolaterale al suo corpo cellulare (regione etichettata 1) e quindi innerva il compartimento i in entrambi gli emisferi (etichettato 2 e 3). MBON-i1 (magenta) attraversa due volte la linea mediana; riceve input nello scomparto i di entrambi gli emisferi e fornisce output nelle regioni adiacenti al corpo del fungo di entrambi gli emisferi. D, come in C, ma in una vista leggermente inclinata, che mostra le ricostruzioni dello scheletro dei neuroni DAN-i1 e MBON-i1 di sinistra e un esempio KC (nero). I dati si basano su Eichler et al. (2017). E, Dendrogramma del neurone DAN-i1 sinistro. I punti colorati rappresentano le sinapsi di output da DAN-i1. I triangoli rappresentano le sinapsi di input per DAN-i1. I colori rappresentano il neurone partner della rispettiva sinapsi. Tutte le altre sinapsi all'interno del corpo del fungo sono etichettate come "Altro". Non vengono visualizzate le sinapsi che DAN-i1 forma con i neuroni al di fuori del corpo del fungo, in particolare nella regione 1 (Eschbach et al., 2020). Le linee punteggiate indicano le regioni in cui il neurone attraversa la linea mediana del cervello. F, come in E, ma per il neurone MBON-i1 sinistro. Non vengono visualizzate le sinapsi che MBON-i1 forma con i neuroni al di fuori del corpo del fungo. Per le versioni ad alta risoluzione dei neuroni DAN-i1 e MBON-i1 di entrambi gli emisferi, nonché di tutti i KC maturi, vedere rispettivamente le figure dei dati estesi 2-1, 2-2 e 2-3 .

su DAN-i1 perché è stato precedentemente analizzato in modo più dettagliato (Saumweber et al., 2018) e perché produce un effetto gratificante più robusto rispetto a DAN-h1 (Saumweber et al., 2018; dati non pubblicati). Per prima cosa forniamo un resoconto dettagliato della disposizione spaziale di tutte le sinapsi tra DAN-i1 e entrambi i suoi principali partner di output, MBON-i1 e KC. Quindi, chiediamo se l'attivazione optogenetica di DAN-i1 può mediare non solo un segnale di ricompensa durante l'allenamento, ma anche un segnale per terminare acutamente l'apprendimento per cercare la ricompensa durante il test di richiamo.

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Materiali e metodi

Modello sperimentale e dettagli sull'argomento. Sono state utilizzate larve di terzo stadio di alimentazione di entrambi i sessi (D. melanogaster), di età compresa tra 5 giorni dopo la deposizione delle uova. Le mosche sono state mantenute su terreno standard, nella coltura di massa a 25 gradi, 60 percento -70 percento di umidità relativa e un ciclo luce/buio di 12/12 h. Abbiamo preso un cucchiaio di mezzo alimentare da una fiala di cibo, abbiamo selezionato casualmente il numero desiderato di larve, le abbiamo sciacquate brevemente in acqua di rubinetto e abbiamo iniziato l'esperimento.

Abbiamo usato larve transgeniche per esprimere il canale ionico ChR2-XXL light-gated nei DAN. A tal fine, il ceppo effettore UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (gentilmente fornito da R. Kittel, Università di Lipsia), è stato incrociato con uno dei due ceppi driver: 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer et al., 2008; Liu et al., 2012; Rohwedder et al., 2016) (Bloomington Stock Center n. 41347) o il ceppo driver split-Gal4 SS00864 (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018) per ottenere una discendenza doppia eterozigote. Un conducente controlla che i ceppi del conducente siano stati incrociati con una copia locale di w1118 (Bloomington Stock Center n. 3605, n. 5905, n. 6326). Poiché l'effettore controlla un ceppo che trasporta i siti di atterraggio utilizzati per Gal4 (attP2) o split-Gal4 (attP40/attP2), ma senza un dominio Gal4 inserito ("vuoto") (Pfeiffer et al., 2010), è stato incrociato con UAS- ChR2-XXL. Abbiamo confermato il pattern di espressione di58E02 e SS00864 incrociandoli con pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer et al., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Poiché ChR2-XXL è abbastanza sensibile da essere attivato dalla luce del giorno (non mostrato), le mosche sono state allevate in fiale costantemente oscurate da un involucro di cartone nero. Per l'esperimento presentato nella Figura 8E, UAS-ChR2 (Schroll et al., 2006) è stato incrociato con 58E02-Gal4.

Setup sperimentale. Per esperimenti comportamentali, le larve sono state addestrate in piastre di Petri di 9 cm di diametro interno e testate in piastre di Petri di 9 o 15 cm di diametro interno (entrambe di Sarstedt) come menzionato nelle legende delle figure, in tutti i casi riempite con l'1% di agarosio (grado di elettroforesi ; Roth). Come l'odore, abbiamo usato acetato di n-amile diluito 1:20 in olio di paraffina (AM; CAS: 628-63-7; Merck) e in alcuni casi in aggiunta 1-ottanolo non diluito (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).

Gli esperimenti sono stati condotti all'interno di una scatola circostante di 43 43 73cm dotata di un tavolo luminoso su misura dotato di un array di LED 24 12 (470 nm; Solarox) e una lastra di diffusione di 6- mm di spessore in plexiglas satinato in alto per garantire una luce blu uniforme per l'attivazione di ChR2-XXL (120 mW/cm2). Le piastre Petri sono state poste direttamente sopra la piastra di diffusione. Le piastre di Petri erano circondate da un anello di diffusione in polietilene; dietro l'anello di diffusione, sono stati montati 30 LED a infrarossi (850 nm; Solarox) per fornire un'illuminazione invisibile alle larve, ma che ha consentito la registrazione e il monitoraggio del loro comportamento per l'analisi offline. A tal fine è stata posizionata sopra la capsula di Petri una telecamera (Basler acA204090umNIR; Basler) dotata di filtro passa-infrarossi. Per ulteriori dettagli sulla configurazione sperimentale, vedere Saumweber et al. (2018).

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Apprendimento associativo odore-zucchero. Gli esperimenti di apprendimento hanno seguito protocolli stabiliti (Michels et al., 2017). I contenitori per gli odori sono stati preparati aggiungendo 10 ml di sostanza per gli odori a contenitori in teflon personalizzati (diametro interno di 5 mm con un coperchio perforato con 7 fori di 0,5 mm di diametro ciascuno). Le piastre Petri sono state ricoperte con coperchi modificati perforati al centro da 15 fori di 1 mm di diametro ciascuno per migliorare l'aerazione.

Per l'addestramento dell'odore-zucchero, 20 larve sono state poste al centro di una capsula di Petri piena di agarosio che conteneva 2mol/L di D-fruttosio (CAS: 57-48-7; Roth) come ricompensa (1) e dotata di due odori contenitori sui lati opposti, entrambi riempiti con AM (AM1). Dopo 2,5 minuti, le larve sono state spostate su una capsula Petri fresca con agarosio semplice e insapore, dotata di due contenitori vuoti (EM), dove hanno trascorso anche 2,5 minuti. Sono stati eseguiti tre di questi cicli di allenamento "accoppiati", in ogni caso utilizzando piastre Petri fresche. Nella metà dei casi, l'allenamento è iniziato con piastre Petri contenenti ricompensa come indicato (AM1/EM), mentre nell'altra metà dei casi la sequenza è stata invertita (EM/AM1). Per ogni coorte di larve addestrate AM1/EM (o EM/AM1), una seconda coorte è stata addestrata reciprocamente, cioè da presentazioni "spaiate" di odore e ricompensa (AM/EM1 o EM1/AM, rispettivamente).

Dopo l'addestramento, le larve sono state trasferite al centro di una capsula Petri di prova e testate per la loro preferenza di odore. È importante sottolineare che il test di richiamo è stato condotto su una semplice capsula di Petri per la valutazionememoria-comportamento di ricerca basato o su una capsula Petri contenente una ricompensa per determinare se la presenza della ricompensa ha interrotto ilmemoriaricerca basata. In entrambi i casi, un lato della capsula Petri di prova era dotato di un contenitore AM e l'altro lato di un contenitore EM. Il numero di larve su entrambi i lati è stato determinato dall'immagine della telecamera a 3 minuti dall'inizio del test. Da questi numeri, una preferenza di odore è stata calcolata come segue:

Pertanto, i valori PI possono variare da 1 a 1, con valori positivi che indicano che le larve preferivano l'odore più dopo l'allenamento accoppiato che non accoppiato. I valori PI positivi indicano di conseguenza un associativo appetitosomemoriache è meglio interpretato comememoriacomportamento di ricerca basato. I valori PI negativi, al contrario, indicano associativo avversivomemoria.

Apprendimento associativo mediante attivazione optogenetica del DAN. Per gli esperimenti optogenetici, l'addestramento e il test sono stati eseguiti in modo analogo. Tuttavia, tutte le piastre Petri erano riempite con semplice agarose (cioè, non venivano usati sapori gratificanti). Invece, per l'allenamento accoppiato, AM è stato accoppiato con una stimolazione continua della luce blu per attivare 58E02-DAN o 864- DAN per 2,5 minuti, seguiti da 2,5 minuti di oscurità senza odore (AM1/EM). Per l'allenamento non accoppiato, la presentazione degli odori e la stimolazione della luce si sono verificate separatamente (AM/EM1). Per l'esperimento presentato nella Figura 8E, l'odore e la luce sono stati presentati per 5 minuti ciascuno; quell'esperimento seguiva altrimenti le procedure descritte da Rohwedder et al. (2016).

Dopo tre di questi cicli di addestramento, è stato condotto il test di richiamo e sono stati calcolati la preferenza dell'odore e il PI come descritto. Fondamentalmente, il test di richiamo è stato condotto senza l'attivazione della luce blu per determinare se i DAN mediano un segnale di ricompensa durante l'allenamento o con l'attivazione della luce blu per determinare se, inoltre, i DAN possono mediare un segnale per terminare la ricerca.

Le variazioni di questo protocollo sono indicate nelle legende delle figure.

Comportamento olfattivo innato. I contenitori degli odori e le piastre Petri sono stati preparati come descritto sopra. Coorti di 20 larve sono state raccolte dalla fiala, lavate brevemente in acqua di rubinetto e poste su una capsula Petri con un contenitore AM su un lato e un contenitore vuoto sull'altro lato. Dopo 3 minuti, la preferenza innata dell'odore è stata determinata secondo l'equazione 1. Questo test di preferenza è stato condotto in assenza o in presenza di zucchero, oppure in assenza o in presenza di attivazione della luce blu, per determinare se queste condizioni del test alterano comportamento olfattivo innato.

Analisi delle modulazioni comportamentali dopo l'allenamento con 864-attivazione DAN. Il comportamento larvale è stato filmato e analizzato come descritto in dettaglio da Paisios et al. (2017). In breve, sono stati analizzati due aspetti della chemiotassi larvale. Innanzitutto, la modulazione della castrazione cranica (HC al secondo) (HC/s) è stata calcolata come segue:

In questa misura, l'angolo di rotta (HA) descrive l'orientamento della testa dell'animale rispetto all'odore, con angoli di rotta assoluti (abs (HA)) di 0 gradi o 180 gradi, ad esempio, indicando che l'odore è rispettivamente nella parte anteriore o posteriore delle larve. Questa misura fornisce quindi punteggi positivi per l'attrazione (cioè, quando l'HC dirige le larve verso piuttosto che lontano dal bersaglio dell'odore), mentre produce punteggi negativi per l'avversione.

Immunoistochimica. I cervelli larvali sono stati sezionati in soluzione salina libera di Ca{{0}} e fissati nella soluzione di Bouin diluita 1:2 con soluzione salina libera di Ca21- per 7 minuti. Tre fasi di lavaggio (ogni 10 minuti) in PBST (0,3 percento Triton-X 100 in PBS) sono state seguite da incubazione con gli anticorpi primari per una notte a 4 gradi. Dopo tre lavaggi (ogni 10 minuti) in PBS, il tessuto è stato incubato con gli anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo tre fasi di lavaggio finali in PBS (ogni 10 minuti), i campioni sono stati montati in Vectashield (Vector Laboratories). I preparati sono stati esaminati al microscopio confocale DM 6000 CS (Leica Microsystems).

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Come anticorpi, abbiamo utilizzato l'anticorpo monoclonale di topo anti-FASII (DSHB, diluito 1:50 in una soluzione bloccante contenente il 4% di siero di capra normale) e l'anticorpo di coniglio anti-GFP (A11122, Invitrogen, diluito 1:1{ {28}}00 in soluzione bloccante contenente il 4% di siero di capra normale) come anticorpi primari e anticorpi anti-topo Cy3 (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) e anti-coniglio Alexa-488 anticorpo (A11034, Invitrogen), entrambi diluiti 1:200 in PBS, come anticorpi secondari; oppure abbiamo utilizzato l'anticorpo murino monoclonale anti-ChR2 (ProGen Biotechnik) diluito 1:100 in PBST allo 0,3% come anticorpo primario, l'anticorpo anti-topo Cy3 (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), diluito 1:300 in PBST allo 0,3% , come anticorpo secondario, e Alexa-488 anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), diluito 1:300 in PBST allo 0,3%, per la colorazione di contrasto.